Erken Senesans Dönemindeki İnsan Fibroblastlarına Telomeraz mRNA Teslimatı için Optimize Edilmiş Ters Transfeksiyon Protokolü

Özet

Bu makale, nükleozid modifiyeli insan telomeraz ters transkriptazı (hTERT) mRNA'sının (hTERT mRNA) senesent insan fibroblastlarına verimli bir şekilde iletilmesi için optimize edilmiş bir ters transfeksiyon protokolü sunmaktadır. Kültür yüzeylerinin hTERT mRNA-lipid kompleksleri ile önceden kaplanması alımı artırarak telomeraz aktivasyonunu, telomer uzamasını ve kısmi gençleşmeyi sağlar. Kültürler, sonunda ölümsüzleşme gerçekleşmeden tekrar senesense veya krize girer.

Özet

Hücresel yaşlanma; azalmış membran akışkanlığı, bozulmuş endozomal trafik, azalmış endositik kapasite ve artmış hücre dışı RNaz aktivitesi dahil olmak üzere, mRNA iletimini engelleyen hücresel fizyolojideki derin değişikliklerle ilişkilidir. Bu engeller, özellikle büyük terapötik transkriptlerin iletimi söz konusu olduğunda, yaşlanmış hücrelerde RNA tabanlı yaklaşımların uygulanmasını sınırlamıştır. Bu protokol, modifiye edilmiş haberci RNA'nın (mRNA) yaşlanmış insan fibroblastlarına verimli iletimi için optimize edilmiş bir ters transfeksiyon yöntemini tanımlamaktadır. Model transkript olarak insan telomeraz ters transkriptaz (hTERT) mRNA'sı kullanılmış olsa da, iş akışı diğer mRNA'lar için de geniş ölçüde uygulanabilirdir. RNA-lipid komplekslerinin hücre yapışmasından sonra kültür ortamına eklendiği geleneksel transfeksiyon yöntemlerinin aksine, ters transfeksiyon, kompleksleri hücre ekimi öncesinde kültür yüzeyine yerleştirerek, yapışan hücreler ile transfeksiyon kompleksleri arasında doğrudan etkileşim sağlar. Transfeksiyon verimliliğini maksimize etmek için protokol; psödouridin ve 5-metilsitidin içeren nükleozid-modifiye mRNA, uzatılmış poli(A) kuyrukları, optimize edilmiş kompleks oluşum zamanlaması, RNaz inhibisyonu, klorokin ile endozomal pH'ın geçici olarak yükseltilmesi, artırılmış hücre ekim yoğunluğu ve uzatılmış inkübasyon sürelerini içermektedir. Bu yaklaşım kullanılarak, 5 kb'lık bir hTERT mRNA transkriptinin iletimini takiben yaşlanmış fibroblastlarda yaklaşık %50–80 oranında transfeksiyon verimlilikleri elde edilmiştir. Pik telomeraz aktivitesi, transfeksiyondan 24–48 saat sonra tespit edilmiştir. Tek bir transfeksiyon döngüsü ölçülebilir telomer uzaması sağlarken, üç ardışık transfeksiyon önemli ancak sınırlı bir telomer uzamasıyla sonuçlanmıştır. Azalmış yaşlanma ile ilişkili β-galaktosidaz aktivitesi, azalmış p16 ve p21 ekspresyonu, hücre morfolojisinin restorasyonu ve replikatif ömrün uzaması dahil olmak üzere, yaşlanma ile ilişkili fenotiplerin kısmi geri dönüşü 72–96 saat içinde tespit edilebilmiştir. İletilen hTERT mRNA'sı 72–96 saat içinde degrade olmuş ve ölümsüzleşme gözlemlenmemiştir. Bu protokol, yaşlanmış hücrelere geçici mRNA iletimi için pratik bir yaklaşım sunmaktadır ve geniş bir hücre tipi ve tür yelpazesine adapte edilebilir.

Giriş

Ters transfeksiyon yaklaşımı, senesent hücrelerin standart transfeksiyon yöntemleri önünde oluşturduğu temel engelleri aşan kritik bir metodolojik adaptasyonu temsil eder. Hücrelerin önceden plaka üzerine ekildiği ve transfeksiyon kompleksleri eklenmeden önce yapışmalarına izin verildiği ileri transfeksiyonun aksine, ters transfeksiyonda süspansiyondaki hücreler, önceden oluşturulmuş hTERT mRNA-lipid komplekslerinin üzerine doğrudan eklenir. Bu teknik, membran yeniden şekillenmesinin en aktif olduğu kritik yapışma aşamasında transfeksiyon komplekslerine maruz kalmayı maksimize ederek, senesent hücrelerdeki transfeksiyon verimliliğini önemli ölçüde artırır.

Protokolün temel kavramsal değişikliği, yaşlı (senesent) hücreleri sadece genç hücrelerin transfekte edilmesi zor versiyonları olarak değil, ayrı bir iletim problemi olarak ele almaktır. Senesens sırasında fosfolipidler, sfingolipidler ve kolesterol dahil olmak üzere membran lipid kompozisyonundaki global değişiklikler; membran akışkanlığını, eğriliğini ve protein-lipid etkileşimlerini değiştirirken, senesensle ilişkili sekretuar fenotipe de katkıda bulunur^1,2,3. Senesent hücreler ayrıca, kısmen amphiphysin-1'in aşağı düzenlenmesi ve caveolin ekspresyonundaki kompanzatuar değişiklikler tarafından tetiklenen, reseptör aracılı alımı ve sinyal iletimini körelten; azalmış klatrin ve caveolae aracılı reseptör endositozuna ve değişmiş endositik yönlendirmeye sahiptir^4,5,6. Paralel olarak, Rab7 tarafından düzenlenen geç endozom-lizozom ekseni ve daha geniş endozomal-otofajik-lizozomal (EAL) ağ düzensizleşir; Rab7, yaşlanma ve nörodejenerasyonda bozulmuş olan endolizozomal olgunlaşma ve otofagozom-lizozom füzyonunun ana kontrolcüsü olarak görev yapar⁷.

Senesent hücreler, TFEB/TFE3 tarafından yönlendirilen lizozomal biyogenez ve şaperon aracılı otofaji dahil olmak üzere lizozomal işleme ve adaptasyon sisteminin (LYPAS) birçok bileşenini yaygın olarak yukarı düzenleyerek lizozomal kütleyi artırırlar. Bununla birlikte, münferit lizozomlar sıklıkla yükselmiş lüminal pH, membran hasarı ve değişmiş proteolitik kapasite sergileyerek, sayıca artmalarına rağmen lizozomal disfonksiyona katkıda bulunurlar^8,9,10,11. Toplu olarak bu değişiklikler, internalize edilen materyalin degradatif endolizozomal kompartmanlara daha verimli bir şekilde yönlendirilmesine yol açarak, iletilen RNA veya proteinin üretken sitozolik salınım gerçekleşmeden önce degrade edilme olasılığını artırabilir^9,10,11. Ters transfeksiyon, membranların yeniden şekillendiği en erken pencereyi, yani adezyon sırasında doğrudan hedefleyerek, hücreler ile mRNA-lipid kompleksleri arasında sürdürülen, yüksek aviditeli bir teması zorlar ve tam adezif senesent hücrelerdeki bozulmuş kararlı durum endositozunu en azından kısmen baypas eder^4,5,6,12.

RNA tasarımı tarafında protokol, yaşlanma bağlamında basit bir kapak + kuyruk temel hattının yetersiz olduğunu varsayar: translasyonu endozomal Toll benzeri reseptör algılamasından ve tip I interferon indüksiyonundan ayırmak için tam nükleozid modifikasyonu (örneğin, psödouridin veya N1‑metilpsödouridin artı 5‑metilsitidin) pazarlık edilemez bir gereklilik olarak ele alınır. Temel çalışmalar, modifiye nükleozidlerin RNA'ya dahil edilmesinin TLR3, TLR7 ve TLR8 aktivasyonunu baskıladığını ve dendritik hücre sitokin üretimini belirgin şekilde azalttığını göstermiş olup, güncel nükleozid modifiyeli mRNA platformlarının azalmış doğuştan gelen immünojenitesi için mekanistik bir temel sağlamıştır¹³. mRNA–LNP aşıları ve mRNA ilaçları üzerine yapılan daha güncel incelemeler, doğuştan gelen bağışıklık aktivasyonunu minimize ederken in vivo stabiliteyi ve translasyonu artırmak için 5′ kapağının, UTR'lerin, kodlama dizisinin ve poli(A) kuyruğunun koordineli mühendisliğinin önemini vurgulamaktadır¹⁴. Özellikle, poli(A) kuyruk uzunluğu ve mimarisi, in vitro transkribe edilen mRNA stabilitesinin ve translasyonel çıktısının temel belirleyicileri olarak ortaya çıkmış ve terapötik mRNA'larda genişletilmiş veya mühendislik ürünü poli(A) tasarımlarını teşvik etmiştir¹⁵.

