Fare Meme Bezinde Gen Nakavt ve Aktivasyonun Paraleli In Vivo Taraması

Özet

Bu protokol, fare meme bezinde paralel in vivo gen nakavt ve aktivasyon çalışmalarını mümkün kılan ölçeklenebilir bir intraduktal CRISPR tarama yaklaşımını tanımlar.

Özet

İleri genetik taramalar, binlerce genetik elementi bir toplanmış şekilde bozmak için rutin olarak kullanılır ve büyük ölçekli genotip-fenotip haritaları üretmek amacıyla yapılır. Genellikle hücre kültür sistemlerinde yapılsa da, biriken kanıtlar, in vivo ekranların in vitro tekrarlanamayan yeni biyolojiyi ortaya çıkarma gücüne sahip olduğunu doğruluyor. Ancak, bu yaklaşımın yaygın uygulaması iki büyük zorlukla sınırlı olmuştur: gen aktivasyonu yerine fonksiyon kaybı bozulmalarına ağırlık verme ve in vivo spesifik dokulara karmaşık genetik kütüphanelerin iletilmesinde yaşanan önemli teknik engeller. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, fare meme bezinde on binlerce ayrı epitel klon üreterek verimli ve hızlı fonksiyonel genomik taramayı mümkün kılan basit ve çok yönlü bir intraduktal enjeksiyon stratejisini tanımlıyoruz. Ayrıca, kütüphane üretimi, intraduktal enjeksiyon, ekran dekonvolüsasyonu ve kapsamlı in vivo ekranlar için CRISPR-Knockout ve Aktivasyon kütüphanelerinin analizi için gerekli tüm detayları sağlıyoruz. Bu araçları kullanarak, CRISPR-KOALA (Knockout and Activation Linked Assay) adını verdik, kodlayan ve kodlamayan genom içinde genomun 46 lokusundan beşte birine kadar değişen kütüphanelerde yeni tümör baskılayıcıları ve onkogenler tespit ettik. Önemli olarak, bu yaklaşım ve analiz, homeostaz veya hastalık sırasında herhangi bir genin biyolojik işlevini incelemek için diğer organlara da uygulanabilir.

Giriş

Fonksiyonel genomik taramaları, gen fonksiyonunu^1. ölçekte sorgulamak için güçlü bir çerçeve sağlar. CRISPR-Cas gen düzenleme teknolojilerinin geliştirilmesi, yüzlerce ila binlerce genin paralel sistematik şekilde bozulmasını mümkün kıldı ve memeli hücre hatlarında birleştirilmiş CRISPR tabanlı ekranlar, modern kanser biyolojisi araştırmalarının temel taşlarından biri haline^{geldi 2}. Bu in vitro yaklaşımlar, çeşitli kanser bağlamlarında temel^{genler 3}, tümör^{baskılayıcılar 4} ve sentetik ölümcül^{etkileşimler 5} tespit etmiştir. Ancak, temel sınırlamalardan biri, tümörlerin karmaşık biyolojik özelliklerini, bağışıklık sistemi ve stroma ile etkileşimleri, besin gradyanları ve mikro ortam içindeki doku mimarisi dahil olmak üzere in vivo yakalayamamasıdır². Bu sınırlamayla tutarlı olarak, son çalışmalar, birçok gerçek kanser sürücü genin, özellikle hücre kültüründe olmayan mikroçevresel ipuçlarına bağlı olarak fonksiyonları mikroçevresel ipuçlarına bağlı olduğunda, in vitro olarak ölçülebilir etkiler göstermediğini^{göstermiştir.}

Fare meme bezi, in vivo fonksiyonel genomik taraması için benzersiz ve avantajlı bir doku bağlamı sağlar. Meme epitel hücreleri son derece rejeneratiftir, estros döngüsü sırasında klonal genişleme turlarından geçer ve kolayca erişilebilen ve genetik olarak manipüle edilebilen dallanmış bir kanal ağı^{halinde organize edilir 11,12,13}. Bu özellikler, onlarca yıl süren mozaik genetik analizleri ve soy izleme deneylerini desteklemiş ve meme bezini, doku homeostazı ve hastalık sırasında hücre içsel ve mikroçevreye bağlı gen fonksiyonunu sorgulamak için yönetilebilir bir sistem olarak^{sağlamıştır} 14,15,16,17,18,19,20,21,22^. 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33. Önemli olarak, genetik bozulmalar epitel bölmesiyle sınırlı olabilir; bu da epitelye özgü dönüşüm, hücre rekabeti, soy sadıklığı ve tümör ilerleyişinin sağlam bir doku bağlamında doğrudan incelenmesini sağlar.

Genetik bozulmaları doğrudan yetişkin meme bezine yerinde taşımak için birkaç strateji geliştirilmiş olsa da, yüksek verimli uygulamalar için önemli teknik engeller devam etmektedir. Cre rekombinazının adenovürüs aracılı teslimatı, yetişkin meme bezinde koşullu allellerin somatik rekombinasyonunu indüklemek^{için yaygın olarak kullanılmıştır (}34,35,36,37), geleneksel genetik olarak tasarlanmış fare modelleri (GEMM'ler) için gereken karmaşık germ hattı üremesi olmadan gen fonksiyonunu manipüle etmenin verimli bir yolunu sunar. Yüksek titrli adenovirüs CRISPR-Cas9 bileşenlerini doku kesintisi hücrelerine de taşıyabilse de, bu vektörler konak^{genomuna entegre olmaz} 38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49 . Bu, ekranların ölçeğini ~10–55 genlerle ciddi şekilde sınırlandırır; çünkü her gRNA hedef bölgesi 38,39,40,41,42,43,44,45,46,47 moleküler inversiyon problarıyla ayrı ayrı dizilenmelidir. Ayrıca, mevcut intraduktal doğum yöntemleri doğrudan meme kanal sistemine erişim sağlar ancak ya meme bezinin invaziv cerrahi^{maruziyetini gerektirir ya} da nispeten büyük ve hantal^{Hamilton şırıngalarının kullanımına} dayanır. Virüsün lokal olarak taşınmasında etkili olmalarına rağmen, bu yaklaşımlar nispeten invaziv, teknik olarak zorludur ve havuzlanmış lentiviral kütüphanelerin ölçeklenebilir teslimatı için optimize edilmemiştir. Bu çalışmalar topluca, yerinde viral bozulmaların mümkün olduğunu göstermektedir, ancak mevcut araçlar yüksek verimli in vivo CRISPR taraması için gereken istikrarlı, birleştirilmiş ve dizisi geri alınabilir bozulmaları desteklememektedir.

