Bir şekil analizi algoritması, fenotiplerin yeni nicelenmesi için 2D'den 3B hücre kültürüne uzamsal morfolojisini ve bağlamını niceliklendirir

Özet

Bu makale, hücrelerde ve organoidlerdeki yeni morfolojik özelliklerin, geleneksel metriklerin (alan, hacim ve yüzey alanı) gibi özellikleri yakalayamayan bir uzamsal algoritma olan lineerize sıkıştırılmış kutup koordinatları (LCPC) dönüşümü kullanılarak nasıl nicelendirilebileceğini açıklar. Şekil yöneltmesi ve hizalama için en iyi uygulamalar tartışılır.

Özet

Birçok çalışma, bir hücrenin veya organoidin morfolojik fenotipinin kanser karşıtı ajanlara karşı duyarlılığıyla ilişkili olduğunu göstermiştir. Ancak, fenotipi ölçme yöntemleri alan, hacm, çevre ve sinyal yoğunluğu gibi mekansal metriklere dayanır; bunlar çalışır ancak sınırlıdır. Bu yaklaşımlar, sol ve sağ elliliğin bir özelliği olan kiralite gibi mekansal bağlamın birçok kritik özelliğini ölçemez. Sol ve sağ ayakkabılar aynı hacme sahip olduğu için kiraliteyi kaydetmek için hacim kullanılamaz. Kiralite, yerçekimi yönü ve polarite ekseni şeklinde mekansal bağlam insanlar için sezgisel olsa da, hücre biyologları, patologları, radyologlar ve makine öğrenimi uygulayıcıları tarafından bugüne kadar kullanılan geleneksel metrikler bu temel kavramları yakalayamıyor. Doğrusal sıkıştırılmış kutup koordinatları (LCPC) dönüşümü, diğer hiçbir metrikten farklı olarak mekansal bağlamı yakalayabilen yeni bir algoritmadır. LCPC dönüşümü, kontur ile ızgara çizgileri arasındaki kesişim noktalarını takip eden bir ızgara sistemini üste bindirerek iki boyutlu (2D) bir konturu ayrık sinüzoidal dalgaya dönüştürür. Konturu, bağımsız koordinat (x-koordinat) ise 2B uzaydaki ardışık konumlara karşılık gelen ayrık koordinat çiftlerinden oluşan bir diziye dönüştürür. Her bağımlı koordinat (y-koordinat), kontur ve ızgara çizgisinin kesişimi arasındaki mesafeden izgara sisteminin orijin veya baz çizgisine kadar olan mesafeyi içerir. Diskret sinüzoid dalgası biçiminde, Hızlı Fourier Dönüşümü verilere uygulanır. Bu şekilde, 2D ve 3D hücre kültüründeki hücrelerin şekilleri sistematik ve çok boyutlu olarak temsil edilir; bu da tedaviye dirençle ilgili içgörüler ortaya çıkaracak sağlam nicel stratifikasyonu mümkün kılar.

Giriş

Üç boyutlu (3D) organoid kültür, in vivo biyoloji ^1,2'yi taklit ederek iki boyutlu (2D) hücre kültürüne göre üstün olduğu kanıtlanmıştır. Organoidler, etkili tedaviler için tarama ve hastalık ilerlemesi hakkında bilgi kazanmak için kanser araştırmalarında vazgeçilmez ^{hale gelmiştir} 3,4,5,6. Kanser biyolojisinde morfolojideki ayrımların hücrelerin ve dokuların belirgin biyolojik davranışlarıyla ilişkili olduğu iyi bilinse de, alan sınırlı kapsama sahip geleneksel şekil metriklerine dayanır. Bu çalışma, alan, hacim ve yüzey alanı gibi geleneksel yaklaşımları aşarak eşi benzeri görülmemiş bir hassasiyetle ince morfolojik özellikleri nesnel olarak niceleyen yeni bir uzamsal algoritmayı tanımlar.