Buna ek olarak, protokol; kompleks oluşumu ve hücreye alım sırasında hücre dışı ve endozomal RNazlara karşı korumayı ve klorokin^16,17 gibi geçici bir lizozomotropik ajan kullanılarak tanımlanmış bir endozomal kaçış penceresini açıkça yapılandırmaktadır. Klorokin, uzun süredir endozomal bariyerlerin fonksiyonel bir probu olarak kullanılmaktadır ve endozomal membran yıkımını ve nükleik asit kargosunun sitozole kaçışını teşvik ederek, siRNA veya antisense oligonükleotidlerin hedef etkileşimini ve susturma kapasitesini belirgin şekilde artırabilmektedir¹⁸. Aynı zamanda, LNP ile iletilen mRNA'nın canlı hücre ve süper-çözünürlük görüntülemeleri; üretken iletimin, başlangıçtaki hücreye alımdan ziyade, erken/geri dönüşümlü endozomlardan gerçekleşen nadir kaçış olayları nedeniyle ciddi şekilde kısıtlandığını göstermiş ve bu durum mRNA terapötikleri için bilinçli bir endozomal kaçış basamağı tasarlamanın önemini vurgulamıştır¹⁹.

Toplamda, membran dinamikleri, endositik trafik, lizozomal işlemleme ve doğal bağışıklık aktivasyonundaki bu yaşlanma ile ilişkili değişiklikler, etkili mRNA iletiminin önünde önemli engeller oluşturur. Burada açıklanan ters-transfeksiyon stratejisi; optimize edilmiş mRNA mühendisliği, RNase koruması, geliştirilmiş endozomal kaçış ve tutunan hücrelerin önceden oluşturulmuş mRNA-lipid komplekslerine doğrudan maruz bırakılmasını birleştirerek bu kısıtlamaları gidermek amacıyla geliştirilmiştir. Model kargo olarak hTERT mRNA kullanılmış olsa da, bu iş akışı diğer büyük terapötik mRNA transkriptlerinin yaşlı ve transfeksiyona dirençli hücre popülasyonlarına iletimi için geniş ölçüde uygulanabilir^20,21,22.

Protokol

1. hTERT mRNA'nın In vitro Transkripsiyonu

1. In vitro Transkripsiyon (IVT) (ARCA ve ΨUTP ile)
   1. Tablo 1'e göre 20 µL'lik bir IVT reaksiyonu hazırlayın. Daha yüksek verim gerekiyorsa reaksiyonu lineer olarak ölçeklendirin.
   2. T7 RNA polimeraz hariç tüm reaksiyon bileşenlerini RNaz içermeyen bir tüpte birleştirin. T7 RNA polimerazı en son ekleyin, nazikçe karıştırın ve tüpü kısaca santrifüjleyin.
   3. Reaksiyonu 37 °C'de 0,5–4 sa boyunca inkübe edin.
      NOT: İnkübasyon süresini kalıp uzunluğuna göre ayarlayın. Daha kısa kalıplar (yaklaşık 500 bp) içeren reaksiyonları yaklaşık 30 dk ve daha büyük kalıplar (yaklaşık 4 kb) içeren reaksiyonları 3–4 sa inkübe edin.
2. DNaz işlemi
   1. 1 µL RNaz içermeyen DNaz I'i doğrudan IVT reaksiyon karışımına ekleyin.
   2. Reaksiyonu 37 °C'de 15 dk inkübe edin.
      NOT: DNaz işlemi, sentezlenen mRNA'nın ön purifikasyonu yapılmadan doğrudan IVT reaksiyonu içerisinde gerçekleştirilmelidir.
3. mRNA purifikasyonu
   1. Reaksiyon karışımını seyreltmek için 115 µL nükleaz içermeyen H₂O ekleyin.
   2. Üretici talimatlarına uygun olarak bir RNA temizleme kiti kullanarak mRNA'yı purifiye edin.
   3. Purifiye edilen mRNA'yı 20–30 µL nükleaz içermeyen H₂O ile elüe edin.
   4. mRNA saflığını spektrofotometri ile ölçün ve RNA bütünlüğünü %1,0–1,5'lik denatüre agaroz jel veya düşük yüzdeli poliakrilamid jel üzerinde elektroforez ile doğrulayın.
4. Poly(A) kuyruk ekleme
   1. Tablo 2'ye göre 50 µL'lik bir poly(A)-kuyruk ekleme reaksiyonu hazırlayın. Reaksiyon bileşenlerini nazikçe karıştırın ve 37 °C'de 30–60 dk inkübe edin.
      NOT: İnkübasyon süresini kullanılan RNA miktarına göre ayarlayın.
   2. 2 µL 0,5 M EDTA (pH 8,0) ekleyerek reaksiyonu sonlandırın.
5. Final purifikasyon ve kalite kontrol
   1. Üretici talimatlarına uygun olarak bir RNA temizleme kiti kullanarak poly(A) kuyruklu mRNA'yı purifiye edin.
   2. Purifiye edilen mRNA'yı 20–30 µL nükleaz içermeyen H₂O ile elüe edin.
   3. Transfeksiyona geçmeden önce mRNA kalitesini değerlendirin
      1. mRNA konsantrasyonunu 260 nm'de ölçün ve A260/A280 ve A260/A230 oranlarını kullanarak saflığı belirleyin. A260/A280 değerleri yaklaşık 2,0 ve A260/A230 değerleri 2,0'dan büyük olan mRNA preparatlarını kullanın.
      2. Üretici talimatlarına uygun olarak jel elektroforezi veya bir RNA analiz sistemi kullanarak mRNA bütünlüğünü değerlendirin.
      3. Poly(A) kuyruk uzunluğunu RT-PCR veya Bioanalyzer analizi ile konfirme edin. Poly(A) kuyruk uzunluğunun 120 ile 200 nükleotit arasında olduğunu doğrulayın.
      4. Dondurma-çözme döngülerini minimize etmek için purifiye edilen mRNA'yı alikotlara ayırın ve alikotları −80 °C'de saklayın.