Bu sınırlamaları gidermek için, biz ve diğerleri kararlı ve kalıtsal genetik modifikasyonları mümkün kılan lentiviral vektörleri entegre etmeye yöneldik. Hücre kültür sistemlerinin aksine, in vivo dokular tek bir organ içinde üretilebilecek bozulmuş hücre sayısına sıkı kısıtlamalar koymakta olup, genom genelinde taramayı pratik kılmamaktadır. Sonuç olarak, in vivo CRISPR ekranları, kapsama ile fizibiliteyi dengeleyen biyolojik bilgilendirilmiş, hedefli kütüphanelerin tasarlanmasını gerektirir. Ayrıca, burada^incelenen çoğu in vivo CRISPR taraması, gen aktivasyonunun tamamlayıcı ve örtüşmeyen biyolojik içgörülerin ortaya çıkabileceğine dair artan kanıtlara rağmen, neredeyse tamamen lentiviral fonksiyon kaybı bozukluklarına^{odaklanmıştır 52,53,54,55.} Biz ve diğerleri daha önce lentiviral CRISPR bozulmalarının yetişkin meme epiteline entegre edilmesinin sabit ve kalıtsal genetik modifikasyonu in situ mümkün kıldığını ve genomik^{DNA'dan (}36,55,56,57,58) geri alınıp nicellenebileceğini göstermiştik. Bu yaklaşımı kullanarak, onkojenik dönüşümün yeni sürücülerini belirleyen in vivo CRISPR taramaları (^36,55) birleştirilmiş şekilde gerçekleştirdik ve lentiviral teslimatın ve CRISPR taramasının hem fizibilitesini hem de biyolojik önemini ortaya koyduk. Ancak, bu çalışmalar, aynı bez içinde hem kayıp hem de fonksiyon kazanımı tarama modellerini kapsayacak şekilde geniş çapta benimsenebilecek ve genişletilebilecek basit, standartlaştırılmış ve ölçeklenebilir bir protokole ihtiyaç duyduğunu da vurguladı.

Burada, yetişkin fare meme^{bezi 55} içinde CRISPR-knockout ve aktivasyon kütüphanelerinin paralel in vivo taramasını mümkün kılan basit ve çok yönlü intraduktal enjeksiyon stratejisini tanımlıyoruz; bu kütüphaneler CRISPR-KOALA olarak adlandırılır. CRISPR-KOALA, CRISPR-KOA yetenekleri için ya geleneksel 20-21 bp 'tek kılavuz' (sg)RNA ya da CRISPR-A için 14 bp 'ölü kılavuz' (dg)RNA kullanır. dgRNA, Cas9'u hedef bölgesine etkili şekilde yönlendirir ancak Cas9 endonükleaz^aktivitesini 59,60,61 engeller ve böylece hem nakavt hem de aktivasyon modaliteleri için aktif Cas9'u ifade eden tek bir farenin kullanılmasına olanak tanır. dgRNA trcr'ye iki PP7 saç tokası eklenmesi, PP7 Coat Protein:P65:HSF1 transaktivatörü^62'nin alınmasını sağlar ve in vivo⁵⁵ genlerin verimli aşırı ifade edilmesine yol açar (Şekil 1). Hedefli gRNA kütüphanesi tasarımını yüksek titrli lentiviral üretimi ve cam mikrokapilalar kullanılarak cerrahi olmayan intraduktal teslimatla birleştirerek, bu yaklaşım doku mimarisini ve mikroçevresel etkileşimleri koruyarak on binlerce uzamsal olarak ayrık epitel klonu üretir. Önemli olarak, lentiviral olarak konak genomuna entegrasyon, yüksek verimli dizileme yoluyla gRNA'ların geri kazanılmasını ve nicelendirilmesini sağlar; böylece in vivo fonksiyonel genomik ekranların birleştirilmesini sağlar. Bu, birlikte aynı hücrede, Cas9 eksprese eden farenin aynı meme bezinde paralel veya eşzamanlı CRISPR-KO ve CRISPR-A bozulmalarına olanak tanır.

gRNA kütüphanesi tasarımı, lentiviral üretim ve konsantrasyon, intraduktal teslimat, kütüphane dekonvolüsasyonu ve veri analizini kapsayan ayrıntılı adım adım bir protokol sunuyoruz (Şekil 1). Bu yöntem birlikte, fare meme bezinde in vivo CRISPR bayıltma ve/veya aktivasyon taraması için pratik ve ölçeklenebilir bir çerçeve sağlar ve doku homeostazı, farklı hastalık ortamları, diğer dokular ve fare gibi diğer türler sırasında gen fonksiyonlarını incelemek için uyarlanabilir.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, Kanada Hayvan Bakımı Konseyi'nin yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi ve Fenogenomik Hayvan Bakımı Merkezi Komitesi tarafından onaylandı (protokol 26-0272H).

1. CRISPR kütüphanesi klonlaması

NOT: Bu bölüm, diziyle sentezlenen oligonukleotidlerden lentiviral omurgalara CRISPR knockout ve CRISPR aktivasyon kütüphanelerinin toplu klonlanmasını açıklar. Rutin olarak 4.000 gRNA içeren kütüphaneler üretiyoruz; bu kütüphaneler 8-20 farede 400X-1.000X kapsama alanıyla taranabilir. GRNA sayısı ve kapsama ihtiyacına göre ayarlanabilir, bu da istatistiksel gücü korumak için gereken fare sayısını etkiler. Güçlü fonksiyon kazanımı fenotipleri için yeterli olabilecek minimum 400X kapsama korumasını öneriyoruz.

