Drosophila melanogaster'de İzleme ve Otomatik Davranışsal Niceliklendirme Protokolü

Özet

Bu protokol, eşleşmiş Drosophila'daki anahtar vücut noktalarını takip etmek için Python tarafından poz tahminini kullanır; bu da özellikle sosyal etkileşimde ince sosyal davranışların otomatik olarak nicelendirilmesini kolaylaştırır; ayrıca ısı haritaları ve lokomotor yörüngeler oluşturulur.

Özet

Geleneksel centroid tabanlı takip yöntemlerinin sınırlamalarını aşan açık kaynaklı bir analitik araç geliştirmek için, özgürce davranan Drosophila çiftlerindeki sosyal etkileşimleri doğru şekilde analiz eden bir protokol sunuyoruz. Özellikle, bu protokol yüksek çözünürlüklü ağ (HRNet) çerçevesinden ilham alarak aynı anda beş anatomik anahtar noktayı — baş, göğüs, karın ve sol ve sağ kanat uçları — takip eder ve sosyal davranışların sonraki nicel analizleri için yüksek çözünürlüklü koordinat verileri üretmeyi amaçlamaktadır. Bu protokol, Python tabanlı tam bir iş akışı ve tasarladığımız grafiksel kullanıcı arayüzü (GUI) dahil olmak üzere veri seti oluşturma, model eğitimi ve otomatik koordinat çıkarımı ile sineklerde mekânsal doluluk ısı haritaları, lokomotor yörüngeleri ve sineklerde sosyal etkileşim oranları oluşturmak için entegre modüller içeriyor. Bu çerçeveyi doğrulamak için, yaygın olarak kullanılan iki suş olan w1118 ve Canton-S (CS) kullanılarak test edilmiştir. Sonuçlarımız anahtar nokta algısının kararlılığını gösterdi ve mekânsal kullanım ile lokomotif yapısında genotipe özgü farklılıkları ortaya koydu. Bu metodoloji, Drosophila'da nicel etoloji ve sosyal etkileşimlerin otomatik analizi için ölçeklenebilir bir temel sağlarken, manuel açıklama çabasını azaltır ve tekrarlanabilirliği artırır.

Giriş

Drosophila melanogaster, güçlü genetik araçlara ve iyi haritalanmış sinir devrelerine sahip, davranışın mekanik olarak incelenmesini sağlayan yaygın kullanılan bir model^{organizmadır 1}. Flört ve saldırganlık dahil olmak üzere geniş bir sosyal davranış yelpazesine sahiptir ve güçlü bir öğrenme^{yeteneğine sahiptir} 2,3,4,5,6,7,8. Her biri, kompakt ama son derece iyi organize edilmiş bir sinir sistemi tarafından kontrol edilen farklı motor unsurlardan oluşur. Önemli olarak, vücut duruşunun hassas ölçümü, eylem seçiminin nörolojik temellerini anlamak için gereklidir çünkü bu davranışların çoğu, bağlamsal ve iç durum bilgisini kodlayan ince taneli duruş^{motifleri içerir 9,10}.

Bireysel farklılıkları yakalamak için tek uçuş çözünürlüğüne ihtiyaç olmasına rağmen, Drosophila'daki birçok yüksek verimli davranışsal testler hâlâ grup düzeyinde^{indekslere dayanır 11}. Yüksek verimli davranışsal testler, sosyal tercih için T-labirent^{testleri 12,13}, sinekler arası mesafeyi niceleyen sosyal mesafe testleri veya duyusal uyarım¹⁴ altında toplama/kaçınma paradigmalarını içerir; popülasyon eğilimlerini verimli bir şekilde yakalayabilir. Ancak, bunlar doğası gereği bireyler arasında ortalamayı içerir; böylece eylem dizilerindeki heterojenliği ve sosyal değişimlerin zamansal yapısını gizler. Yıllar içinde, uçuş başına tanımlamaya yönelik girişimler, kinematik eşiklerle kural tabanlı olay algılama, merkez takibi ile arka plan çıkarma ve manuel video^{açıklaması} 15,16,17,18 gibi işlevsel olarak kısıtlanmış yöntemlere dayanmıştır. Sonuç olarak, saldırma, vurma veya kanat tehditleri gibi ayrık davranışlar genellikle göz ardı edilir veya yanlış etiketlenir; bu da önemli manuel düzeltme gerektirir. Bu tür kısıtlamalar, sinirsel aktivite ile bireysel eylemler arasında kesin zamansal hizalanma gerektiren mekanik çalışmaları kısıtlamıştır.