2. Ters transfeksiyon

1. Gün −1: Transfeksiyon öncesi hazırlık
   1. Senesent fenotipini doğrulayın
      1. Temsili bir hücre örneği üzerinde senesansla ilişkili β-galaktosidaz (SA-β-gal) boyaması gerçekleştirin. Hücrelerin %70'inden fazlasının pozitif olduğunu doğrulayın.
      2. Senesans markerlarının (p16 ve p21) ekspresyonunu qRT-PCR veya immunofloresans ile konfirme edin.
      3. Hücre canlılığını belirleyin ve canlılığın %90'ın üzerinde olduğunu doğrulayın.
   2. Reaktifleri hazırlayın
      1. Tam kültür besiyerini 37 °C'ye önceden ısıtın.
      2. Fosfat tamponlu salini (PBS) 37 °C'ye önceden ısıtın.
      3. Taze Opti-MEM I besiyeri hazırlayın.
         NOT: Kullanımdan önce Opti-MEM I içerisine RNaz inhibitörü eklemeyin.
2. Gün 0: Transfeksiyon günü
   NOT: Reaktif hazırlığından transfekte edilen hücrelerin inkübasyonuna kadar yaklaşık 3 saat süre tanıyın.
   1. hTERT mRNA hazırlığı
      1. hTERT mRNA'sını buz üzerinde çözdürün. mRNA konsantrasyonunu ölçün ve 0,5 ile 1,0 µg/µL arasındaki konsantrasyonlara sahip preparatları kullanın.
      2. İstenen miktardaki hTERT mRNA'sını, kullanılan kültür formatına göre (Tablo 3) Opti-MEM I içerisinde dilüe edin. 0,5–1,0 U/µL son konsantrasyona ulaşacak şekilde RNaz inhibitörü ekleyin ve nazikçe karıştırın.
      3. Dilüe edilmiş mRNA'yı kompleks oluşumuna kadar buz üzerinde tutun.
         NOT: RNaz inhibitörünü kullanımdan hemen önce ekleyin. mRNA'yı RNaz inhibitörü ile birlikte saklamayın, çünkü dondurulduktan sonra aktivitesi azalır.
   2. Transfeksiyon reaktifi hazırlığı
      1. Steril RNaz-free bir tüpte 6,0 µL transfeksiyon reaktifini 100 µL Opti-MEM I ile birleştirin. Pipetleme yaparak nazikçe karıştırın.
      2. Karışımı oda sıcaklığında 5 dk inkübe edin.
         NOT: Büyük hTERT mRNA konstrüktları (~5 kb) için reaktif-mRNA oranlarını, 100 ng mRNA başına 0,4 ile 0,6 µL reaktif arasında optimize edin.
   3. mRNA-Lipid kompleks oluşumu
      1. Dilüe edilmiş hTERT mRNA çözeltisini (100 µL), dilüe edilmiş transfeksiyon reaktifi çözeltisine (106 µL) ekleyin. 5–6 kez pipetleyerek nazikçe karıştırın.
      2. Karışımı oda sıcaklığında 15–20 dk inkübe edin.
      3. Kompleksleşme süresini 30 dakikadan fazla uzatmayın.
      4. Hafif bulanık bir çözelti oluşumuyla başarılı kompleks oluşumunu doğrulayın.
         NOT: Hücre hazırlığını kompleksleşme süresi boyunca gerçekleştirin.
   4. Ters transfeksiyon için hücre hazırlığı
      1. Senesent hücre kültürlerinden kültür besiyerini aspire edin.
      2. Hücreleri önceden ısıtılmış PBS ile bir kez yıkayın (6 kuyucuklu plakanın her kuyucuğu için 2 mL).
      3. Kuyucuk başına 500 µL %0,05 trypsin-EDTA ekleyin.
      4. Hücreleri 37 °C'de 3–5 dk inkübe edin.
      5. Trypsin'i, serum içeren 3 mL tam besiyeri ile nötralize edin.
      6. Tek hücre süspansiyonu elde etmek için hücreleri nazikçe triture edin.
      7. Hemositometre veya otomatik hücre sayıcı kullanarak hücre sayısını belirleyin.
      8. Tam besiyeri içerisinde, kuyucuk başına 2,0–2,5 × 10⁵ hücre içeren bir süspansiyon hazırlayın.
         NOT: Senesent hücreler mekanik strese karşı oldukça hassas olduğundan uzun süreli tripsinizasyondan kaçının. Hücreleri süspansiyonda tutun; ters transfeksiyondan önce ön ekleme (pre-plating) yapmayın.
   5. Ters transfeksiyon
      1. Kültür plakası hazırlığı
         1. 6 kuyucuklu plakanın her kuyucuğuna 500 µL %0,01 poly-L-lysine ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dk inkübe edin.
         2. Kaplama çözeltisini kullanımdan hemen önce aspire edin.
         3. Her kuyucuğun merkezine 200 µL hTERT mRNA-lipid kompleksi ekleyin.
         4. Plakayı 37 °C ve %5 CO₂ altında 30 dk inkübe edin.
            NOT: Plaka kaplamasını kompleks oluşumu ve hücre hazırlığı ile paralel olarak gerçekleştirin.
      2. Hücre süspansiyonu hazırlığı
         1. 2,0–2,5 × 10⁵ hücreyi 1800 µL antibiyotiksiz tam besiyeri içinde süspanse edin.
         2. Homojen bir tek hücre süspansiyonu elde etmek için hücreleri nazikçe yeniden süspanse edin.
            NOT: Transfeksiyon sırasında antibiyotiksiz besiyeri kullanın.
      3. Hücrelerin kompleksler üzerine ekilmesi
         1. 1800 µL hücre süspansiyonunu doğrudan önceden oluşturulmuş hTERT mRNA-lipid komplekslerinin üzerine ekleyin.
         2. Hücrelerin eşit dağılması için plakayı her yöne 2–3 kez nazikçe eğin.
            NOT: Hücre eklemesinden sonra süspansiyonu pipetlemeyin, çünkü bu durum mRNA-lipid komplekslerini bozabilir.
      4. Hücre inkübasyonu
         1. Hücreleri %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de 6–8 saat inkübe edin.
         2. Transfeksiyondan 2–3 saat sonra hücre tutunmasını ışık mikroskobu ile izleyin.
         3. Hücrelerin eşit dağıldığını ve kültür yüzeyine tutunmaya başladığını doğrulayın.
            NOT: Aşırı sayıda yüzen hücre veya hücresel debris, transfeksiyonla ilişkili sitotoksisiteye işaret edebilir.

3. Sitotoksisitenin azaltılması

1. Hücre kaybı %20'yi aşarsa, transfeksiyon maruziyet süresini 48 s saate düşürün.
2. Hücre sağkalımını artırmak için transfeksiyon süresince kültürleri 10 µM ROCK inhibitörü Y-27632 ile destekleyin.
3. Transfeksiyondan 6–8 s sonra, kısmen yapışmış hücreleri minimum düzeyde rahatsız ederek transfeksiyon ortamını dikkatlice aspire edin. Her kuyucukta yaklaşık 100 µL kalıntı ortam bırakın.
4. Her kuyucuğa, %15 FBS ile desteklenmiş 1 mL taze, önceden ısıtılmış tam büyüme ortamı ekleyin.
5. Ortam değişiminden hemen sonra klorokinle nihai konsantrasyonu 10–20 µM olacak şekilde ekleme yapın.
6. Kültürleri, %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de 2 s daha inkübe edin.
7. Klorokin içeren ortamı taze tam büyüme ortamı ile değiştirin.
8. Kültürleri büyümenin devam etmesi için inkübatöre geri yerleştirin.
   NOT: Toparlanma dönemi boyunca hücre morfolojisini ve canlılığını izleyin. Aşırı hücre kopması veya debris oluşumu, transfeksiyonla ilişkili sitotoksisiteye işaret edebilir.

4. Transfeksiyon sonrası analiz

1. Transfeksiyondan 24–48 saat sonra TERT protein ekspresyonunu değerlendirin.
2. Standart laboratuvar prosedürlerine göre western blotting veya immünofloresan boyama ile TERT protein seviyelerini ölçün.
3. Aynı zaman aralığında uygun bir telomeraz aktivite testi kullanarak telomeraz aktivitesini ölçün.
   NOT: Geçici olarak iletilen hTERT mRNA'nın yıkımı nedeniyle telomeraz aktivitesi tipik olarak 48 saatten sonra azalır.
4. Transfeksiyondan 48–72 saat sonra monokrom multipleks kantitatif PCR (MMqPCR) veya eş değer bir telomer uzunluğu analiz yöntemi kullanarak telomer uzunluğunu değerlendirin.
   NOT: Başarılı hTERT mRNA iletimini takiben saptanabilir telomer uzaması gözlemlenebilir.
5. Transfeksiyondan 7 gün sonra senesansla ilişkili ve gençleşmeyle ilişkili fenotipleri değerlendirin
   1. Senesansla ilişkili β-galaktosidaz (SA-β-gal) aktivitesini ölçün.
   2. p16 ve p21 ekspresyon seviyelerini ölçün.
   3. Ki67 ekspresyonunu değerlendirin.
   4. Hücresel morfolojiyi ışık mikroskobu ile inceleyin.
      NOT: Senesansla ilişkili fenotiplerdeki ve proliferatif özelliklerdeki değişiklikleri değerlendirmek için işlem görmüş kültürleri, işlem görmemiş veya yalancı transfekte edilmiş senesent kontrollerle karşılaştırın.

5. Tekrarlanan dozlama protokolü (Opsiyonel)

1. Bölüm 2–4'te açıklandığı şekilde ilk transfeksiyonu gerçekleştirin.
2. Transfeksiyonları şu takvime göre tekrarlayın: 0. Gün: İlk transfeksiyon; 5. Gün: İkinci transfeksiyon; 10–12. Gün: Üçüncü transfeksiyon.
3. Hücreleri adherent kültürler olarak sürdürün ve sonraki transfeksiyonlardan önce tripsinizasyon yapmayın.
4. Bölüm 2.2.1–2.2.3'te açıklandığı şekilde taze hTERT mRNA–lipid kompleksleri hazırlayın.
5. Her kuyucuktaki kültür ortamını aspire edin.
6. Her kuyucuğa doğrudan 200 µL hTERT mRNA–lipid kompleksi ekleyin.
7. Kompleks eklemesinin hemen ardından 800 µL taze komplet F-10 medyumu ekleyin.
8. Hücreleri %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de 4–6 sa boyunca inkübe edin.
9. Transfeksiyon medyumunu taze komplet medyum ile değiştirin.
   NOT: Kümülatif transfeksiyona bağlı sitotoksisiteyi minimize etmek için işlemi en fazla üç transfeksiyon döngüsü ile sınırlandırın.