1. Rehber RNA kütüphane tasarımı
   1. Bir deneyde incelenecek tüm fare genlerinin listesini derleyin; aşağıdaki CRISPR kütüphanesi tasarımı için ayrı hedef listeleri tutarak, CRISPR knockout (CRISPR-KO) ve CRISPR aktivasyon (CRISPR-A) kütüphaneleri için ayrı hedef listeleri tutulun.
      NOT: CRISPR-KO ve CRISPR-A kütüphaneleri ayrı ayrı oluşturulur ve lentiviral transdüksiyon aşamasında eşzamanlı tarama için birleştirilebilir.
   2. CRISPR-KO kütüphaneleri için, CRISPick^62,63, CHOPCHOP⁶⁴ veya VBC Score⁶⁵ gibi yüksek puanlı tahmin algoritmaları kullanılarak her gen için dört ila beş tek rehber RNA (sgRNA) seçebilirsiniz.
      NOT: VBC Puanı çok yüksek etkinlik ve hedefe uygun aktivite⁶⁶ vermektedir. Araç ne olursa olsun, yüksek tahmini hedefe uygun aktivite, minimum hedef dışı potansiyel ve hedefleme kodlama ekzonları içeren rehberleri önceliklendirin.
   3. CRISPR-A kütüphaneleri için, CRISPick^62,63 veya CHOPCHOP⁶⁴ kullanılarak her gen için sekiz ila on rehber seçin. Kullanıcı tarafından belirlenen kılavuz uzunluklarına izin veren araçlar için (örneğin CHOPCHOP), kılavuz üretiminden önce kılavuz uzunluğunu 14 bp olarak ayarlayın. Sadece 20 bp kılavuz üreten bir araç kullanıyorsanız, bu dizileri, genlerin protospacer bitişiği motifinin hemen 5' ötesinde 14 bp dizisini koruyarak ölü kılavuz RNA'lara (dgRNA'lar) dönüştürebilirsiniz.
      NOT: dgRNA'lar, tam uzunluktaki^{sgRNA'ların yaklaşık} %50-85'inde tam uzunlukta transkripsiyonel aktivasyonun yaklaşık %50-85'inde DNA bölünmesini tetiklemeden CRISPR tabanlı transkripsiyonel aktivasyonu mümkün kılmak için tasarlanmış kısaltılmış rehber^dizilerdir 59,60,61.
   4. Tek bir deneye karşılık gelen tüm sgRNA'lar veya dgRNA'lar ayrı listelere birleştirilerek uniform klonlama, viral üretim ve in vivo tarama mümkün olsun.
      NOT: birlikte taranacak sgRNA ve dgRNA'lar, viral üretim sonrası birleştirilecek.
   5. Daha önce tanımlandığı gibi, hedeflenmemiş^55,67 ve genik olmayan gRNA^{dizileri 68} dahil olmak üzere CRISPR-KO ve CRISPR-A ekranları için havuzlanmış negatif kontrol kütüphaneleri oluşturularak gen bozulması veya aktivasyonundan bağımsız arka plan etkilerini kontrol edin.
      NOT: İstenilirse, hedef olmayan ve genetik olmayan gRNA'lardan oluşan ayrı kütüphaneler oluşturularak iki bağımsız negatif kontrol kütüphanesi oluşturulabilir.
2. Oligonukleotid havuz tasarımı ve amplifikasyonu
   1. Her gRNA'nın hedefleme dizisi, hedef lentiviral omurga ile uyumlu kısıtlama enzimi çıkıntıları ve karmaşık bir oligonukleotid havuzundan seçici amplifikasyonu mümkün kılan kütüphane-spesifik primer dizilerini içerecek şekilde birleştirilmiş oligonukleotidler tasarlayın (Şekil 1, Tablo 1).
   2. Her gRNA kütüphanesine benzersiz bir primer çifti atayın, böylece paylaşılan oligonukleotid havuzundan bireysel kütüphanelerin bağımsız amplifikasyonu sağlanır. Benzersiz primer çiftleri Tablo 1'de listelenmiştir.
   3. Ticari bir dizi sentez platformundan oluşan oligonukleotid kütüphanelerini sıralayarak her havuzdaki tüm gRNA'ların ekemolar temsilini sağlar.
   4. Aşağıdaki reaksiyon karışımında kütüphaneye özgü primerler kullanarak havuzlanmış oligonukleotid şablonundan bireysel gRNA kütüphanelerini amplifikasyon. Reaksiyon, belirli polimerazın önerilen bileşimine uyacak şekilde değiştirilebilir. Bir toplanmış oligonukleotid şablonu ve bir şablonsuz negatif kontrol reaksiyonu içeren üç reaksiyon hazırlayın.
      4 ng Pooled oligonukleotide şablonu
      2.5 μL 10 μM İleri kütüphane-spesifik primer
      2.5 μL 10 μM Ters kütüphane-spesifik primer
      10 μL 5x Reaksiyon tamponu
      0.5 μL Yüksek isabetli DNA polimeraz
      X μL Nukleazsız su
      50 μL Toplam hacim
   5. Aşağıdaki döngü koşullarını kullanarak PCR amplifikasyonu gerçekleştirin, kütüphaneye özgü primer erime sıcaklığına göre tavlama sıcaklığını ayarlayın:
      30 saniye boyunca 98 °C sıcaklıkta 1 döngü
      18 döngü: 10 saniye 98 °C, 20 saniye 62–65 °C ve 3 saniye 72 °C
      72 °C'de 5 dakika bir döngü
      NOT: Kütüphane içinde eşit gRNA temsili korumak için 18–19 amplifikasyon döngüsünü aşmayın.
   6. PCR ürünlerini %2,5 agaroz jel üzerinde 120 V'da yaklaşık 45 dakika çözün ve beklenen gRNA insert boyutuna (primer tasarımına bağlı olarak yaklaşık 100 bp; Şekil 2A).
   7. PCR ürünlerini jel ekstraksiyon kiti kullanarak arındırın ve son elüasyon aşamasında 20 μL ultrasaf suda elüasyon yapın.
      NOT: (DURAKLAMA NOKTASI) Saflaştırılmış gRNA ekleri klonlamadan önce -20 °C sıcaklıkta saklanabilir.
3. Lentiviral omurgalarının hazırlanması ve sindirimi
   1. GRNA insertlerini klonlamak için çıkarılabilir bir doldurucu dizisi içeren lentiviral omurga plazmidleri hazırlayın. In vivo CRISPR-KO ve CRISPR-A kütüphaneleri için sırasıyla pLKO-Cre (Addgene Plazmid #158032 veya 256774) ve pXPR502-PPH-Cre (Addgene Plazmid #256776) kullanılır.
   2. Uygun kısıtlama enzimi ve tampon kullanılarak toplam 200 μL reaksiyon hacminde lentiviral omurga DNA'sını 5–10 μg sindirin. pLKO-Cre CRISPR-KO omurgası için Esp3I ve pXPR502-PPH-Cre CRISPR-A omurgası için SapI kullanın.
      5–10 μg Omurga Plazmidi
      20 μL 10x Enzim tamponu
      5 μL kısıtlama enzimi
      X μL Nükleazsız su
      200 μL Toplam hacim
   3. Sindirim reaksiyonlarını 37 °C'de 2–3 saat kuluçka edin.