Bilgisayar görüşü ve makine öğrenimi tabanlı poz tahmini alanındaki son gelişmeler sayesinde devrim niteliğinde bir çözüm artık mevcuttur. DeepLabCut¹⁹ ve SLEAP²⁰ gibi açık kaynak çerçeveler, işaretsiz vücut parçası algılama, ayrık eylemlerin ölçeklenebilir sınıflandırılması ve yakın etkileşimler sırasında bile bireysel kimliğin korunmasını sağlar. Bu özellikler, önceki grup tabanlı ve kural odaklı yaklaşımların dezavantajlarını aşar ve karmaşık sosyal davranışların tekrarlanabilir nicelendirilmesini mümkün kılar.

Drosophila'daki bireysel etkileşimler, sosyal etkileşimlerin ilerlemesini gösteren benzersiz motor özelliklerle karakterize edilir. Örneğin saldırganlık, saldırma, kanat tehditleri ve grappling gibi tipik davranışları içerir; bunların hepsi büyüyen çatışma^{aşamalarını temsil eder 21,22}. Kur kurma da benzer şekilde yönelim, tek taraflı kanat uzantısı, şarkı üretimi, tıklama ve çiftleşme girişimi ile tanımlanır; bunlar bir araya gelerek çiftleşme etkileşimlerinin zamansal^{dizisini oluşturur 23}. Bu motifleri yakalamak, vücut duruşunun ve eklem hareketlerinin doğru tanınmasına bağlıdır^24,25. Pratikte, örnekleme, ince motor desenlerin sinirsel aktivite ile hassas şekilde tespit edilip hizalanmasını sağlamak için uzun kayıt süreleri boyunca yüksek mekansal ve zamansal çözünürlük gerektirir^25,26.

Burada, beş anatomik anahtar noktanın otomatik tanımlanması için açık kaynaklı, vizyon tabanlı bir çerçeve sunuyoruz—kafa, göğüs, karın, sol ve sağ kanat^{uçları 27}. Sistem, veri seti oluşturma, model eğitimi ve koordinat çıkarımı için tam bir iş akışını içerir ve özelleştirilebilir davranışsal sınıflandırma için uygun yüksek çözünürlüklü zaman serisi verileri üretir. Manuel açıklama süreçlerini otomatikleştirerek ve analitik iş akışlarını standartlaştırarak, yöntemimiz sosyal etkileşim davranışlarının ince ölçekli nicel analizini sağlar, verimliliği ve tekrarlanabilirliği artırırken, analiz için gereken zaman ve emek miktarını önemli ölçüde azaltır.

Sistemin güvenilirliğini doğrulamak için, bunu yaygın olarak kullanılan iki laboratuvar suşuna – w1118 ve Canton-S (CS)'ye uyguladık ve çerçeveler arasında stabil anahtar nokta algılamasının yanı sıra baş mesafesi ve yön açısına dayalı mekansal doluluk, yörünge özellikleri ve sosyal etkileşim göstergelerinde genotipe özgü farklılıkları gözlemledik. Araştırmacılar, bu protokolün uygunluğunu gerekli uzaylı-zaman çözünürlüğüne (≥30 fps, ≤0,5 mm/piksel) ve video kayıt koşullarına (aydınlatma ve kontrast) göre değerlendirebilirler. Piksel boyutu doğrudan kamera ayarlarından belirlenebilir. Ölçülen vücut uzunluğuna sahip bir meyve sineği, kalibrasyon için görüntüleme alanının içine yerleştirilebilir. Bu protokol özellikle aşağıdaki senaryolar için uygundur: iki serbest etkileşimde bulunan Drosophila'yı aynı anda takip etmek ve bireysel kimliklerini ayırt etmek gerekir; sadece centroid pozisyonlar yerine ince duruşlara (örneğin baş açısı ve mesafe) odaklanmak; manuel notlama mümkün olmadığı durumlarda kayıt süresi 10 dakikayı aşması; sonraki analizlerde davranışsal olaylar ile sinirsel aktivite (örneğin, kalsiyum görüntüleme veya elektrofizyoloji) arasında milisaniye düzeyinde zamansal hizalanma gerektiriyordu.

Protokol

1. Sinek hazırlığı

1. Deneylerden önce 3–4 günlük civarında kısa bir CO₂ anestezi altında sinekleri toplayıp cinsiyetleştirin.
   NOT: Anestezi süresi ve CO₂ akış hızı, her laboratuvarda kullanılan karbondioksit silindirinin spesifikasyonlarına ve basıncına bağlı olarak değişebilir. Sinekler anestezi sırasında sürekli olarak izlenmeli ve CO₂ maruziyeti yalnızca sinekler tamamen anestezi edilip hareketlerinin tamamen durduğu sürece devam ettirilmelidir.
2. Her sinekleri ayrı ayrı standart mısır unu–agar–glikoz–maya ortamı içeren 50 mL Falcon tüpüne yerleştirin.
3. Kullanıma kadar 12 saatlik ışık/karanlık döngüde sinekleri 25 °C'de tutun.