6. Forward transfeksiyon protokolü (2 µg/mL, 6 kuyucuklu format)

1. Gün −1: Hücre ekimi
   1. %0,05 trypsin-EDTA kullanarak senesen veya erken senesen fibroblastları ayırın.
   2. Trypsini tam kültür besiyeri ile nötralize edin.
   3. Hücre sayısını ve canlılığını belirleyin.
   4. Hücreleri, kuyuk başına 2,0–2,5 × 10⁵ hücre yoğunluğunda 6 kuyucuklu plakalara ekin.
   5. Hücreleri, yaklaşık %60–80 konflüenseye ulaşana kadar %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde, 37 °C'de gece boyunca inkübe edin.
2. Gün 0: hTERT mRNA–reaktif komplekslerinin hazırlanması
   1. Nükleozid modifiyeli hTERT mRNA'nın bir alikvotunu buz üzerinde çözdürün.
   2. hTERT mRNA'yı, steril RNaz-free bir tüpte (Tüp A) Opti-MEM ile 2 µg/mL nihai konsantrasyona kadar seyreltin.
   3. Tüp A'ya 0,5–1,0 U/µL nihai konsantrasyona ulaşacak şekilde RNaz inhibitörü ekleyin ve nazikçe karıştırın.
   4. Transfeksiyon reaktifini, ikinci bir RNaz-free tüpte (Tüp B) 100 ng mRNA başına 0,4–0,6 µL reaktif kullanacak şekilde Opti-MEM ile seyreltin.
   5. Tüp B'nin içeriğini, nazikçe karıştırarak damla damla Tüp A'ya ekleyin.
   6. Karışımı oda sıcaklığında 15–20 dk inkübe edin.
3. Gün 0: İleri transfeksiyon
   1. Hücrelerin %60–80 konflüenste olduğunu ve sağlıklı morfoloji sergilediğini doğrulayın.
   2. Kültür besiyerini aspire edin.
   3. Hücreleri 1–2 mL önceden ısıtılmış PBS ile bir kez yıkayın.
   4. Her kuyucuğa 0,5 mL önceden ısıtılmış tam veya serumu azaltılmış besiyeri ekleyin.
   5. İsteğe bağlı olarak, 10–20 µM nihai konsantrasyona ulaşacak şekilde klorokin ekleyin.
   6. Adım 6.2.6'da hazırlanan hTERT mRNA–reaktif komplekslerinden 0,5 mL'yi her kuyucuğa ekleyin.
   7. Komplekslerin eşit dağılması için plakayı nazikçe sallayın.
   8. Hücreleri %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde, 37 °C'de 4–6 saat inkübe edin.
      ​NOT: Senesen hücreler için gerekliyse inkübasyon süresini 6–8 saate uzatın.
   9. Transfeksiyon besiyerini aspire edin.
   10. Her kuyucuğa 2,0 mL taze tam besiyeri ekleyin.
   11. Bölüm 4'te açıklandığı şekilde transfeksiyon sonrası analizleri gerçekleştirin.
       NOT: İleri ve ters transfeksiyon koşullarını karşılaştırırken aynı hTERT mRNA lotunu, transfeksiyon reaktifini ve nominal dozu kullanın.

Sonuçlar

d2EGFP-T2A-hTERT modRNA, destabilize edilmiş bir EGFP (d2EGFP) raporunun, kendi kendini kesen bir T2A peptidi aracılığıyla insan TERT'e bağlandığı hibrit bir açık okuma çerçevesi olarak tasarlanmıştır. Tüm konstrüktlerin tam nükleotid ve protein dizileri Ek Dosya 1'de sunulmuştur. Translasyonel verimliliği ve mRNA stabilitesini artırmak için kodlama dizisi, sentetik bir 5′ translasyona uğramayan bölge (UTR) ve insan β-globinin 3′ UTR'si ile çevrelenmiştir (Şekil 1A). Ekspresyon kaseti ayrıca, T7 polimeraz prosesivitesini iyileştirmek ve erken transkripsiyon sonlanmasını azaltmak için tasarlanmış sentetik bir enzim stabilize edici dizi (Es) ve sentetik bir transkripsiyon artırıcı dizi (TEs) içermektedir. Bir T7 promotörünün aşağısına klonlanmasının ardından, anti-reverse kap analoğu (ARCA) ve modifiye nükleotidler (m5CTP ve ΨUTP) kullanılarak in vitro transkripsiyon gerçekleştirilmiş, ardından kaplı, poliadenile ve yüksek bütünlüklü d2EGFP-T2A-hTERT modRNA üretmek için enzimatik poli(A) kuyruklama (yaklaşık 120–200 nt) yapılmıştır (Şekil 1A).

Otomatik elektroforetik RNA analizi, transkriptin verimli bir şekilde sentezlendiğini doğrulayarak, birden fazla girdi miktarı boyunca minimum degradasyon ürünleri ile beklenen boyutta baskın bir RNA türü ortaya çıkarmış ve bu durum tam uzunluktaki modRNA'nın başarıyla üretilmesiyle uyumlu bulunmuştur (Şekil 1B). Erken senesent LF1 fibroblastlarının 2 µg/mL d2EGFP-T2A-hTERT modRNA ile transfekte edilmesinin ardından, hTERT proteini 24 s içinde saptanabilir hale gelmiş ve 48–96 s boyunca yüksek kalmaya devam ederek sentetik transkriptin sürdürülebilir translasyonunu göstermiştir (Şekil 1C). Bağlı d2EGFP raporer analizi, ters transfeksiyondan sonra güçlü bir floresans gösterirken, ileri transfeksiyondan sonra önemli ölçüde daha düşük floresans gözlemlenmiştir (Şekil 1D,E). Bu bulgular, erken senesent LF1 fibroblastlarında ters transfeksiyon yaklaşımı kullanılarak hTERT modRNA'nın iletiminin ve ekspresyonunun artırıldığını göstermektedir.

Erken senesans evresindeki LF1 fibroblastlarının 5 günlük aralıklarla d2EGFP-T2A-hTERT modRNA ile tekrarlanan ileri transfeksiyonu (FT), monokrom multipleks kantitatif PCR (MMqPCR) ile ölçüldüğü üzere, mock-transfekte edilen kontrollere kıyasla ortalama telomer uzunluğunda (rT/S) kademeli bir artış sağlamıştır (Şekil 2A). rT/S oranı her FT döngüsünden sonra artmış ve istatistiksel anlamlılık *P < 0.05'ten **P < 0.01'e yükselmiştir.

Ters transfeksiyon (RT) kullanılarak aynı dozaj programının uygulanması, telomer uzunluğunda daha belirgin bir artışla sonuçlanmıştır. rT/S oranı her bir RT döngüsünü takiben artmış ve yalancı-transfekte kontrollere kıyasla oldukça anlamlı farklara ulaşmıştır (*P < 0.05 ile ****P < 0.0001) (Şekil 2B). Üç tedavi döngüsü sonrası FT ve RT'nin doğrudan karşılaştırması, her iki yaklaşımın da yalancı-transfekte kontrollere göre rT/S değerlerini anlamlı şekilde artırdığını göstermiştir; ancak, RT aynı dozaj ve zamanlama koşulları altında FT'den daha büyük bir artış sağlamıştır (*P < 0.05, ***P < 0.001, ****P < 0.0001) (Şekil 2C).

Uzun süreli büyüme analizi, hTERT modRNA'nın tekrarlı iletiminin replikatif yaşam süresini uzattığını daha net bir şekilde göstermiştir (Şekil 2D). Bir, iki veya üç tedavi döngüsü alan hücreler, yalancı transfekte edilmiş kontrollere göre kademeli olarak daha yüksek kümülatif popülasyon iki katlanması sergilemiştir. Üç tur hTERT modRNA tedavisi alan kültürler, özellikle RT yoluyla, yaklaşık 250 gün boyunca kontrol büyüme eğrilerinden en büyük sapmayı göstermiştir (****P < 0.0001'e kadar). Popülasyon iki katlanması hesaplamaları Ek Dosya 2'de gösterilmiştir.

d2EGFP-T2A-hTERT modRNA ile transfekte edilen erken senesans evresindeki LF1 fibroblastları, transfeksiyondan 48 s sonrası güçlü TRAP merdiven oluşumu sergilerken; mock ve eGFP-modRNA uygulanmış hücreler yalnızca arka plan sinyali göstermiş, bu da telomeraz aktivitesinin ekzojen hTERT ekspresyonundan kaynaklandığını göstermiştir (Şekil 3A). Isıl ön işlem merdiven desenini ortadan kaldırarak assay spesifikliğini doğrulamıştır (Şekil 3B).

Zaman seyri analizi, telomeraz aktivitesinin transfeksiyondan sonra 24 ila 48 saat arasında zirve yaptığını ve ardından azalarak 72–96 saat civarında neredeyse bazal seviyelere döndüğünü göstermiştir (Şekil 3C). hTERT modRNA konsantrasyonunun 50'den 3.000 ng/mL'ye çıkarılması, TRAP sinyal yoğunluğunda buna paralel bir artışa yol açarak doza bağlı telomeraz aktivasyonunu kanıtlamıştır (Şekil 3D).