   4. Her sindirim reaksiyonuna 2 μL rekombinant alkali fosfataz eklenir ve sindirilmiş omurga defosforile etmek için 37 °C'de 1 saat kuluçka yapın.
   5. Sindirilmiş ürünleri %1 agaroz jelinde çözün ve linearize omurga bandını kesin (Şekil 2B,C)
      NOT: Her iki omurga için de, doldurucu parça vektöre bağlı olarak yaklaşık 2000-2500 bp hızda ayrı bir bant olarak görünür.
   6. Kesilmiş omurga DNA'sını jel çıkarma kiti kullanarak arındırın ve yüksek DNA konsantrasyonunu (genellikle 20 μL) korumak için minimum miktarda ultrasaf suda elüasyon yapın.
      NOT: (DURAKLAMA NOKTASI) Saflaştırılmış sindirilmiş omurgalar, ligasyondan önce -20 °C'de saklanabilir.
4. gRNA kütüphanelerinin sindirimi ve ligasyonu
   1. 750 ng saflaştırılmış lentiviral omurga DNA'sı, 43 ng gRNA kütüphanesi insert DNA'sı, 3 μL krestriksiyon enzimi, 7,5 μL T4 DNA ligaz, 15 μL 10 mM ATP ve uygun miktarda reaksiyon tamponu ile steril damıtılmış su kullanarak toplam 150 μL reaksiyon hacmine ulaşmak için hepsi bir arada sindirim-ligasyon reaksiyonları kuruldu.
      NOT: Plazmid omurga sindirim aşamasında başlangıçta kullanılan aynı kısıtlama enzimini kullanın. Önerilen omurgalar kullanıldığında yaklaşık olarak 750 ng saflaştırılmış lentiviral omurga ile 43 ng kütüphane insert DNA'sı oranı, yaklaşık 1:7 vektör-insert molar oranı elde eder.
   2. Her ligasyon karışımını üç eşit aliquot'a ayırarak dönüşüm verimliliğini ve kütüphane karmaşıklığını artırın.
   3. Arka plan ligasyonu değerlendirmek için omurga DNA'sı içeren ancak gRNA eklemeleri olmayan tek bir negatif kontrol reaksiyonu hazırlayın.
   4. Sindirim-ligasyon reaksiyonlarını gece boyunca 30 °C'de kuluçka edin.
   5. Ertesi sabah, her reaksiyon aliquotuna uygun kısıtlama enziminden 1 μL ekleyin ve omurga sindiriminin tamamlanmasını sağlamak için 37 °C'de 1 saat kuluçka yapın.
   6. Her reaksiyona 2 μL 10 mM ATP ve 2 μL T4 DNA ligaz eklenin ve ligasyonun tamamlanması için 25 °C'de 2–3 saat kuluçka yapın.
   7. Her kütüphane için üç ayrı sindirim-ligasyon reaksiyonunu birleştirin, reaksiyonları kolon bazlı oligonukleotid temizleme yöntemiyle arındırın ve her birini 21 μL ultrasaf steril damıtılmış suda elüasyon yapın. Tek arındırılmış negatif kontrol reaksiyonunu 7 μL ultrasaf steril damıtılmış suda elüet.
      NOT: Tuz veya EDTA içeren tamponlar içinde ligasyon ürünlerini elüasyon yapmayın, çünkü bunlar bakteriyel elektroporasyon verimliliğini önemli ölçüde azaltır. (DURAKLAMA NOKTASI) Arıtılmış ligasyon ürünleri, elektroporasyondan önce -20 °C sıcaklıkta saklanabilir.
5. Kütüphane elektroporasyonu ve genişlemesi
   1. Elektroporasyon öncesi en az 20 dakika buzda 2,1 cm elektroporasyon küvetleri, 2 μL aliquot saflaştırılmış ligasyon ürünleri içeren mikrosantrifüj tüpleri ve 14 mL yuvarlak tabanlı polipropilen kültür tüpleri önceden soğutulabilir.
   2. Elektro yetkili bakteri hücrelerini buz üzerinde eritin ve 25 μL hücreyi 2 μL saflaştırılmış ligasyon ürünüyle önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüpünde pipetleme ile nazikçe karıştırın.
   3. Hücre-DNA karışımını önceden soğutulmuş 0,1 cm elektroporasyon küvetine aktarın ve 1,8 kV, 25 μF ve 200–600 Ω elektroporatla geçirin.
      NOT: Başarılı bir elektroporasyon genellikle 4,6 ms ile 4,9 ms arasında bir zaman sabiti verir.
   4. Elektrokompetsiyon hücreleriyle birlikte sağlanan 1 mL önceden ısıtılmış, 37 °C geri kazanım ortamını küvette hemen ekleyin, hücreleri nazikçe yeniden süspansiyona yerleştirin ve süspansiyonu 14 mL'lik yuvarlak tabanlı polipropilen tüpe aktarın.
   5. Kurtarılan hücreleri 30 °C'de 180 rpm'de 90 dakika boyunca sallayarak kuluçka edin.
   6. Kurtarılan hücrelerin 10 μL plakası, 90 μL LB suyu ile seyreltilerek ampisilin içeren LB-agar plakalarına yerleştirilir ve dönüşüm verimliliği ile arka plan ligasyonu değerlendirilmek için gece boyunca 30 °C'de kuluçka edilir.
      NOT: Başarılı klonlama, plaka üzerinde insert ile yüzlerce koloni ve sadece omurga olan negatif kontrol plakasında ise az sayıda (> 30) koloni ile sonuçlanmalıdır (Şekil 3).
   7. U6 promotöründen miniprep için ~10 koloni seçerek ve Sanger dizileme forward'larını seçerek kütüphaneyi daha da doğrulamak için yeterli hale getirin. Başarılı klonlanmış kütüphanelerde, minipreplerin %90'ı gRNA'nın net dizilemesini NOT: Kütüphane temsili, seyreltme plakalarından koloni sayılarını kütüphanedeki toplam gRNA sayısıyla karşılaştırarak değerlendirilebilir ve 1.000 kat kapsama hedeflenir. Bu hesaplamaya yardımcı olmak için birden fazla seri seyreltme kullanılabilir.
   8. Dönüşüm verimliliği yeterliyse, kalan kurtarılan hücreleri uygun antibiyotik içeren 15 cm LB-agar plakalarına yerleştirin ve gece boyunca 30 °C'de kuluçka yapın, böylece yoğun bir koloni alanı oluşturulur.
      NOT: Yeterince koloni elde etmek için on 15 cm LB agar plakasının her birine 100 μL kurtarılmış hücreler yerleştirilin.
   9. Ertesi gün, ampisilin ile 500 mL LB çorbasına bakteri kolonilerini kazımak için hücre kazıyıcısı kullanılarak klonlanmış gRNA kütüphanesini temsil eden tek bir bakteri kültürü oluşturulur.
   10. Biriktirilmiş bakteri kültürünü yaklaşık 30 °C sıcaklıkta yaklaşık 3 saat çalkalayarak genişletin ve plazmid DNA'sını maxiprep kiti ile izole edin.