Doğrusal sıkıştırılmış kutup koordinatları (LCPC) dönüşümü, doku histopatolojisinde gözlemlenen karmaşık morfolojileri objektif ve nicel olarak tanımlamak için icat edilmiştir ve kolon^{poliplerinin derecelendirmesini artırmayı amaçlamaktadır 7}. Bu yaklaşımı bipolar bozukluk ve Alzheimer hastalığı gibi beyin patolojilerinde makroskobik MR tabanlı mekansal özellikleri yakalamak için genişletme arzusu, bu yaklaşımı daha da güçlendiren iyileştirmelere yol açtı. Bu çalışma, LCPC dönüşümünün iki versiyonunun adım adım uygulanmasını ve en iyi uygulamalarını açıklar; paralel ızgara sistemi ve radyal ızgara sistemi; her ikisi de açık kaynak betikleri ve eğitim videolarına sahiptir.

Geleneksel geometrik yöntemlerin yanı sıra, hücrelerin ve organların karmaşık şekillerini ölçmek için etkili olan birçok soyutlama da mevcuttur. Bunlar arasında eksantriklik, eğrilik, kontrast ve kurtoz ölçümü ile dairesellik, asimetri, kenar düzensizliği ve küresel kontur^{yapısı 8,9,10} yakalamak için Zernike anları yer alır. Fraktal analiz, karmaşık konturları skaler değerlere indirgemek için de faydalı olmuştur; örneğin Fraktal Boyut, konturun ne kadar düzensiz olduğunu ölçür ve boşluklar, konturda heterojen düzensiz^{boşlukların nasıl göründüğünü ölçer; 11,12}. Doku ölçümü için Gri Seviye Birlikte Oluş Matrisi (GLCM) yöntemi, kontrast, enerji, homojenlik, korelasyon ve entropi^13,14 ölçümlerinde popülerdir. Tüm bu yöntemler faydalı olsa da, hiçbiri yerçekimi yönü, sol ve sağ elini veya şekil değişimini etkileyen merkezi destek yapısının konumu gibi mekansal bağlamı yakalamak için tasarlanmamıştır. Ayrıca, birçoğu mekânsal bilgiyi temsil etmek için tek bir skaler değer veya sadece birkaç skaler değer üretir; bu nedenle alıntılanan çalışmalar genellikle karmaşık şekilleri değerlendirmek için bunları birlikte kullanır.

LCPC dönüşümü, tek bir ölçümden birçok özellik üretecek ve şekle mekansal bağlamı kodlayan yerçekim yönü gibi mekansal işaretleyicilerin eklenmesine olanak tanıyacak şekilde tasarlandı. LCPC^{dönüşümü 7'ye} en yakın yöntem,^15'ten bir yıl sonra yayımlandı ve aynı temel fikri paylaşan başlangıç noktası olarak paylaşıldı: Fourier dönüşümünü hücre konturlarına uygulayarak şekli frekans spektrumu şeklinde ölçmek. Ancak, LCPC dönüşümü, ölçülen şeklin dışındaki mekansal bağlam bilgisiyle birlikte kullanılmak üzere tasarlanmış farklı ızgara sistemleri aracılığıyla bağımsız olarak geliştirilmiştir. Ayrıca, LCPC dönüşümünün mucidi bu el yazmasında ortaya çıkan frekans spektrumunun büyük miktarda gizli mekansal bilgi içerdiğini açıklar. Ek Dosya 1, kaynak gösterilen yöntemler kullanılırken sıklıkla göz ardı edilen biyolojiye uzamsal bağlamlar ve LCPC dönüşümünün bu bağlamı yakalamak için nasıl uygulanabileceği üzerine kapsamlı bir tartışma içerir. Şekil verileri kontrol ve deneysel gruplar arasında fark göstermeyen, gözlerinin şekillerde fark görüp görmediği ya da şekil verileri çok az fark gösteren okuyucular için, daha büyük bir fark olması gerektiğini düşünseler bile, LCPC dönüşümünü denemeleri gerekir.