Yabani tip, katalitik olarak inaktif (CI) ve nükleer lokalizasyon sinyali eksik (ΔNLS) hTERT konstrüktları kullanılarak yapılan fonksiyonel analiz, yalnızca yabani tip hTERT'nin güçlü telomeraz aktivitesi oluşturduğunu göstermiştir. Benzer iletim koşullarına rağmen, hem CI hem de ΔNLS varyantları karşılaştırılabilir bir aktivite indükleyememiştir (Şekil 3E). Bu bulgularla uyumlu olarak, MMqPCR analizi, ortalama telomer uzunluğunda belirgin bir artışın (rT/S ≈ 1.4) yalnızca yabani tip hTERT modRNA alan hücrelerde meydana geldiğini ortaya koymuştur. CI-hTERT, ΔNLS-hTERT alan veya yalancı (mock) işlem gören hücreler bazal seviyelerde kalmıştır (rT/S ≈ 0.3; ****P < 0.0001) (Şekil 3F).

hTERT modRNA ile 5 günlük aralıklarla gerçekleştirilen üç ardışık ters transfeksiyon döngüsü, senesansla ilişkili β-galaktosidaz pozitif hücrelerin oranını önemli ölçüde azaltmıştır. Son transfeksiyondan 15 gün sonra, pozitif hücrelerin yüzdesi mock işlem gören kültürlerde yaklaşık %85'ten, hTERT işlem gören kültürlerde yaklaşık %40'a düşmüştür (***P < 0.001) (Şekil 4A).

Konfokal immünboyama, üç tur hTERT ters transfeksiyonu uygulanan hücrelerde, yalancı işlem görmüş kontrollere kıyasla Ki67 ekspresyonunun arttığını ortaya koyarak proliferatif aktivitenin arttığını göstermiştir (Şekil 4B). RT-qPCR analizi, hTERT işlemi sonrası yaşlanma ile ilişkili belirteçler olan p16 ve p21'in ekspresyonunun azaldığını daha net bir şekilde göstermiştir. Yalancı işlem görmüş erken yaşlı hücrelere kıyasla, p16 ekspresyonu yaklaşık 2,3 katla 0,7 kata, p21 ekspresyonu ise yaklaşık 11 katla 6 kata düşmüştür (**P < 0,01; ****P < 0,0001) (Şekil 4C,D). Ek Şekil 1, sadece klorokin (CQ) veya Y-27632 ile yapılan işlemin, yalancı transfekte edilmiş hücrelerde p16 veya p21 ekspresyonunu anlamlı şekilde değiştirmediğini daha ayrıntılı olarak göstermektedir. Buna karşın, üç tur hTERT ters transfeksiyonu sırasında CQ ve Y-27632 kombinasyonu, tek başına hTERT ters transfeksiyonuna veya her bir ajanın tek başına kullanımına kıyasla hem p16 hem de p21 ekspresyonunda en büyük azalmayı sağlamış; tekil ajan tedavileri ise orta düzeyde etkiler üretmiştir. Bu bulgular, CQ ve Y-27632'nin birlikte kullanımının, hTERT mRNA ters transfeksiyonu sonrası yaşlanma ile ilişkili belirteç ekspresyonundaki azalmayı artırdığını göstermektedir. Birlikte değerlendirildiğinde, bu bulgular hTERT mRNA'nın tekrarlanan ters transfeksiyonunun, erken yaşlı LF1 fibroblastlarında telomer uzamasını teşvik ettiğini, yaşlanma ile ilişkili belirteçleri azalttığını ve proliferatif özellikleri artırdığını kanıtlamaktadır.

Şekil 1: Erken senesens fazındaki LF1 fibroblastlarında d2EGFP‑T2A‑ hTERT mRNA'nın tasarımı, sentezi ve fonksiyonel doğrulaması. (A) hTERT ve destabilize edilmiş EGFP'nin eş zamanlı ekspresyonu için T2A peptid ile bağlanan d2EGFP kasetini içeren hibrit hTERT mRNA konstrüktünün şematik tasarımı. d2EGFP-T2A-hTERT ORF, insan β globin geninin (HBB) 3’ UTR'si ve sentetik 5’ UTR ile çevrelenmiştir. mRNA, modifiye nükleotidler kullanılarak sentezlenmiş ve son olarak bir poly (A) kuyruğu eklenmiştir. (B) Otomatik elektroforetik RNA analizi ile incelenen, in vitro transkripsiyon kullanılarak yüksek bütünlüğe sahip d2EGFP-T2A-hTERT mRNA'nın etkili sentezi. (C) 2 µg/mL d2EGFP-T2A-hTERT mRNA transfeksiyonunu takiben, otomatik kapiler tabanlı bir immunassay kullanılarak yapılan hTERT protein ekspresyonunun zaman seyri analizi. (D) Erken senesens fazındaki primer diploid fibroblastlarda (LF1), ileri transfeksiyon (FT) ve ters transfeksiyon (RT) arasındaki EGFP ekspresyonu ile değerlendirilen d2EGFP-T2A-hTERT mRNA transfeksiyonunun etkinliği ve ekspresyonu incelenmiştir. Ölçek çubuğu = 10 µm. (E) İleri veya ters transfeksiyondan sonra eGFP sinyalinin ortalama floresan yoğunluğu (MFI) kantifikasyonu. Her koşul için, 5 biyolojik tekrardan 4 farklı alanı kapsayan toplam 20 bireysel görüntü analiz edilmiştir. Veriler ortalamalar ± SD olarak sunulmuştur. **P < 0.01; Welch düzeltmeli eşleştirilmemiş t-testi ile değerlendirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Erken senesen LF1 fibroblastlarında tekrarlanan ileriye dönük versus geriye dönük hTERT mRNA transfeksiyonu sonrası telomer uzunluğu dinamikleri ve proliferatif yaşam süresi. (A) Ortalama telomer uzunlukları (rT/S), Telomere MMqPCR kullanılarak belirlendi. Erken senesen fibroblastlar, Popülasyon Katlanması (PD) #76'dan itibaren 5 günlük aralıklarla art arda üç kez d2EGFP-T2A-hTERT mRNA ile ileriye dönük transfekte (FT) edildi. Hata çubuğu SEM'i göstermektedir; n = 5 biyolojik replikat; *P < 0.05, **P < 0.01, yalnızca mock ile işlem görmüş hücrelerle karşılaştırıldığında. (B) (A)'ya benzer şekilde, erken senesen hücreler Popülasyon Katlanması (PD) #76'dan itibaren 5 günlük aralıklarla art arda üç kez d2EGFP-T2A-hTERT mRNA ile tekrarlayan transfekte (RT) edildiğinde rT/S değerleri değerlendirildi. Hata çubuğu SEM'i temsil eder; n = 7 biyolojik replikat; *P < 0.05, ****P < 0.0001, yalnızca mock ile işlem görmüş hücrelerle karşılaştırıldığında. (C) 5 günlük aralıklarla art arda 3 ileriye dönük ve geriye dönük transfeksiyon veya yalnızca mock sonrası ortalama telomer uzunluğu (rT/S) karşılaştırması. Hata çubuğu SEM'i temsil eder; n = 10 biyolojik replikat; *P < 0.05, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. (D) PD# 76'dan başlayarak 5 günlük aralıklarla bir, iki veya üç kez art arda 2 µg/ml d2EGFP-T2A-hTERT mRNA veya yalnızca mock ile transfekte edilen LF1 fibroblastlarının büyüme eğrileri. Siyah oklar işlem zamanlamalarını göstermektedir. Büyüme eğrileri, her bir popülasyon üç paralel olarak kültüre edilerek üç kez tekrarlanmıştır. Biyolojik örnek başına 3 teknik replikat, veriler ortalama ± SD olarak verilmiştir. *P < 0.05, **P < 0.01; ****P < 0.0001, Brown-Forsythe ve Welch's ANOVA testi ile değerlendirildiği üzere Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Katalitik olarak aktif, nükleusa lokalize hTERT mRNA, erken senesans aşamasındaki LF1 fibroblastlarında ölçülebilir telomer uzamasını teşvik etmek için tek başına yeterli olan, geçici ve doz bağımlı bir telomeraz aktivite artışını tetikler. (A) Erken senesans hücreleri mock, eGFP veya d2EGFP-T2A-hTERT mRNA ile transfekte edildi. Transfeksiyondan 48 s sonra, 20.000 hücreden hücre ekstraktı hazırlandı ve TRAP analizine tabi tutuldu. Reaksiyon ürünleri native PAGE üzerinde yürütüldü ve SYBR Green ile boyandı. (B) TRAP analizi kullanılarak ölçülen ısı aracılı telomeraz inaktivasyonu. (C) Erken senesans LF1 hücrelerinde hTERT mRNA transfeksiyonunu takiben zaman içinde telomeraz aktivitesinin analizi, aktivitenin 72 s içinde bazal seviyeye döndüğünü göstererek geçici enzim aktivasyonuna işaret etti. (D) Erken senesans LF1 hücreleri farklı miktarlarda d2EGFP-T2A-hTERT mRNA (0–3.000 ng/mL) aldı ve doza orantılı olarak artan telomeraz aktivitesi gösterdi. (E) 2 µg/ml TERT iletimi, erken senesans LF1 hücrelerinde telomeraz aktivitesini artırdı. ΔNLS, sitoplazmada çalıştığı ancak nükleusa transloke olmadığı için telomer uzamasını indüklemeden telomeraz aktivitesini kısmen artırırken, CI TERT mRNA bu etkiyi oluşturmadı ve bu da farklı fonksiyonel sonuçlara işaret etti. (F) Fonksiyonel TERT, nükleer lokalizasyon sinyali eksik (ΔNLS) ve katalitik olarak inaktif (CI) TERT ters transfeksiyonun erken senesans LF1 hücrelerinin ortalama telomer uzunlukları (rT/S) üzerindeki etkisi, telomer uzamasında nükleusa lokalize katalitik olarak aktif TERT'in önemini göstermektedir. Hata çubuğu SD'yi temsil eder; n = 7 biyolojik tekrar; Welch düzeltmeli tek yönlü ANOVA ile değerlendirildiğinde, sadece mock ile tedavi edilen hücrelere kıyasla ****P < 0.0001. RTA%-Relatif telomeraz aktivitesi (kontrolün %'si) her şeridin altında belirtilmiştir. TRAP örnek merdivenlerinin ve ITAS bandının (internal kontrol- IC) yoğunluk seviyeleri oranı, her şerit için şu formülle hesaplanmıştır: Aktivite _normalize = Merdiven yoğunluğu/ IC yoğunluğu ve her örnek, aşağıdaki formül kullanılarak pozitif kontrole (pozitif kontrol; H1299 2.500 hücre) yüzde olarak normalize edilmiştir: Relatif aktivite (%) = Aktivite _normalize (örnek)/ Aktivite _normalize (referans). Her adımda arka plan çıkarma işlemi uygulanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Optimize edilmiş hTERT mRNA ters transfeksiyonu, erken senesent LF1 fibroblastlarında senesansla ilişkili fenotipleri kısmen geri çevirir ve proliferatif belirteçleri yeniden sağlar. (A) Modifiye hTERT mRNA'nın 5 günlük aralıklarla art arda 3 kez transfekte edildiği β-gal eksprese eden erken senesent LF1 hücrelerinin temsilci görüntüleri. Ölçek çubuğu = 100 µm. β-gal ekspresyonu, son transfeksiyondan 15 gün sonra analiz edildi. Deneyler, örnek başına manuel olarak değerlendirilen >100 hücre ile üç kez gerçekleştirildi. (B) Proliferasyon belirteci Ki67 ile boyanmış erken senesent LF1 hücrelerinin temsilci konfokal (20x büyütme) görüntüleri. Ölçek çubuğu = 100 µm. hTERT ile 3 tur ters transfeksiyondan sonra Ki-67 ekspresyonunda belirgin artış. Ki67-pozitif çekirdeklerin yüzdesi 3× hTERT (RT) sonrası anlamlı şekilde artar. Grafik, Mock-transfekte edilen duruma göre normalize edilmiş Ki67-pozitif çekirdek sayısının ortalama ± SD değerini temsil etmektedir. Her durum için toplam 18 görüntü incelenmiş, biyolojik tekrarların her birinden 6 farklı alan seçilmiş ve toplam n = 3 biyolojik tekrar kullanılmıştır. ****P < 0.0001. (C) RT-qPCR (n = 6) ile değerlendirilen, 3× hTERT aracılı kısmi gençleşme sonrası senesans belirteci ekspresyonu. Tüm veriler ortalama ± SD değerlerini temsil eder. Welch düzeltmeli eşleşmemiş t-testi ile değerlendirildiğinde **P < 0.01; ****P < 0.0001. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bileşen	Hacim/Final Konsantrasyon
PCR kalıp DNA	200 –1000 ng
10× IVT Tamponu	2 μL
ATP (100 mM)	2 μL (10 mM final)
GTP (100 mM)	1,5 μL (7,5 mM final)
CTP (100 mM)	2 μL (final 10 mM)
m1Ψ-5′-TP (100 mM)	2 μL (10 mM final) (Normal UTP'yi 1:4-2:2 oranında (m1Ψ-5′-TP:UTP) ekleyerek psödo-UTP inklüzyonunu artırabilirsiniz.)
ARCA (10 mM)	4 μL (final 2 mM)
RNaz İnhibitörü (40 U/μL)	0,5 μL (20 U)
T7 RNA Polimeraz (50 U/μL)	2 μL (100 U)
Nükleaz içermeyen H₂O	20 μL