2. In vivo görüntüleme için lentiviral üretimi

NOT: İç dükktal doğum ve in vivo havuzlu tarama için, meme epitel hücrelerinin verimli transdüksiyonunu sağlamak amacıyla lentiviral preparatlar yüksek titrler elde etmek için konsantre olmalıdır (ideal olarak 1 x 10^{8 pfu} /mL ile 1 x 10⁹ pfu/mL arasında). Aşağıdaki protokol, in vivo kullanım için optimize edilmiş yüksek titrli lentiviral üretimi tanımlar.

1. Lentiviral üreten hücrelerin hazırlanması
   1. Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamında (DMEM) %10 fetal sığır serumu, %1 Penisillin-Streptomisin ve kültür hücreleri %5_CO2 ile takviye edilmiş HEK293TN hücre tutulur.
   2. Logaritmik büyümeyi korumak ve hücrelerin %90 birleşimini aşmamak için her 2–3 günde bir geçiş hücreleri yapılır. Optimal viral üretim için <20 geçişlerde hücreler kullanın.
   3. Transfeksiyondan bir gün önce, 15 cm doku kültür plakalarını poli-L-lizin (0,02 mg/mL) ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca kaplayın. Bir viral hazırlık partisi için dokuz tabak hazırlayın.
   4. Poli-L-lizin çözeltisini çıkarın ve plakaları fosfatla tamponlanmış tuzlu su ile iki kez yıkayın.
   5. Tohum 1.1 x 10⁷ HEK293TN hücreyi dokuz poli-L-lizin kaplı 15 cm doku kültür plakasının her birine yerleştirerek hücrelerin transfeksiyon anında ~%90 birleşime ulaşmasını sağlar.
      NOT: Maksimum viral titr gerektirmeyen uygulamalarda, lentiviral üretimi orantılı olarak daha düşük verimle daha az plakaya (örneğin, üç veya altı plaka) indirilebilir. Transfeksiyon için reaktifleri (plazmid DNA, PEI ve DMEM) buna göre azaltın.
2. PEI tabanlı lentiviral transfeksiyon
   1. 95 μg gRNA kütüphanesi plazmidi, 95 μg paketleme plazmidi psPAX2 (Addgene Plazmid #12260) ve 65 μg VSV-G zarf plazmidi pMD2.G (Addgene Plazmid #12259) içeren üç plazmidli sistem kullanarak lentiviral üretimi için plazmid DNA'sını hazırlamak.
   2. Lentiviral üretimi için üç plazmid 10,8 mL serumsuz DMEM'de birleştirin ve yaklaşık 10 saniye vorteksle iyice karıştırın.
   3. Sulandırılmış DNA çözeltisine 366 μL 1 mg/mL polietilenin (PEI) damla olarak ekleyin, yaklaşık 10 saniye girdabla karıştırın ve DNA-PEI komplekslerini oda sıcaklığında 10–30 dakika kuluçka yapın.
   4. Kompleks oluşum sırasında, HEK293TN plakalardan aspirasyon kültürü ortamı alın ve 14 mL serumsuz DMEM eklenin.
      NOT: Fetal sığır serumu hücreler tarafından plazmid alımını engelleyebilir.
   5. DNA-PEI kompleksinin 1,2 mL'sini levha boyunca damla olarak dağıtın ve eşit dağılımı sağlamak için kayaç yapın.
   6. Hücreleri %5_CO2 ile 37 °C sıcaklıkta, 6–8 saat boyunca kuluçka edin.
   7. Her plakadaki ortamı 20 mL önceden ısıtılmış DMEM ile değiştirin ve %10 fetal sığır serumu (%1 Penicillin-Streptomisin içermeden) takviye edin ve hücreleri %5_CO2 ile 37 °C'de kültüre devam ettirin.
      NOT: Gece transfeksiyonu önerilmez, çünkü PEI'ye uzun süre maruz kalmak ve serum eksikliği viral verimini azaltır.
3. Viral hasat ve ultrasantrifüjasyon
   1. 200 mL sukroz yastık çözeltisi, 40 g sukroz, 11,7 g sodyum klorür, 4 mL 1 M HEPES (pH 7,4) ve 1 mL 0,5 M EDTA (pH 7,9) uygun miktarda steril damıtılmış su hacminde birleştirerek ve 0,45 μm düşük protein bağlayıcı polietersulfon filtrasyon ünitesinden filtre-sterilize edilerek hazırlanır. Bu çözelti birkaç ay boyunca 4 °C'de saklanabilir.
   2. Transfeksiyondan 48–72 saat sonra lentiviral süpernatantı toplayın.
   3. 0,45 μm düşük protein bağlayıcı polietersülfon filtrasyon ünitesinden %10 fetal sığır serumu takviyesi ile takviye edilmiş 10 mL DMEM geçirilir. Akışı at. Süpernatantı filtreye yükleyin ve vakumu uygulayın.
      NOT: Eğer konsantrasyon hemen sağlanamazsa, berrak edilmiş viral süpernatantı gece boyunca 4 °C'de saklayın.
   4. Ultrasantrifüj tüpüne 30 mL arıtılmış viral süpernatan ekleyin.
   5. Aydınlaştırılmış viral süpernatantı 4 mL sukroz yastığı çözeltisiyle yavaşça altına yerleştirin.
   6. Ultrasantrifüj borusunu sallanan bir kovalı rotor için uyumlu bir adaptöre yerleştirin ve tüpleri hassas şekilde dengeleyin.
   7. Tüpleri 104.000 × g sıcaklıkta en az 2 saat boyunca 4 °C'de santrifüj yapın.
      NOT: Beckman JS24.38 rotoru gibi sallanan bir kovalı rotor, virüsü sakroz yastığından doğru şekilde pelletlemek için gereklidir.
   8. Tüpün tabanında soluk beyaz veya saydam bir film gibi görünebilecek viral pelleti rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice boşaltın.
   9. Tüplerin en az 10 dakika hava kurumasına izin verin ve laboratuvar mendiliyle tüpün içindeki kalanı sıvı parçasını rahatsız etmeden çıkarabilirsiniz.
      NOT: Tüpün doğru şekilde kurutması, yüksek viral konsantrasyonlara ulaşmak için kritik öneme sahiptir, çünkü nihai geri kazanım hacmini azaltır.
   10. Viral pelletleri 20 μL soğuk fosfatla tamponlanmış tuzlu suyla tekrar askıya alın ve hava kabarcıklarından kaçınarak dikkatlice yukarı ve aşağı pipetleyin.
   11. Tüpleri 2 saat boyunca buzda hafif bir çaltlama ile inkubka yapın, böylece viral pelletler tamamen yeniden süzülür.
   12. Konsantre virüsü temiz bir mikrofug tüpüne aktarın ve çözeltiyi 2.000 × g ile 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüjle geçirerek aydınlaştırın.
       NOT: Bu spin, ameliyat sırasında enjeksiyon iğnesini tıkayan kalıntıları ve kalıntı partikülleri temizler.
   13. Konsantre virüsü tek kullanımlık hacimlere ayırarak tekrar tekrar donma-çözülmeleri önlemez ve -80 °C'de depolayın.
4. LSL-tdDomates fare embriyonik fibroblastları (MEF) kullanılarak lentiviral titrasyon
   1. Enfeksiyondan bir gün önce 6 kuyulu bir plakada 100.000 LSL-tdDomates MEF'i (Rosa-LSL-tdTomato [JAX# 007909]]'dan türetilmiş) DMEM'de %10 fetal sığır serumu, %1 Penisillin-Streptomisin takviyesi ile takviye edilmiş ve hücreleri %5_CO2 ile 37 °C'de kültürlendirin. Hücre sayımı için ekstra bir kutu tabaka koyun.
      NOT: LSL-tdTomato MEF'leri, lentivirüs içindeki Cre için muhabir olarak görev yapar. Diğer omurgaların viral titremesi için uygun herhangi bir raporlayıcı sistemi kullanılabilir.
   2. Ertesi gün, enfeksiyon anında bulunan hücre sayısını ölçmek için ekstra bir kuyulardan LSL-tdDomates MEF'lerinin sayısını sayın.
   3. Toplam 2 mL Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamında ve %10 fetal sığır serumu ile takviye edilen Cre rekombinazını kodlayan konsantre lentivirüs seri seyreltmeleri hazırlanın. Genel olarak, 0,4 μL, 0,1 μL ve 0,025 μL konsantre virüs temiz, dinamik doğrusal bir aralık sağlar (Şekil 4A–D).
   4. LSL-tdDomates MEF'lerinin her kuyusuna 2 mL viral seyreltme ekleyin ve her birine 2 μL 10 mg/mL polibren ekleyin.
   5. MEF'leri 400 × g'de 37 °C'de 90 dakika boyunca dönerek enfekte edin.
   6. Viral ortamı %10 fetal sığır serumu ve %1 Penisillin-Streptomisin takviyesi olan 2 ml DMEM ile değiştirin ve hücreleri %5 CO 2 ile 37 °_C'de 48–72 saat boyunca kültürlendirin.
   7. Her seyreltmede enfekte hücrelerin oranını belirlemek için floresan mikroskopisi veya akış sitometrisi ile tdDomates pozitif hücreleri niceliklerini ölçerin.
   8. Enfekte hücre oranına ve enfeksiyon anında bulunan hücre sayısına göre fonksiyonel titri hesaplayın.
      NOT: CRISPR-KO ve CRISPR-A virüsleri ayrı ayrı üretilir, konsantre edilir ve titredilir. LSL-tdTomato MEF'leri kullanılarak belirlenen fonksiyonel titreler, intraduktal enjeksiyondan önce CRISPR-KO ve CRISPR-A virüslerini belirli bir oranda karıştırmak için kullanılır.
5. Plazmid ve lentivirüs kütüphanelerinin kalite değerlendirmesi
   1. GRNA kütüphanelerinin yeterli derinlik/kapsama ile klonlandığını ve tüm gRNA'ların klonlama ile virüs üretimi sırasında korunduğunu kesin etmek için, plazmid havuzunun ve transdüksiyon edilen MEF'lerin sıralanması şiddetle tavsiye edilir.
   2. Lentiviral kapsamını değerlendirmek için, hesaplanan viral titreme esasında lentivirüslü MEF'leri >1000× kapsama ile transfekte edin. Bu aşamada hücrenin tek bir enfeksiyonu olmasını sağlamak zorunlu değildir.
   3. 48–72 saat sonra, hücreleri tripsin veya bir kazıyıcı ile ayırın ve hücreleri pellet olarak parçalayın. DNA'yı ticari bir gDNA çıkarma kiti kullanarak çıkarın.
   4. Bölüm 5'te tanımlanan protokol kullanılarak 1 μg plazmid ve 3 μg ekstraksiyon MEF DNA'sı dizisi. <5000 gRNA'ya sahip çoğu özel kütüphanede 5 milyon okuma derin dizileme yeterlidir.
      NOT: Plazmid havuzunun okumaları ile rehberlerin nispeten eşit temsili (>1 log on yıl içinde rehberlerin %70'i) ve kütüphane sayılarını domine eden tek rehber olmadan, güçlü bir korelasyon (R²> 0.6) iyi kaliteyi gösterir (Şekil 4E).