LCPC dönüşümü, şekilleri birden fazla boyutta temsil ettiği için mekânsal bilginin ölçülmesinde eşi benzeri görülmemiş bir hassasiyet sağlar. Alan ve hacim gibi geleneksel yöntemlerin aksine, her şekil için yalnızca bir skaler değer verir (yani 25 cm²), LCPC dönüşümünün sonuçları birden fazla indeks verebilir ve her biri şeklin farklı morfolojik yönleriyle (örneğin, köşelerin yuvarlaklığı ve keskinliği, kenarların pürüzsüzlüğü vs. keskinliği) ilişkilidir. LCPC dönüşümü, konturunu kesişen düz çizgilerden oluşan bir ızgara üzerine bindirerek 2D bir şekli tanımlar. Her ızgara sisteminin doğrusal mesafeyi ölçmek için bir orijin (Şekil 1) veya bir temel çizgisi (Şekil 2) vardır. Algoritmayı tanımlayan basitleştirilmiş akış şemaları için Şekil 1B ve 2B'ye bakınız. Şebekâr çizgileri ile şeklin konturu arasındaki her kesişim noktası tespit edilir. Her kesişimin mesafesi daha sonra bir baz çizgisine veya başlangıç çizgisine göre hesaplanır. Bu şekilde, LCPC dönüşümü 2B şekilleri ardışık x-y koordinat çiftlerine dönüştürür. x-koordinatı ızgara çizgisinin sıfırdan sonsuza konumunu gösterirken, y-koordinatı kesişimin temel çizgiye veya orijina olan mesafesini temsil eder. Bu formda, yani ayrık bir sinüzoid dalga olan bu şekilde, Hızlı Fourier dönüşümü (FFT) uygulanarak veri "konum alanından" frekans alanına dönüştürülür. Eğer x-koordinatı zamanı temsil ediyorsa, "konum alanı" FFT'nin standart uygulamalarında "zaman alanı" ile eşdeğer olurdu.

Radyal ızgara sistemi, radyal ızgaranın başlangıcından her kesişimin mesafesini ölçerken, paralel ızgara sistemi her zaman kesişim mesafesini şeklin solundaki hayali bir çizgiye referans olarak ölçer (Şekil 2A). Açık kaynak betik, bu hayali çizginin konumunu konturun en soldaki pikselini bulup ardından bu konumun 10 pikselini sola hareket ettirerek belirler. Burada, bu konumun x-koordinatı tüm kesişimlerin hesaplandığı referans çizgisi olur. Bu 10 piksel kuralı keyfidir, ancak bu yüzden paralel ızgara sistemi için açık kaynak betikiyle analiz edilen tüm konturların dört tarafında en az 15 piksel beyaz alan olması gerekir.

Katlı veya birden fazla katmanlı 2B şekillerde, ızgara çizgileri konturu birden fazla kez kesişebilir. Bu durumda, bir ızgara çizgisi boyunca tüm kesişimlerin mesafeleri tek bir değere toplanır. Bu nedenle, her ızgara çizgisinin yalnızca bir x koordinatı ve bir y-koordinatı vardır. Bu özet, LCPC dönüşümü adında "sıkıştırılmış" terimiyle temsil edilir. Doğrusal olmayan bir 2B şeklin ayrık sinüzoid dalgaya dönüştürülmesi, algoritmanın adında "linearized" terimiyle temsil edilir. Son olarak, algoritmanın adında "kutup koordinatları" terimi yer alır çünkü ilk kavramsallaştırılan ızgara sistemi, kutup^{koordinatları 7'den} oluşan 180 derecelik radyal bir ızgaradır. Polar ve Kartezyen koordinatların birbirinin yerine geçebileceği fark edildikten sonra bile, algoritmanın adı olduğu gibi kaldı. Teşekkürler bölümü, LCPC dönüşümünün icat edilmesini ve geliştirilmesini motive eden kişisel nedenleri açıklar.