Tablo 1: Nükleozid modifiyeli hTERT mRNA sentezi için in vitro transkripsiyon (IVT) reaksiyonunun bileşimi. ARCA-kapaklı IVT sentezi için kullanılan reaksiyon bileşenleri ve nihai miktarlar listelenmiştir.

Bileşen	Hacim/Final Konsantrasyon
5 μg'a kadar saflaştırılmış mRNA	≤20 μL
10× Poly(A) Kuyruklama Tamponu	5 μL
ATP (10 mM	5 μL (1 mM final) (Zaten tamponun içinde olsa da, ekstra ilave poly A stabilizasyonuna yardımcı olur.)
Poly(A) Polimeraz (5 U/μL)	1 μL (5 U)
Nükleaz içermeyen H₂O	Toplam 50 μL olacak şekilde

Tablo 2: hTERT mRNA'sının post-transkripsiyonel modifikasyonu için kullanılan poli(A)-kuyruklama reaksiyonunun bileşimi. 120–200 nükleotitlik bir poli(A) kuyruğu oluşturmak için gereken reaktif hacimleri ve reaksiyon koşulları gösterilmektedir.

Parametre	12 Kuyucuklu Format	6 Kuyucuklu Format
Büyüme Yüzey Alanı	~3.8 cm²	~9.5 cm²
Kuyucuk Başına Besiyeri	1.0 mL	2.0 mL
Hücre Ekim Sayısı	5× 104–6.5× 104 Cells/ml	2.0–2.5 × 10⁵
Ortalama Hücre Sayısı (%100 konfluens düzeyinde)	5.7× 104–7.2× 104 Cells/ml	2.9–3 × 10⁵
mRNA Transfeksiyon Miktarı	750 –1000ng	2000–3500 ng
mRNA Transfeksiyon Ajanı	1.5 – 3.0 µL	4.75 – 7 µL
Opti-MEM içinde mRNA + transfeksiyon ajanının final hacmi	50 µL	200 µL

Tablo 3: 6 kuyucuklu ve 12 kuyucuklu kültür formatlarında hTERT mRNA iletimi için önerilen transfeksiyons parametreleri. İleri ve geri transfeksiyon deneyleri için kullanılan hücre ekim yoğunlukları, mRNA miktarları, transfeksiyon reaktanı hacimleri ve kompleks oluşum hacimleri özetlenmiştir.