3. Fare meme bezine intraduktal lentiviral enjeksiyon

1. İğne ve virüs seyreltmesi
   1. Cam mikrokapiller iğneleri, mikropipet iğne çekicisi kullanarak 9–10 μL hacimli intraduktal enjeksiyon için uygun ince uçlu kapillyarlar üretir. İğnenin en ucunu kırmak için ince bir pens kullanın.
      NOT: Optimal konum, sıvı doldurulabilecek kadar büyük ama meme ucu açıklığına kolayca sığacak kadar ince bir iğne boyutu oluşturur.
   2. Lentiviral preparatları, steril fosfatla tamponlu tuzlu suyla 1 × 10^{7 pfu} /mL nihai konsantrasyona kadar seyreltirin ve %0,05 (w/v) Fast Green FCF boyası ile takviye olun.
   3. CRISPR-KO ve CRISPR-A virüslerini aynı karmaşık havuzda taramak için karıştırıyorsanız, iki kütüphaneyi steril fosfat-tamponlu tuzlu suyla eşit viral titere ayarlayın ve her iki kütüphanede gRNA'ların eşit temsili için oranda karıştırın.
2. Farelerin intraduktal enjeksiyon için hazırlanması
   1. 8–20 haftalık yetişkin dişi fareyi %4 izofluran altında 1 L/dakika oksijenle anestezi edin ve korneanın kurumamasını önlemek için her iki göze steril oftalmik kayganlaştırıcı uygulayın.
      NOT: İndaduktal enjeksiyon invaziv olmayan bir işlemdir ve analjezi gerektirmez. Bu deneyler için Rosa26-LSL-Cas9, H11-Cas9 veya Rosa-LSL-tdTomato farelerini kullanın.
   2. Fareyi sırtüstü pozisyonda kapalı bir ısıtma pedinde sabitleyin; vücut sıcaklığını korumak ve anestezi sürdürmek için %2 izofluran ile burun konusundan 1 L/dakika oksijen ile anestezi uygulanır.
   3. Üçüncü göğüs ve dördüncü karın meme uçlarının çevresindeki tüyleri, steril pamuk çubukla yaklaşık 0,5 cm yarıçaplı dairesel alanda 10–15 saniye boyunca uygulanan depilatör krem ile temizleyin. Cilt tahrişini önlemek için kremi hemen steril gazlı bez ve steril suyla çıkarın.
      NOT: Üçüncü ve dördüncü meme bezleri genellikle enjekte edilmesi en kolay olanlardır. Alternatif olarak, ikinci ve beşinci bezler de aynı şekilde enjeksiyon için hazırlanabilir.
   4. Her meme ucunun çevresindeki deriyi %70 izopropil alkol ve iyot ile steril gazlı bezle sıralı olarak dezenfekte edin.
   5. Fareyi bir biyolojik güvenlik kabininde diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirerek meme uçlarının net görselleştirilmesini sağlar.
   6. %70 etanol ile temizlenmiş ince forseps kullanarak, meme ucunun üzerindeki ölü deriyi nazikçe çıkararak kanal açıklığını açığa çıkarın.
      NOT: Bu ölü keratinlenmiş tabaka gevşek şekilde tutturulmuş ve iğne girişini engelleyebilir. Çıkarma, canlı cilde veya alttaki dokuya zarar vermemelidir.
3. İntoduktal enjeksiyon
   1. Sulandırılmış virüsün 8 μL'sini çekilen cam mikrokapillere yükleyin.
   2. Meme ucu bölgesini ince forsepsle tutun ve iğne ucunu nazikçe meme ucu açıklığına sokun (Şekil 5A). Uygun yerleştirilmiş bir iğne, kanala minimum dirençle girer. Viral süspansiyonu meme kanalına 5–10 saniye boyunca yavaşça dağıtın.
      NOT: 1 × 10⁷ pfu/mL lentivirüs'ün 8 μL'si, luminal meme epitel hücrelerinin yaklaşık %30 enfektifliği ve bazal meme epitel hücrelerinin %5 enfektifliği sağlar; stroma^36'nın ise %0,5 enfeksiyonu (< %0,5) vardır. Viral titer, daha yüksek veya daha düşük enfeksiyon sağlamak için ayarlanabilir.
   3. Enjeksiyon sırasında Fast Green boyasının yayılmasını disseksiyon mikroskobu üzerinden izleyin. Deri altındaki kanal ağı boyunca boya dağılımı gözlemleyerek başarılı intraduktal teslimatı doğrulayın (Şekil 5B).
   4. Başarısız enjeksiyonları, boya kanal ağacı boyunca değil, meme ucuna bitişik meme yağ yastığı içinde birikerek tespit edin (Şekil 5C).
   5. Her iki tarafta üçüncü göğüs ve dördüncü karın meme bezleri için enjeksiyon prosedürünü tekrarlayın; her fareye toplamda dört bez enjekte edilir.
      NOT: Deneyimle, enjeksiyonların %>95'inde başarılı intraduktal doğum sağlanır. Yağ pediyle sınırlı alınan başarısız enjeksiyonlar yan etkilerle ilişkilendirilmez ve kalan bezler yine de kullanılabilir. İmmöhistokimya ve akış sitometrisi yoluyla enjeksiyonların daha fazla doğrulanması yapılabilir (Şekil 5D,E).
   6. Anestezi bırakın ve fareyi temiz bir iyileşme kafesine nakledin.
   7. Fareyi tam olarak ambulasyon haline getirene kadar izleyin ve normal davranış gözlemlendikten sonra fareyi belirlenmiş biyogüvenlik yuvasına geri gönderin.
   8. Enjeksiyondan üç gün sonra, tüm kafes değişimi yapın, tüm yuva ve yatak malzemelerini viral atık olarak atın ve fareyi standart muhafaza döndürülebilecek temiz bir kafese aktarın.