Protokol 1, Şekil 3B'de gösterilen verilerin elde edilmesi için kullanılan dizidirken, Protokol 2 ise Şekil 3C–D'de gösterilen verilerin elde edilmesi için kullanılan dizidir. Bu protokollerdeki adımlar, GitHub deposunda bulunan "Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform"^16'da bulunan bireysel Python betiklerinde uygulanmıştır. Protokol 1, LCPC dönüşümü için "saf şekil" türetilmesi için yapılan ön işlem adımlarına bir örnektir. Protokol 2, şekilleri "ölçekte" ölçmek için ön işleme adımlarına örnektir; yani birbirlerine göre orijinal ölçeklerinde.

Segmentasyon, Mac'in Preview veya Microsoft'un Paint gibi görüntü işleme yazılımlarında manuel olarak veya eşik tabanlı yöntemlerle yapılabilir. Manuel olarak yapılırsa, aşağıdaki dört renkten biri seçilmelidir: mavi, yeşil, pembe/magenta veya kırmızı. "Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform"¹⁶ adlı GitHub deposunda "color extraction scripts" adlı bir klasör bulunur. Bu klasörde, bahsedilen dört rengi çıkaran ve beyaz zeminde mavi maskelere dönüştüren dört Jupyter Notebook dosyası içerir. Bu işlem, Fiji/ImageJ gibi bir görüntü işleme yazılımında kontur renginin eşik olarak belirlenmesiyle de gerçekleştirilebilir. Sınırları birbirine değen veya üst üste binen kenarları olan konturlar içeren görüntüler için (örneğin, Venn diyagramı), görüntü işleme yazılımı kullanılarak ayrılmaları gerekir; böylece birden fazla organoid kontur içeren bileşik maske görüntüsünde bağımsız nesneler haline gelirler. Bu, sadece bir organoid veya birbirine dokunmayan birden fazla organoid içeren görüntüler için geçerli değildir.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan birincil insan hücreleri, etik onaylar ve bilgilendirilmiş onay prosedürleri kapsamında alınmış ve kültürlenmiştir; daha önce^{bildirilen 17}. Burada sunulan görüntüler, onaylanmış hücre kültürlerinden oluşturulmuş ve ilk kez yayımlanmıştır. Doku örnekleri, daha önce tanımlandığı gibi, dokularının araştırma kullanımı için bilgilendirilmiş onay veren hastalardan Brigham and Women's Hastanesi ve Kaliforniya Üniversitesi, San Francisco'da Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) onaylı protokoller kapsamında^{toplanmıştır 17}. Bu çalışma için ek insan örneği toplama yapılmadı.