2. Arena inşası

1. İki adet 3 mm şeffaf akrilik plaka ve bir adet 3 mm polietilen levha hazırlayın.
2. Polietilen plakanın ortasına dört dairesel oda (her biri çapı 35 mm) kesin.
3. Bir akrilik plakayı polietilen plakaya bağlamak için klipsler kullanarak odanın tabanını oluşturur; İkinci akrilik plakayı çıkarılabilir bir kapak olarak kalın.

Şekil 1: Davranışsal arenanın ve görüntüleme düzeninin şeması. (A) Özel bir gözlem odasının inşası diyagramda gösterilmiştir. Oda, üç ana katmandan oluşur: 3 mm şeffaf akrilik taban plakası; 3 mm polietilen plaka, dört adet 35 mm çapında dairesel kesik ve ayrı oda kuyusu olarak hizmet veriyordu; ve çıkarılabilir bir kapak olarak işlev gören ikinci bir akrilik plaka. (B) Kamerayı dikey olarak 40 cm uzunluğundaki bir optik direğe monte etmek için 90° adaptör kelepçesi kullanılır. Yukarıdan aşağı görüntüleme için, kamera çok katmanlı gözlem alanının doğrudan üzerinde konumlandırılır ve optik ekseni odaya dik konumlanır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

3. Görüntüleme kurulumu

1. İki adet 20 cm optik kutup ve bir 40 cm uzunluğunda kutup ile 90° adaptör kelepçeleri birleştirin.
2. Kamerayı (1280 × 1024 piksel) 40 cm uzunluğundaki direğe dikey olarak monte edin, arena yüzeyine dik hizalayın ve kare hızını 150 fps'ye ayarlayın.
3. Arenayı, 25 cm × 25 cm dimmable gün ışığı beyazı LED panele yerleştirin; üzerine difüzyon levha ile kaplı bir panel.
4. Arena yüzeyinde aydınlatmayı yaklaşık 1500 luks olarak ayarlayın.
   NOT: İkili önizlemede kanat kenarlarının görünür kalmasını sağla. Isı kaynaklı artefaktları önlemek için >2000 lux'tan kaçının; çünkü sinekler ışık kaynağından gelen termal stres nedeniyle doğal hareket hareketlerini veya dağılımlarını değiştirebilir.

4. Kayıt prosedürü

1. Arenanın her köşesinin altına 3 cm köpük pedler yerleştirerek stabilizasyon sağlayın.
2. Sinek çiftlerini CO₂ anestezisi altında odalara aktarmak; üst akrilik plakayla mühürleyin.
3. Kayıt yapmadan önce sineklerin 40 dakika alışmasına izin verin.
4. Video edinimini MIAS.exe²⁷ ile başlatın: başlatmak için q, durdurmak için c'ye basın.
   NOT: Bu, standart koşullar altında serbestçe etkileşime giren sinek çiftlerinin sürekli video kayıtlarını sağlar.

5. Sosyal aktivite panelini tanımlayın

1. Ön işleme betikini çalıştır: python SoAL_PreProcess.py [video_file_path]
   NOT: Tüm kodlama betikleri Ek Dosya 1'de sağlanmıştır.
2. Odalık alanını not edin ve Genotype_age (gün) × 1 (oda sayısı) şeklinde meta veriler atayın. (örneğin, CS_3 × 1)
3. En iyi arka plan çıkarımı ve kanat görünürlüğünü sağlamak için ikili görüntüde kanatlar neredeyse görünmez hale gelene kadar algılama eşik kaydırıcısını ayarlayın.

6. Veri seti hazırlama

1. Yeni bir veri seti klasörü oluşturun:
   python tools/SoAL_DatasetGen.py DATASETNAME 10 (kare örnekleme aralığı)
   NOT: Çerçeve örnekleme aralığı parametresi ("10"), daha önce yayımlanmış bir^{protokol 27'den} uyarlanmıştır. Daha düşük değerler örnekleme yoğunluğunu ve hesaplama yükünü artırırken, yüksek değerler hesaplama talebini azaltır ve mevcut donanım performansı ile deneysel gereksinimlere göre ayarlanabilir.
2. 'tools/SoAL_DatasetUtils.py' bölümünde video yolu ve veri seti yolunu kur
3. Fırlatma manuel etiketleme arayüzü:
   >python araçları/SoAL_LabelUI.py DATASETNAME
   1. Çerçeve navigasyonu: Sırasıyla bir sonraki veya önceki kareye gitmek için Boşluk veya Z tuşuna basın. Alternatif olarak, navigasyon için zaman çizelgesi kaydırıcısını kullanın.
   2. Anahtar nokta etiketleme: Her görselde bir sineğin doğru konumuna tıklayın (belirli bir sırayla: baş, göğüs, karın, sol kanat ve sağ kanat) ve 5 anahtar noktayı işaretleyin.
   3. Anahtar noktası seçimi: Numara tuşlarına basarak bir tuş noktası seçer (beyaz bir daire ile gösterilir). Bir sonraki tıklama, seçilen anahtar noktaya yeni bir sayı yeniden atanır.
   4. Kaydet: Annotasyon sonuçlarını kaydetmek için pencereyi kapatın veya D tuşuna basın.
      NOT: Tam bir eğitim seti arşivi iki bileşenden oluşur: bir resim dizini ve bir annotation.json dosyası.