Ek Şekil 1: Tekrarlayan hTERT mRNA ters transfeksiyonu sonrası yaşlanma ile ilişkili p16 ve p21 ekspresyonu üzerinde klorokin ve Y-27632'nin etkisi.(A) Klorokin (CQ), Y-27632 veya belirtildiği üzere bunların kombinasyonu ile işlem görmüş, mock işlem görmüş ve 3× hTERT ters transfeksiyonu (RT) uygulanmış LF1 fibroblastlarında p16 mRNA ekspresyonunun kantitatif RT-PCR analizi. (B) Aynı deneysel koşullar altında p21 mRNA ekspresyonunun kantitatif RT-PCR analizi. Transkript seviyeleri RpL13a'ya göre normalize edilmiş ve genç kontrol hücrelerine (PD#12) göre göreceli olarak ifade edilmiştir. Münferit veri noktaları biyolojik tekrarları temsil etmektedir. Veriler, her biyolojik tekrarda 5 teknik replika olmak üzere n = 2 biyolojik tekrardan elde edilen ortalamalar ± SD değerlerini temsil eder. İstatistiksel anlamlılık şekilde belirtilmiştir; ns, anlamlı değil. Brown-Forsythe ve Welch'in ANOVA testleri ile belirlendiği üzere *P < 0.05, **P < 0.01, ****P < 0.0001. Kısaltmalar: CQ, klorokin; RT, ters transfeksiyon; Y-27632, Rho ilişkili protein kinaz (ROCK) inhibitörü.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: hTERT ekspresyon konstrüktlerinin DNA ve protein dizileri.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: Popülasyon katlanma (PD) hesaplaması. Popülasyon katlanmaları (PD), N₀ ekilen hücre sayısını ve Nf hasat edilen canlı hücre sayısını temsil edecek şekilde PD = log₂ (Nf/N₀) formülü kullanılarak hesaplanmıştır. Kümülatif PD, pasajlar boyunca PD değerlerinin toplanmasıyla belirlenmiştir.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu çalışma, hücresel senesansı proliferatif fizyolojinin küçük bir varyasyonu yerine belirgin bir iletim problemi olarak yeniden çerçeveler ve senesent durumun biyofiziksel ve immünolojik kısıtlamalarına uygun bir telomeraz mRNA transfeksiyon stratejisi geliştirir. Senesent hücreler, katılaşmış, kolesterolce zenginleşmiş membranlar ve azalmış endositik aktivite sergileyerek nükleik asit iletiminin verimliliğinin önünde önemli bir engel oluştururlar. Ters-transfeksiyon yaklaşımını benimseyen bu protokol, senesent hücrelerin membran yeniden modellemesine uğradığı ve artmış membran plastisitesi sergilediği geçici adezyon döneminden yararlanarak, hücre-kompleks temasını potansiyeli artmış bir alım dönemiyle senkronize eder^3,4. Temsili sonuçlar, bu stratejinin konvansiyonel ileri transfeksiyona kıyasla hTERT modRNA iletimini ve ekspresyonunu iyileştirdiğini, böylece daha fazla telomer uzamasına ve daha belirgin gençleşme ilişkili fenotiplere yol açtığını göstermektedir.

Yöntemin temel özelliği; senesent hücrelerdeki üç ana engeli, yani yükselmiş doğuştan gelen bağışıklık sinyalizasyonunu, artan RNA yıkımını ve bozulmuş translasyon kapasitesini gidermek için tasarlanmış çok katmanlı bir mRNA mühendisliği stratejisidir^23,24,25. Psödouridin ve 5-metilsitidin kullanımı, TLR3, TLR7/8 ve RIG-I sinyal yollarının aktivasyonunu azaltırken aynı zamanda transkript stabilitesini ve translasyon verimliliğini artırır^13,26. ARCA kapsınlama ve poli(A) kuyruğu optimizasyonu, transkript stabilitesini ve translasyon çıktısını daha da iyileştirerek güçlü ancak geçici hTERT ekspresyonu sağlar. Önceki çalışmalarla uyumlu olarak, bu modifikasyonlar, ekzojen RNA iletimiyle ilişkili doğuştan gelen bağışıklık aktivasyonunu minimize ederken etkili telomeraz ekspresyonunu destekler.

Protokol ayrıca senesans geçirmiş kültürlerin karakteristik özelliği olan RNaz açısından zengin hücre dışı ortamı da ele almaktadır²⁷. RNA koruması; nükleozid modifikasyonu, lipid kompleks oluşumu ve transfeksiyon öncesinde hemen eklenen RNaz inhibitörü ile artırılmıştır. Ek olarak, ters transfeksiyon zamanlaması, senesans geçirmiş hücrelerin daha yavaş olan yapışma kinetiğine göre ayarlanarak, hücre adezyonu sırasında hücreler ile mRNA-lipid kompleksleri arasındaki etkileşimin uzaması sağlanmıştır. Bu modifikasyonlar, toplu olarak, normalde transfeksiyonu zor olan bir hücre popülasyonunda kargonun başarıyla alınma olasılığını artırmaktadır.

Endozomal kaçış, senesans hücrelerde mRNA iletimi için ikinci bir kritik darboğazı temsil eder. Senesans hücreler, artmış lizozomal içeriğe ve endositozla alınan kargoların yıkıcı bölmelere doğru artmış taşınmasına sahiptir^17,28. Transfeksiyon sonrası erken dönemde klorokinle geçici olarak maruz bırakma, endozomal kaçışı teşvik ederek ve hücre içine alınan mRNA'nın lizozomal yıkımını azaltarak fonksiyonel iletimi iyileştirir. Optimal doz ve maruz kalma süresi hücre tipleri arasında farklılık gösterse de, burada sunulan sonuçlar, endozomal kaçışın artırılmasının senesans fibroblastlarda iletim verimliliğini önemli ölçüde iyileştirdiğini göstermektedir.

Fonksiyonel düzeyde, tekrarlanan hTERT modRNA uygulamaları, göreli telomer uzunluğunda kümülatif artışlar sağlamış, replikatif yaşam süresini uzatmış ve yaşlanma ile ilişkili birden fazla fenotipi azaltmıştır. Tekrarlanan hTERT tedavisi alan hücreler, yalancı transfekte edilen kontrollere kıyasla azalmış SA-β-gal aktivitesi, azalmış p16 ve p21 ekspresyonu, artmış Ki67 ekspresyonu ve gelişmiş proliferatif kapasite göstermiştir. Önemli bir nokta olarak, telomeraz aktivitesi geçici kalmış ve transfeksiyondan sonraki birkaç gün içinde neredeyse bazal seviyelere dönmüştür. Bu geçici ekspresyon profili, ölçülebilir biyolojik etkileri teşvik edecek yeterli telomeraz aktivitesini sağlarken kalıcı genetik modifikasyondan kaçınmaktadır. Bununla birlikte, MMqPCR ile elde edilen göreli telomer uzunluğu ölçümlerinin, mutlak telomer uzamasını doğrudan nicelendirmediği unutulmamalıdır. Terminal kısıtlama fragman analizi, kantitatif floresan in situ hibridizasyon, Flow-FISH veya TeSLA metodolojilerini içeren gelecek çalışmalar, hTERT mRNA iletimini takip eden telomer uzunluğu dinamiklerinin daha hassas bir değerlendirmesini sağlayacaktır.

Birkaç kısıtlamanın göz önünde bulundurulması gerekir. Senesent hücre popülasyonları doğası gereği heterojendir ve senesans indüksiyon yöntemine, donör kaynağına ve kültür geçmişine bağlı olarak mRNA iletimine verdikleri yanıtta farklılıklar gösterebilirler. Sonuç olarak, transfeksiyon verimliliği ve gençleştirme sonuçları deneysel sistemler arasında farklılık gösterebilir. Ayrıca, telomeraz reaktivasyonu öncelikle hücresel yaşlanmanın telomer bağımlı yönlerini ele alır ve senesansın tüm karakteristik özelliklerini doğrudan düzeltmez. Başarılı telomer uzamasına rağmen epigenetik sürüklenme, mitokondriyal disfonksiyon, değişmiş proteostaz ve kronik inflamatuar sinyalizasyon gibi yaşlanmaya bağlı değişiklikler devam edebilir^29,30. Bu nedenle, bu protokol kapsamlı bir gençleştirme stratejisinden ziyade, telomer kaynaklı senesansı incelemek ve kısmen geri döndürmek için hedeflenmiş bir araç olarak görülmelidir.

Bu protokolde açıklanan parametreler, senesent insan hücreleri için pratik kılavuzlar olarak tasarlanmış olup, yayınlanmış çalışmalardan ve deneysel deneyimlerden elde edilen bilgilerle tekrarlayan optimizasyonlar yoluyla geliştirilmiştir. Hücre yoğunluğu, transfeksiyon reaktanı-mRNA oranı, kompleksleşme süresi ve endozomal kaçış koşulları dahil olmak üzere bazı faktörlerin, hücre tiplerine ve deneysel düzeneklere göre ayarlanması gerekebilir. Bu nedenle araştırmacıların, rapor edilen koşulları evrensel olarak uygulanabilir nihai noktalar olarak değil, optimizasyon için bir başlangıç noktası olarak değerlendirmeleri önerilir.

Özetle, bu protokol, yaşlanmanın fizyolojik özelliklerine göre optimize edilmiş bir ters transfeksiyon stratejisi kullanarak modifiye hTERT mRNA'nın senesent insan hücrelerine iletilmesi için tekrarlanabilir bir çerçeve sunmaktadır. Bu yaklaşım; geçici telomeraz reaktivasyonuna, ölçülebilir telomer uzamasına, replikatif yaşam süresinin uzamasına ve yaşlanma ile ilişkili fenotiplerin kısmen geri döndürülmesine olanak tanır. Gelecekteki çalışmalar, bu stratejinin diğer senesent hücre tiplerine uygulanabilirliğini değerlendirmeli, tamamlayıcı gençleştirme müdahaleleriyle kombinasyon yaklaşımlarını araştırmalı ve in vivo iletim platformlarına aktarımı incelemelidir. Bu haliyle söz konusu yöntem; telomer biyolojisinin, hücresel gençleştirmenin ve yaşlanma araştırmalarındaki senesens mekanizmalarının incelenmesi için değerli bir araç sağlamaktadır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Ham's F-10 Besin Karışımı	Thermo Fisher	11550043	Hücre kültürü medyumu.
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Kep Yapısı Analoğu	New England Biolab	S1411L	Çoğu RNA için kep yapısı stabiliteyi artırır, ekzonükleaz yıkımına karşı duyarlılığı azaltır ve mRNA başlama komplekslerinin oluşumunu destekler.
5-Metil-Sitidin-5´-Trifosfat (5-Metil-CTP)	New England Biolab	N0432S	Modifiye NTP'ler, in vitro transkripsiyon RNA'ları için immünojeniteyi azaltmak amacıyla yaygın olarak kullanılır.
6 Kuyucuklu Plaka	Corning	351146	Bağımsız deneysel koşullarda, orta ila büyük hacimdeki adherent veya süspansiyon hücrelerini büyütmek ve işleme tabi tutmak için.
Anti-Ki67 antikoru (SP6)	abcam	ab16667	Ki67 esas olarak proliferasyon halindeki hücrelerde eksprese edilir.
Hücresel Senesans Analiz Kiti (SA-beta-gal Boyama)	cellbiolabs	CBA-230	SA-β-gal boyama analizi ile senesent hücrelerin tanımlanması
DNA LoBind 0.5ml Tüpler	Eppendorf	022431005	DNA ve RNA'nın herhangi bir kayıp olmadan verimli bir şekilde geri kazanılması için
DNA LoBind 1.5ml Tüpler	Eppendorf	22431021	DNA ve RNA'nın herhangi bir kayıp olmadan verimli bir şekilde geri kazanılması için
DNase I, RNase-free (1 U/μL)	Thermo Fisher	EN0521	RNase-free DNase I, tek ve çift sarmallı DNA'yı sindiren bir endonükleazdır.
E. coli Poly(A) Polimeraz	New England Biolab	M0276S	Escherichia coli'de, Poly(A) Polimeraz I (PAP I), öncelikle RNA moleküllerinin 3' ucuna kalıptan bağımsız olarak adenozin monofosfat (AMP) kalıntılarının eklenmesi için bir katalizör görevi görür.
Fetal Bovin Serum	Thermo Fisher	A5256701	Hücre kültürü serum takviyesi
HiScribe T7 ARCA mRNA Kiti	New England Biolab	E2065S	HiScribe T7 ARCA mRNA Kiti (kuyruklama ile), in vitro ortamda ARCA kepli ve poly(A) kuyruklu mRNA'ların hızlı üretimi için tasarlanmıştır. Kepli mRNA'lar, T7 RNA Polimeraz kullanılarak Anti-Reverse Cap Analoğu'nun (ARCA) ko-transkripsiyonel entegrasyonu ile sentezlenir.
CleanCap Reagent AG İçeren HiScribe T7 mRNA Kiti	New England Biolab	E2080S	CleanCap Reagent AG içeren HiScribe T7 mRNA Kitleri, reaksiyon başına tipik olarak ≥90 μg verimle bir veya birden fazla transkriptin hızlı ve kolaylaştırılmış üretimini sağlar,
LongAmp Hot Start Taq DNA Polimeraz	New England Biolab	M0534S	LongAmp Hot Start Taq DNA Polimeraz, uzun amplikonlarla olağanüstü performans sunar.
M-MuLV Ters Transkriptaz	New England Biolab	M0253L	M-MuLV Ters Transkriptaz, kalıp olarak ya RNA (cDNA sentezi) ya da tek sarmallı DNA kullanarak bir primerden başlayan tamamlayıcı bir DNA sarmalı sentezler.
Monarch Spin RNA Temizleme Kiti (50 μg)	New England Biolab	T2040L	Monarch® Spin RNA Temizleme Kiti'nin (50 μg) temel işlevi, enzimatik reaksiyonlardan veya ekstraksiyon karışımlarından 50 μg'a kadar yüksek kaliteli RNA'yı saflaştırmak ve konsantre etmektir.
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	New England Biolab	E2621L	NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix, fragman uzunluğu veya uç uyumluluğuna bakılmaksızın birden fazla DNA fragmanının sorunsuz bir şekilde birleştirilmesine olanak tanır. Kullanım kolaylığı, esnekliği ve basit master-mix formatı sayesinde sentetik biyoloji topluluğunun yanı sıra birden fazla fragmanın tek adımda klonlanmasında da fayda sağlar.
Opti-MEM - Azaltılmış Serum Medyumu	Thermo Fisher	31985070	Lipid-yük kompleks oluşumu sırasında hücre transfeksiyon verimliliğini maksimize etmek için. Memeli hücrelerini yüksek canlılıkta tutarken standart serum takviyesi ihtiyacını azaltan, optimize edilmiş ve kimyasal olarak tanımlanmış bir ortam görevi görür
PBS, pH 7.4	Thermo Fisher	10010023	pH 7.4'teki Fosfat Tamponlu Salin'in (PBS) temel fonksiyonel kullanımı, memeli hücreler ve biyolojik moleküller için stabil bir pH ve ozmotik denge sağlamaktır.
PCR Şeritleri	Thermo Fisher	AB0776	PCR şerit tüplerinin (genellikle 8'li veya 12'li şerit formatında) temel fonksiyonel kullanımı, yüksek kapasiteli termal döngüler sırasında küçük hacimli sıvı reaksiyonlarını tutmaktır.
Poly-L-Lysine Hidrobromür	Millipore Sigma	P4707-50ML	Hücre yapışması için Poly-L-Lysine (PLL) Hidrobromür'ün temel fonksiyonel kullanımı, yüksek yapışkanlığa sahip, pozitif yüklü bir substrat oluşturmak için negatif yüklü katı yüzeyleri (cam veya plastik gibi) kaplamaktır.
Pseudouridine-5´-Trifosfat (Pseudo-UTP- ΨUTP)	New England Biolab	N0433S	Pseudouridine-5´-Trifosfat (Pseudo-UTP), in vitro transkripsiyon RNA'ları için immünojeniteyi azaltmak amacıyla yaygın olarak kullanılır.
Ribonükleotid Çözelti Seti	New England Biolab	N0450L	ATP, GTP, CTP ve UTP'den oluşan dört ayrı çözelti
ROCK inhibitörü Y-27632 (Dihidroklorür)	Stem cell technologies	72302	Y-27632, Rho-ilişkili, coiled-coil içeren protein kinazın (ROCK) hücreye nüfuz edebilen, yüksek etkili ve seçici bir inhibitörüdür. Y-27632, katalitik bölgeye bağlanma için ATP ile yarışarak hem ROCK1'i (Ki = 220 nM) hem de ROCK2'yi (Ki = 300 nM) inhibe eder
RT-PCR Derecesinde Su	Thermo Fisher	AM9935	RT-PCR Derecesinde Suyun (genellikle Nükleazdan Arındırılmış Su olarak adlandırılır) temel fonksiyonel kullanımı, herhangi bir kontaminasyonun örneği bozacağı veya amplifikasyonu inhibe edeceği hassas enzimatik analizler için ultra saf çözücü olarak hizmet etmektir.
SUPERase·In RNase İnhibitörü	Thermo Fisher	AM2694	SUPERase In RNase İnhibitörü, RNase A, B, C, 1 ve T1 dahil olmak üzere en yaygın ve sorunlu RNase'lere kovalent olmayan şekilde bağlanan ve onları inhibe eden, insan dışı kökenli protein tabanlı bir inhibitördür.
SYBR Green I Nükleik Asit Jel Boyası	Thermo Fisher	S7563	SYBR™ Green I Nükleik Asit Jel Boyası'nın temel fonksiyonel kullanımı, agaroz veya poliakrilamid jellerdeki çift sarmallı DNA'yı (dsDNA) görselleştirmek ve kantifiye etmektir.
TransIT-mRNA Transfeksiyon Kiti	Mirusbio/ Millipore Sigma	MIR 2250	Büyük RNA'lar için yüksek verimli, düşük toksisiteli bir transfeksiyon reaktifi
TRAPeze Telomeraz Tespit Kiti	Millipore Sigma	S7700	TRAP (Telomeric Repeat Amplification Protocol) analizi, memeli hücrelerinde ve doku örneklerinde telomeraz aktivitesini tespit etmek ve ölçmek için yaygın olarak kullanılan hassas, PCR tabanlı bir yöntemdir. Üç ana adımdan oluşur: telomerik tekrarların telomeraz tarafından uzatılması, bu ürünlerin PCR kullanılarak amplifikasyonu ve ardından tespiti.
Trypsin-EDTA (0.05%), fenol kırmızısı	Thermo Fisher	25300054	Rutin hücre pasajlama (subkültür) ve hasat sırasında adherent memeli hücreleri kültür kaplarından ayırmak için.