1. LCPC dönüşümü için 2D organoid konturların saf şeklinin çıkarılması

1. Microsoft'un Paint, MacOS'un Önizlemesi veya Fiji/ImageJ gibi herhangi bir görüntü işleme yazılımı kullanarak her organoidin dış kenarını segmentlere ayırın.
2. Organoidlerin konturlarını, beyaz zemin üzerinde mavi çizgiler şeklinde açık maskeler olarak çıkarın.
3. Her mavi konturu kendi beyaz tuvale izole edin.
   NOT: Bu adım yalnızca bir görüntünün birden fazla kontur içermesi durumunda gereklidir.
4. Her konturu kırpın, mavi nesnenin dört tarafında bir piksellik bir kenar bırakın.
5. Yeni kenarlar oluşturmak için dört tarafın her birine 100 piksel beyaz alan ekleyin.
6. Nesneleri en uzun iç uzunluk yatay olacak şekilde döndürün.
   NOT: Bu adım, her nesne içindeki en uzun iç çizgiyi nesnenin genişliğine dönüştürür. Bu amaçla iki senaryo mevcuttur. Kapalı şekiller için, "Döndür KAPALI KAPALI Nesneyi Yatay En Uzun İç Length_v2.ipynb" adlı Jupyter Defteri kullanın. Açık şekiller veya birden fazla bileşenli şekiller için, "Rotate Green Line_v3.ipynb" adlı Jupyter Notebook'u kullanın. Rotate Green Line aracı, .ipynb dosyasıyla aynı klasörde bulunan ReadMe dosyasında bağlantılı bir video eğitimi sunuyor.
7. Her görüntüyü, mavi nesnenin dört tarafında bir piksel kenarı olacak şekilde kırpın.
   NOT: Bu, Adım 1.4 ile aynı. Ancak bu kez kesmenin amacı, sonraki boyut değiştirme adımının sadece içindeki mavi nesneyi değil, tüm tuvali boyutlandırmasıdır. Bu nedenle, mavi nesneyi tuvalin kendisiyle neredeyse aynı genişlik ve yüksekliğe getirerek, tuvalin boyutunu 400 piksel genişliğine düşürürken, nesneyi neredeyse 400 piksel genişliğine kadar yeniden boyutlandırır. "Trim margin to 1-pixel border.ipynb" adlı bir Jupyter Notebook var.
8. Her görselin tuval genişliğini 400 piksel genişliğine dönüştürürken en-boy oranını da kısıtlayabilirsiniz.
   NOT: Bu adım, her nesnenin aynı genişliğe sahip olmasını sağlar. Boy oranını sınırlamak, boyutlandırma sırasında nesneyin eğilmesini önler. "Genişliği 400 piksele yeniden boyutlandır ama en-boy oranını kısıtla.ipynb" adlı bir Jupyter Notebook var.
9. Yeni kenarlar oluşturmak için dört tarafın her birine 100 piksel beyaz alan ekleyin.
10. Her görüntüyü 90 derece saat yönünde veya saat yönünün tersine döndürerek en uzun iç uzunluk dikey olur ve tüm görüntüler için seçimle tutarlıdır.
    NOT: Yukarıdaki dizide, saf şekil 1.6, 1.7, 1.8 ve 1.9. adımların ardışık uygulanmasıyla elde edilir. Step 1.9'da kenar alanı eklemek, LCPC dönüşüm betiklerinde yapılacak hataları önlemek için gereklidir, ancak saf şeklin çıkarılmasında bu hatalar yer almaya gerek değildir. Şekilleri "ölçekte" ölçmek isteyen kullanıcılar, yukarıdaki dizide 1.6, 1.7 ve 1.8. adımları gerçekleştirmek zorunda değildir, ancak LCPC dönüşümünü uygulamadan önce en iyi yönelime ulaşmak için maske görüntülerini önceden işlemeleri gerekir.
11. Her konturda LCPC dönüşümünü gerçekleştirin. Radyal ızgara^{yöntemi 18} veya paralel ızgara^{yöntemi 19} için sağlanan Python betiklerini kullanın.

2. LCPC dönüşümü için 2D organoid konturlarının ölçekli şeklinin çıkarılması

NOT: Nesnelerin ölçekli şeklini adım adım çıkarma yöntemi, yukarıdaki Protokol 1'deki saf şekil çıkarma yöntemine benzer. Adımlar, eşleştirmeyi kolaylaştırmak için her iki protokolde de aynı şekilde adlandırılmıştır. Her adım için lütfen Protokol 1'deki notlara bakınız. Saf şekil ile ölçekli şekil arasındaki temel fark, ölçekli şekilin boyutlandırma adımları olan 1.6, 1.7 ve 1.8 adımlarını gerektirmemesidir.

1. Her organoidin dış kenarını segment edin. Hesaplamalı bir yaklaşım kullanın veya bunu Microsoft'un Paint, MacOS'un Önizlemesi veya Fiji/ImageJ gibi temel bir görüntü düzenleme yazılımı aracılığıyla manuel olarak yapın.
2. Organoidlerin konturlarını, beyaz bir tuval üzerinde mavi çizgiler şeklinde açık maskeler olarak çıkarın. Maskeleri çıkarmak için Fiji/ImageJ veya sağlanan Python betikini^{kullanın 16}.
3. Her mavi konturu kendi beyaz tuvale izole edin. Maskeleri çıkarmak için Fiji/ImageJ veya sağlanan Python betikini^{kullanın 16}.
4. Her konturu kırpın, mavi nesnenin dört tarafında bir piksellik bir kenar bırakın. Fiji/ImageJ veya Python scripti¹⁶ ile sağlanmıştır.
5. Yeni kenarlar oluşturmak için dört tarafın her birine 100 piksel beyaz alan ekleyin. Fiji/ImageJ veya Python scripti¹⁶ ile sağlanmıştır.
6. Her konturu en uzun iç çizgisi dikey olacak şekilde döndürün. Fiji/ImageJ veya Python scripti¹⁶ ile sağlanmıştır.
7. Her konturda LCPC dönüşümünü gerçekleştirin. Radyal ızgara^{yöntemi 18} veya paralel ızgara^{yöntemi 19} için sağlanan Python betiklerini kullanın.