7. Model eğitimi

1. Veri setini eğitim ve doğrulama kümelerine ayırın:
   python tools/SoAL_DatasetGen.py DATASETNAME bölünmesi
   'dataset/'de iki yeni klasör oluşturulacak.
2. hrnet/fly_w32.yaml içinde eğitim parametrelerini yapılandırmak:
   Dönüş faktörü: 15°
   Ölçek faktörü: 0.35
   Parlaklık faktörü: 0.25
   Parti büyüklüğü: 24
   Dönemler: 200
3. Eğitim programını yürütün:
   python hrnet/tools/train.py --cfg hrnet/fly_w32.yaml
   Ortalama hassasiyet (AP) durgunlaştığında eğitim setlerini sonlandırmak; en iyi modeli (AP > %90) korumak istiyor.
4. Modeli şu şekilde valide et:
   Python hrnet/tools/test.py --CFG hrnet/fly_w32.yaml
   Sonuç: Çok uçuşlu anahtar nokta algılama için sağlam HRNet tabanlı model.

8. Algılama programını çalıştırın

1. Yeni video dosyalarını video dizinine kopyalayın.
2. 5. adımda gösterildiği gibi meta verileri not edin.
3. Çalışma algılama programı: python SoAL_KptDetect.py all
4. Tespit sonuçlarını inceleyin:
   Python Tools/SoAL_ViewKptUI.py excel_file_path (.cvs/xslx)
   Sonuç: Her bir sinekte beş anatomik simgenin iki boyutlu koordinatları, çerçeveler arasında.

9. Davranışsal Niceliklendirme

1. Bağımsız bir GUI uygulaması (Ek Dosya 2) başlatın ve koordinat dosyalarını arayüze aktarın.
2. Mekansal doluluk ısı haritaları (arena pozisyonlarının olasılık yoğunluğu) oluşturun.
3. Koordinat zaman serilerinden lokomotor yörüngeleri yeniden inşa edin.
4. Baş mesafesi, yönelim ve türetilmiş sosyal durum dahil olmak üzere sosyal etkileşim verileri oluşturun.
   Sonuç: Genotipe özgü mekansal kullanım ve hareket dinamiklerinin standartlaştırılmış görselleştirmesi.

Sonuçlar

Şekil 1 , Drosophila'da doğal sosyal etkileşimlerin kaydedilmesinde kullanılan arena geometrisi, aydınlatma konfigürasyonu ve kamera yerleşimini göstermektedir. Bu kurulum, poz tahmini ve koordinat çıkarımı için uygun dengeli aydınlatma ve stabil görüntüleme koşullarını sağlar.

Otomatik poz tahmini, her kaydedilen videolara uygulanarak her sineğin önceden tanımlanmış anatomik anahtar noktaları için iki boyutlu koordinatla...

Tartışma

Çalışmamız, makine öğrenimi tabanlı poz tahmininin Drosophila'da ince taneli sosyal etkileşimleri ölçmek için ölçeklenebilir ve güvenilir bir yöntem sağladığını göstermektedir. Merkez tabanlı^{yaklaşımlar} 15,16,17,18 sınırlarını aşarak beş anatomik anahtar noktayı serbest etkileşimli çiftler halinde takip eder; böylece gövde ekseni tarafından sağlanan açısal bilgiler ve baş noktalarından çıkarılan baş-başa mesafe elde edilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Agar	BioFroxx	8211GR500
camera(MV-CU013-A0UC)	Hikvision	MV-CU013-A0UC
Carbon Dioxide	Messer	124-38-9
D(+)-Glucose anhydrous	BioFroxx	1179GR500
Drosophila Narrow Vials (Falcon tube)	Biolgix	51-0500
Ethanol	Chron Chemicals	64-17-5
LED panel	/	/	özel yapım
Methylparaben	Sigma	99-76-3
polyethylene plate	/	/	özel yapım
Python	/	sürüm 3.6
Sucrose	DaMao	57-50-1
transparent acrylic plates	/	/	özel yapım
Yeast	Angel	100004237033