4. Meme bezleri ve tümörlerden genomik DNA izolasyonu

NOT: Hayvan bakım yönergelerine uygun olarak, fareleri CO₂ maruziyeti veya aşırı doz anestezi ve ardından servikal dislokasyon yoluyla ötenazi yapın. Meme bezlerini veya meme tümörlerini istenen zaman noktalarında veya insani son noktada düzenleyici yönergelere göre toplamak. Enfekte hücreler, lentiviral^{enfeksiyondan 48 saat sonra 36,55} veya enjeksiyondan 5+ ay sonra, yabani tip^{farelerde 36}, ya da onkojenik arka planda >24 ay kadar erken bir süre toplanmıştır⁵⁵. Aşağıdaki adımlar, DNA Silme ile temizlenmiş ve sgRNA/dgRNA kasetleri içeren plazmidlerden arındırılmış ekipmanlarla temizlenmiş bir alanda yapılmalıdır. Plazmid DNA'sının iz miktarı bile doku örneklerinin kontaminasyonuna yol açacak kadar yeterlidir ve temiz hazırlıklar için derin dizileme PCR'ları ve negatif (dokusuz) kontroller yapılmalıdır.

1. Doku ayrışması
   1. Meme bezleri için, her meme bezini 2 mL tam Epicult-B Medium (fare) ile 0,2 mL nazik kollajenaz/hyaluronidase ile 15 mL konik bir tüpte sindirin ve gece boyunca 37 °C'de kuluçka yapın.
   2. Oda sıcaklığında 450 × g 450 g'de pellet dissosiyasyon hücreleri kullanın.
   3. Üst yağ tabakasını dikkatlice sığır serumu albumin kaplı pipet ucu kullanarak yeni 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve kalan üst tabakayı atın.
      NOT: Bu aşamadaki üst yağ tabakası genellikle ayrılmamış ve yağ dokusuyla ilişkili kalan epitel organoidleri içerir. Bu fraksiyonu ayrı bir tüpte işlenmesi, epitel hücre iyileşmesini büyük ölçüde artırır.
   4. Hem yağ fraksiyonunu hem de hücre pelletini 5 ml fosfatla tamponlanmış tuzlu suyla bir kez yıkayın, 450 × g oda sıcaklığında 5 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatanları atın.
   5. Yıkanmış yağ fraksiyonu ve aynı meme bezinden hücre pelletini 5 mL fosfatla tamponlanmış tuzlu bir süzen içeren tek bir 15 mL konik tüpte birleştirin.
   6. Birleşik malzemeyi 450 × g'de 5 dakika boyunca pellet edin ve süpernatantı atın.
   7. Meme tümörleri için, steril makas veya skarpel kullanarak dokuyu küçük parçalara ayırın ve doğrudan 2 mL'lik bir mikrofug tüpüne aktarın.
2. Genomik DNA izolasyonu
   NOT: Genomik DNA çıkarımı, üretici talimatlarına uygun olarak veya aşağıdaki fenol-kloroform protokolü kullanılarak Qiagen DNEasy Kan ve Doku kiti kullanılarak yapılabilir.
   1. 5 mL 1 M Tris-HCl (pH 8.0), 1 mL EDTA (pH 8.0), 25 mL 5 M NaCl ve 50 mL %10 SDS birleştirerek DNA lüz tamponu hazırlayın ve son hacmi steril damıtılmış suyla 500 mL'ye getirin.
   2. Her örnekte 1 mL DNA lizis tamponu ve 10 μL Proteinaz K (20 mg/mL) ekleyin ve inversiyon ile iyice karıştırın.
   3. Örnekleri gece boyunca 56 °C'de kuluçka altına alın, böylece tam liziz sağlanır.
   4. Santrifüj, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 16.000 × g üzerinde lizatlanır ve çözünmeyen kalıntılar pellet edilir.
   5. Aydınlaştırılmış süpernatantı yeni bir 2 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
      DIKKAT: Fenol:kloroform:izoamil alkol toksik ve aşındırıcıdır. Organik çözücülerle ilgili tüm adımları uygun kişisel koruyucu ekipman takarak kimyasal bir duman davlumonunda gerçekleştirin.
   6. Eşit hacimde fenol:kloroform:izoamil alkol ekleyin ve yaklaşık 15 saniye vorteksle yoğun karıştırın, ta ki homojen bir karışım oluşana kadar.
   7. Organik ve inorganik fazları ayırmak için 16.000 × g sıcaklığında 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
   8. Üst sulu fazı dikkatlice yeni bir tüpe aktarın, fazı bozmadan yapın.
      NOT: Protein ve RNA kontaminasyonunu en aza indirmek için beyaz ara fazdan amiş bir malzeme asık bulunmayın.
   9. Geri kazanılan sulu faza 0,7 hacim izopropanol ekleyin ve yaklaşık 15 saniye girdabla karıştırın.
   10. 16.000 × g sıcaklıkta 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
   11. Süpernatantı dikkatlice atın ve DNA pelletini %70 etanol içeren 500 μL ile durulayın.
   12. 16.000 × g sıcaklıkta 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın ve etanolü tamamen çıkarın.
   13. DNA pelletini oda sıcaklığında 10 dakika hava ile kurut.
   14. DNA pelletini 50 μL steril damıtılmış suya yeniden süskü altına alın.
   15. Genomik DNA'nın tam yeniden süspansiyonunu sağlamak için örnekleri 37 °C'de 1 saat veya gece boyunca 4 °C'de kuluçka edin.
   16. DNA konsantrasyonunu ve saflığını nanodrop veya florometrik niceleme ile ölçün.

5. CRISPR kütüphanelerinin yeni nesil dizilemesi

NOT: GRNA katlama değişimlerinin zaman içinde hesaplanmasını sağlamak için referans örneği oluşturun. Enfeksiyondan 3 gün sonra alınan transdüksiyon edilmiş MEF'ler (Bölüm 2) veya meme bezleri (Bölüm 4) ile orijinal plazmid maxiprep, başlangıç kütüphanesinde ve viral stokta rehber temsili belirlemek için kullanılabilir.

1. Genomik DNA'dan gRNA kasetlerinin PCR amplifikasyonu
   1. Tablo 2'de listelenen primer çiftlerini kullanarak örnekleri benzersiz şekilde indeksleyin; böylece dizileme sonrası 306 örnekle çoklamaya ve demultiplexlemeye olanak tanıyabilir.
   2. PCR reaksiyonlarını şablon olarak 1 μg genomik DNA kullanarak hazırlayın; toplam 50 μL reaksiyon hacmi 25 μL 2x Q5 Master Mix, 2,5 μL 10 μM ön primer ve 2,5 μL 10 μM ters primer içerir.
   3. Kontaminasyonu izlemek için paralel olarak şablonsuz bir kontrol reaksiyonu ekleyin.
   4. Aşağıdaki döngü koşullarını kullanarak PCR amplifikasyonu gerçekleştirin, kütüphaneye özgü primer erime sıcaklığına göre tavlama sıcaklığını ayarlayın:
      30 saniye boyunca 98 °C sıcaklıkta 1 döngü
      5 döngü: 10 saniye için 98 °C, 10 saniye için 68 °C (-1 °C/döngü) ve 15 saniyede 72 °C
      20 döngü: 10 saniye 98 °C, 30 saniye 63 °C ve 15 saniye 72 °C
      72 °C'de 2 dakika bir döngü
   5. PCR ürünlerini %2,5 agaroz jeliyle çözerek doğru amplikon boyutunu doğrulayın.
   6. pLKO tabanlı sgRNA kütüphaneleri için yaklaşık 306 bp ve pXPR502 tabanlı dgRNA kütüphaneleri için 430 bp bantların varlığını doğrulayın (Şekil 6).
      NOT: Şablonsuz net bir kontrol, reaktiflerin saflığını sağlar ve testin çapraz kontaminasyondan arındığını doğrular.
   7. PCR ürünlerini uygun bir DNA arıtma yöntemiyle arındırın ve florometrik nicelendirme ile DNA konsantrasyonunu nicelikle ölçün.
2. Yeni nesil dizileme
   1. Beklenen kütüphane karmaşıklığı ve örnek klonalitesine dayalı gerekli dizileme derinliğini belirleyin.
      NOT: Klonal olduğundan şüphelenilen tümörler için, kılavuz temsilini doğru şekilde nicelemek için yaklaşık 1 milyon okuma yeterlidir. Meme bezlerinden dizileme derinliğini hesaplamak için, kütüphanedeki rehber sayısını 1.000 kat kapsama ile çarpın, ardından 6 pg genomik DNA/hücre ile çarparak PCR ile amplifikasyon yapılması gereken bir örnek başına toplam genomik DNA kütlesi hesaplanın. Dizileme için gereken toplam okuma sayısı, kütüphanedeki rehber sayısının 1.000 çarpmasına eşittir.
   2. Farklı örneklerden ekemolar konsantrasyonlarda saflaştırılmış kütüphaneleri havuzlayın.
   3. Kısa okuma Illumina dizileme platformu kullanarak kütüphaneleri sıralı havuza aldı.
3. Veri analizi
   1. Numuneye özgü indeksler kullanarak ham dizileme FASTQ dosyalarını demultiplex ile demultiplex.
   2. Trimmomatic⁶⁹ kullanılarak gRNA protospacer dizisine okuyor. CRISPR-A örneklerinde trim 14 bp'ye kadar okunurken, CRISPR-KO için trim ön primerin ucundan 20 bp olarak okunur.
   3. Kesme okumaları Bowtie⁷⁰ kullanılarak ilgili gRNA referans kütüphanesine hizala. CRISPR-KO için -v 2 ve -m 1 , CRISPR-A ve karışık havuzlar için ise -v 2 ve -m 2 hizalama parametrelerini kullanın.
      NOT: Genellikle, okumaların %90'ından fazlası başarıyla hizalanır. Düşük hizalama genellikle kesme hataları, giriş dosyalarının yanlış biçimlendirilmesi veya PCR sırasında örnek kontaminasyonundan kaynaklanır.
   4. MAGeCK^72'deki sayma fonksiyonunu kullanarak her gRNA için hizalanmış okumaları nicelikle ölçülerek aşağı akış analizi için nihai gRNA sayım tabloları oluşturulur.

Sonuçlar

Burada, fare meme bezinde havuzlu in vivo CRISPR taraması için bir protokol sunuyoruz. Bu boru hattı, oligonukleotid dizilerinden toplanan gRNA kütüphanelerini tasarlamak ve güçlendirmek, gRNA kütüphanelerini lentiviral omurgalarına klonlamak, yüksek titrli lentivirüs üretmek, havuzlanmış lentiviral kütüphanelerin yetişkin meme bezine intraduktal teslimatı gerçekleştirmek ve kütüphane temsilinin dizileme tabanlı dekonvolüsyonu için gRNA'ları geri almak için uçtan uca kullanılabi...

Tartışma

Havuzlu in vivo CRISPR taraması için önemli bir husus, yeterli kütüphane kapsamını sağlayıp seyrek, tek hücreli transdüksiyonu koruyarak klonal^{çözünürlüğü 2'yi} korumaktır. Fare meme bezinde, epitel bölmesi konservatif olarak yaklaşık 3,5 ×^10,5 hücreden oluşur her bez³⁶. Ortalama %15 lentiviral transdüksiyon oranıyla, hücre başına birden fazla enfeksiyon sıklığını en aza indiren intraduktal doğumda, her bez başına yaklaşı...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
0.45 micron filtre	Sigma	S2HVU02RE
12k veya 92k oligo çip	Customarray Inc. (Genscript)
15 cm hücre kültür plakaları	Corning	CLS353004
293FT	Invitrogen	R70007
293NT	Systems Biosciences	LV900A-1
Alkalin fosfataz	NEB	M0290L
Amplicillin	Fisher Scientific	BP1760-25
ATP	NEB	9804S
ATP	NEB	P0756S
Cutsmart tamponu	NEB	B6004S
Derin sekanslama (Next-Seq veya Hi-Seq)	Illumina
DNAesy Kan ve Doku DNA ekstraksiyon kiti	Qiagen	69506
Dulbecco’s modifiye edilmiş Eagle ortamı	Wisent	319-015-CL
Endura elektrokompetan hücreler	Lucigen	60242-1
EpiCult-B Fare Ortam Kiti	Stemcell Technologies	05610
Esp3I	NEB	R0734L
Fetal Bovin Serum	Wisent	090-150
Jel DNA temizleme kiti	Zymo Research	D4008
Gene Pulser/MicroPulser Elektroporasyon Küvetler	BioRad	1652089
Gentle Collagenase/Hyaluronidase	Stemcell Technologies	7919
H11-Cas9	Jackson Labratories	JAX#028239
Yüksek Hızlı Santrifüj	Beckman Coulter	MLS-50
Kim-wipe	Kimberly-Clark	34155
LB Agar	Wisent Technologies	800-011-LG
Mikropipet çekici	Sutter Instrument	P97
Mini-prep plazmid Kiti	Frogga Bio	PDH300
NEBuffer 3.1 (BsmBI için tampon)	NEB	R0580L
Oligo Temizleme ve Konsantratör	Zymo Research	D4061
Oligo temizleme kiti	Zymo research	D4060
PAGE saflaştırılmış illumina sekanslama primeri	IDT DNA
PCR Mikropipetler	Drummond	5-000-1001-X10
PEI (polietilenimi)	Sigma	408727-100ML
Penisilin ve Streptinomizin	Wisent	450-201-EL
pLKO-Cre	Addgene	158032
pMD2.G	Addgene	12259
Poly-L-Lizin	Sigma	P2636-100MG
psPAX2	Addgene	12260
pXPR502-PPH-Cre	Addgene	256776
Q5 Polimeraz 2x Master mix	NEB	M0494L
Qubit Florometrik Nicelendirme	Invitrogen	Q33327
R26-LSL-Cas9-EGFP	Jackson Labratories	JAX#024857
R26-LSL-TdTomato fareleri	Jackson Labratories	JAX#007909
SapI	NEB	R0569L
T4 DNA ligaz	NEB	M0202L
Ultrasantrifüj tüpleri	Beckman Coulter	344058
Vakuum Filtre Üniteleri	Fisher Scientific	SCHVU02RE