Sonuçlar

Meme kanseri organoidlerine uygulanan radyal ızgara LCPC dönüşümü

3D organoidler ve tümörler, geleneksel metrikler istatistiksel olarak önemsiz farklar verse de, bazıları insan gözünden açıkça farklı olan çeşitli şekiller alabilir. Öte yandan, organoidler insan gözüne heterojen ve dolayısıyla önemsiz görünen şekiller de gösterebilir; bu da farklı alt tipleri temsil eden tekrarlayan ince morfolojileri gizler. İnsan birincil meme organoidleri, h...

Tartışma

Her hesaplama aracında olduğu gibi, çıktı kalitesi, girdilerin aracın tasarlandığı beklenen kurallara uyup uymadığına bağlıdır. Aşağıdaki kurallar, sağlanan Python betikleri kullanılırken kalite kontrol kontrolü olarak uygulanmalıdır. Öncelikle, açık maskelerin beyaz zeminde mavi çizgiler olduğundan emin olun. Mavi keyfi bir karardı ve önemi yoktu, ancak LCPC dönüşümünü gerçekleştiren betikler beyaz arka planda mavi pikselleri aramak için yazılmıştı. İkinci olarak, dört tarafında 10 piks...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Add 100 pixels to margins.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Average K-means Nearest Neighbor via sklearn version 1.6.1	SciKit Learn	https://scikit-learn.org/stable/modules/generated/sklearn.neighbors.NearestNeighbors.html	Used the NearestNeighbors function within the sklearn.neighbors package
BLUE_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Chamfer Distance via scipy version 1.15.1	SciPy	https://docs.scipy.org/doc/scipy/reference/generated/scipy.spatial.cKDTree.html	Used cKDTree function within scipy.spatial package
Cliff's Delta	Tissue Spatial Geometrics Lab	https://github.com/dh2nguyen/Cliffs-Delta	Created an implementation of Cliff's Delta via the Python language
Enlarge Image Size by 3X.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Fiji/ImageJ v2.14.0	ImageJ.net	https://imagej.net/
Flip images HORIZontally.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Flip images VERTically.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
GREEN_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Isolate Objects Empty Blue.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
MacOS Preview Version 11.0	Apple Inc	https://support.apple.com/guide/preview/welcome/mac
Master Script_Parallel Grid LCPC_DN_071025.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Radial-Grid-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Master Script_Radial Grid LCPC_bBoxCentered.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Parallel-Grid-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Microsoft Paint	Microsoft	https://www.microsoft.com/en-us/windows/tips/paint	Was mentinoed as a potential useful tool for manual segmentation, but not used in this study
Microsoft Powerpoint Version 16.109.3	Microsoft	https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/powerpoint/cfq7ttc0pbmc
PINK_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Principal Component Analysis (PCA) via sklearn version 1.6.1	SciKit Learn	https://scikit-learn.org/stable/api/sklearn.decomposition.html	Used the PCA function with the sklearn.decomposition package
RED_Color Extraction (Mac).ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
RED_Color Extraction (Windows).ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Resize width to 400 pixels but constrain aspect ratio.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate CLOSED Object Horizontal by Longest Internal Length.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate Green Line_v3.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate images 90CCW.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate images 90CW.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Thicken Blue Lines.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Trim margin to 1-pixel border.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook