Mitokondriyal Nakil İçin Fare İskelet Kasından Türetilen Fonksiyonel Mitokondrilerin İzolasyonu, Saflaştırılması ve Karakterizasyonu

Özet

Fare iskelet kaslarından mitokondrilerin izolasyonu, saflaştırılması ve fonksiyonel karakterizasyonu ile mitokondriyal nakil uygulamalarının değerlendirilmesi için tripsin sindirimi ile diferansiyel santrifüjasyonu birleştiren standart bir protokol oluşturuldu.

Özet

Mitokondriler, eukaryotik hücrelerde enerji metabolizması, sinyal iletimi ve hücresel homeostazı düzenleyen temel organellerdir. Mitokondriyal disfonksiyon, birçok hastalığın patogenezine katkıda bulunur ve mitokondriyal naklinin rejeneratif bir tedavi stratejisi olarak geliştirilmesini teşvik etmiştir. Mitokondriyal naklin başarılı uygulanması, yüksek arındırılmış ve işlevsel olarak sağlam mitokondrilerin bulunabilirliğine bağlıdır. İskelet kası, yüksek mitokondriyal içeriği, metabolik aktivitesi ve erişilebilirliği nedeniyle uygun bir donör kaynağıdır. Bu çalışma, fare iskelet kasından fonksiyonel mitokondrilerin izolasyonu, arındırılması ve karakterizasyonu için standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir bir protokol oluşturdu ve bunların mitokondriyal nakilde kullanımını değerlendirdi. İşlem iki ana aşamadan oluşuyordu. İlk olarak, mitokondriler C57BL/6 farelerinin iskelet kasından trypsin sindirimi ile izole edildi ve ardından diferansiyel santrifüjleme yapıldı. İkinci olarak, izole mitokondriler saflık, ultrayapı ve fonksiyonel aktiviteyi değerlendirmek için karakterize edildi. Mitokondriyal saflık, bicinchoninic acid (BCA) protein nicelendirmesi ve Western blot analiziyle değerlendirildi. Ultrastruktural bütünlük, iletim elektron mikroskopisiyle incelendi. Fonksiyonel aktivite, JC-1 ve mitokondriyal floresan etiketleme ile oksijen tüketimi, ATP üretim kapasitesi ve solunum kontrol oranı ölçümleriyle değerlendirildi; yüksek çözünürlüklü bir respirometri sistemi kullanıldı. İzole edilen mitokondriler, korunmuş membran potansiyeli, sağlam ultrayapı ve stabil solunum aktivitesi sergiledi; bu da sonraki fonksiyonel çalışmalar ve mitokondriyal nakil uygulamaları için uygunluk gösterdi.

Giriş

Mitokondriler, adenozin trifosfat (ATP) üretiminin başlıca yerleridir ve apoptoz, kalsiyum homeostazı ve reaktif oksijen türlerinin (ROS) metabolizmasında merkezi roller oynar. Bu nedenle, mitokondrilerin fonksiyonel bütünlüğü, hücresel homeostazın korunması ve hücre^{kaderinin belirlenmesi için kritiktir 1,2}. Mitokondriyal DNA (mtDNA) mutasyonları ve elektron taşıma zinciri (ETC) anormallikleri dahil olmak üzere mitokondriyal disfonksiyon, enerji metabolizmasının bozulmasına, oksidatif strese ve düzensiz apoptoza^{yol açar 3,4}. Bu anormallikler, kalıtsal mitokondriyal bozukluklar, nörodejeneratif hastalıklar ve kardiyovasküler hastalıklar dahil olmak üzere geniş bir hastalık yelpazesiyle^{ilişkilidir 5,6}. Mitokondriyal işlev bozukluğu için geleneksel tedavi stratejileri, örneğin antioksidanlar ve metabolik kofaktorlar, genellikle sınırlı etkinlik sağlar çünkü semptomları hafifletmek ve mitokondriyal fonksiyonu doğrudan geri^{getirmeden 7,8}. Sonuç olarak, mitokondriyal nakil rejeneratif tıpta umut vadeden bir terapötik yaklaşım olarak ortaya çıkmıştır. Bu strateji, mitokondriyal aktivite ve hücresel enerji metabolizmasını yeniden sağlamak için sağlam dış mitokondrilerin hasarlı veya işlevsiz hücrelere teslim^{edilmesini içerir 9,10}. Önceki çalışmalar, dış mitokondrilerin alıcı hücreler tarafından içselleştirilip endogen mitokondriyal ağa dahil edilebileceğini, bunun sonucunda biyoenerjik işlevin iyileşmesi ve hücre hayatta kalmasının arttığı^{gösterilmiştir} 11,12,13.

İskelet kası, yüksek mitokondriyal içeriği, metabolik aktivitesi ve erişilebilirliği nedeniyle mitokondriyal izolasyon için uygun bir donör^{olarak kabul edilir} 14,15,16. Mitokondriyal nakil, mitokondriyal izolasyon, arındırma, fonksiyonel karakterizasyon ve alıcı hücrelere verimli teslimat gibi birkaç kritik adım gerektirir. Ancak, bugüne kadar bildirilen protokoller arasında, özellikle doku homojenizasyonu, enzimatik sindirim, sıcaklık kontrolü ve arıtma işlemlerinde önemli metodolojik değişkenlik bulunmaktadır. Bu tür değişkenlik, mitokondriyal verim, saflık ve fonksiyonel bütünlüğü etkileyebilir ve böylece deneysel tekrarlanabilirliği sınırlayabilir.

Metodolojik tutarlılığı ve tekrarlanabilirliği artırmak için, bu çalışma fare iskelet kasından fonksiyonel mitokondrilerin trypsin sindirimi ve diferansiyel santrifüjleme kullanılarak izole edilmesi ve karakterizasyonu için standartlaştırılmış bir protokol sunmaktadır. İzole mitokondriler, bisinkonik asit (BCA) protein nicelikleri, Western blotting, geçirim elektron mikroskopisi, floresans tabanlı membran potansiyel testleri ve yüksek çözünürlüklü respirometri kullanılarak saflık, ultrastruktural bütünlük ve fonksiyonel aktivite açısından değerlendirildi. Ayrıca, alıcı hücrelerin izole mitokondri alımı, mitokondriyal nakil uygulamaları için uygunlukları değerlendirilmiştir. Bu protokol, sonraki deneysel çalışmalar için fonksiyonel iskelet kasından köken alan mitokondriler elde etmek için tekrarlanabilir bir iş akışı sağlar.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, belirli bir patojensiz (SPF) tesiste gerçekleştirildi ve Hava Kuvvetleri Tıp Üniversitesi Üçüncü Bağlı Hastanesi Hayvan Etik ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı (Onay No.: IACUC-2024kq-065).

Erkek C57BL/6 fareleri (6-8 haftalık, 18-20 g) Hava Kuvvetleri Tıp Üniversitesi Laboratuvar Hayvan Merkezi'nden (Üretim Lisansı: SCXK (Shaanxi) 2024-002) satın alınmıştır. Fareler, 20-26 °C sıcaklıkta, %40-70 göreli nem, 12 saat ışık-karanlık döngü ve saatte en az 15 hava değişimi olan bireysel havalandırmalı kafeslerde (IVC) tutuldu. Sterilize edilmiş beslenme, içme suyu ve çevresel zenginleştirme sağlandı.

Protokolde kullanılan reaktifler, kimyasallar ve deneysel aletler Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Hayvan kurbanı ve doku koleksiyonu

1. Fareyi hava geçirmez bir ötenazi odasına yerleştirin ve dakikada %30-70 hacimli karbondioksit (CO₂) soluma yoluyla ötenazi yapın.
2. Ölüm, spontan nefes ve kalp atışının durması, gözbebeği reflekslerinin kaybı ve mekanik uyarıya yanıt olmaması ile doğrulan.
3. Ötenanize edilmiş C57BL/6 farelerini dezenfeksiyon için %75 etanole 5 dakika daldırın.
   NOT: Alkol kaynaklı doku fiksasyonunu ve hücresel hasarı önlemek için, daldırma süresini 10 dakika ile sınırlayın. Protokol boyunca taze doku kullanın çünkü dondurma mitokondriyal canlılığı ve işlevsel bütünlüğü tehlikeye atar.
4. Faresi, karın ve arka uzuv bölgelerini tamamen açığa çıkarmak için laminar akış başlığı içinde steril bir Petri kabına yerleştirin.
5. Penss kullanarak genital bölgeye yakın alt karın derisini kaldırın ve küçük bir kesi yapın. Deriyi alttaki dokudan ayırmak için küt diseksiyon yapın. Kesiyi orta çizgi boyunca yukarıdan ayak bileğine ve yan tarafa doğru uzatarak arka ayak kas gruplarını tamamen açığa çıkarın.
6. Uyluğun ön tarafındaki quadriceps femoris kasını tespit edin ve kas liflerinin yönünde kesik diseksiyon ile kası dikkatlice ayırın. Kas dokusunu tamamen izole etmek için distal patellar bağ ve proksimal tendonu kesin.
   NOT: Dokuyu önceden soğutulmuş fosfat-tamponlu tuzlu (PBS) ve %2 penisillin-streptomisin takviyesiyle üç kez yıkayarak her yıkamada taze bir Petri kabı kullanın; böylece kirlenme en aza indirilebilir.
7. İzole edilen kas dokusunu hemen önceden soğutulmuş PBS'ye yerleştirin ve doku yüzeyinden saç ve kan çıkarmak için iyice durulayın.
8. Steril gazlı bezle fazla nemi dokudan nazikçe silin. Dokuyu 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine ayırın ve örnekleri tartın. Hazırlıklar arasında tutarlılığı korumak için numune başına yaklaşık 100 mg doku kullanın.

2. Doku doğraması ve homojenleştirme

1. Step 1.8'den alınan dokuyu içeren mikrosantrifüj borusunu buzun üzerine yerleştirin. Dokuyu steril makasla yaklaşık 1-2^{mm 3} boyutunda küçük parçalara indirin.
2. 8 hacim önceden soğutulmuş %0,25 tripsin ekleyin ve doku parçalarını 15 dakika boyunca buzda sindirin.
   NOT: Gerekli tripsin hacmini doku kütlesine göre hesaplayın (1 mg ≈ 1 μL). Örneğin, %0,25 tripsin içeren %0,25 640 μL 80 mg doku ekleyin.
3. Karışımı 1.000 × g sıcaklığında 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Üst yüzeyi atın ve doku pelletini koruyun. Pellet, D-mannitol (215 mM), sukroz (75 mM), HEPES (20 mM), EGTA (1 mM) ve yağ asidi içermeyen sığır serum albümini (%0,5 w/v) içeren 1 mL önceden soğutulmuş mitokondriyal izolasyon tamponuna yeniden süzülür.
4. Süspansiyonu buz üzerinde tutulan cam homojenizatora aktarın. Dokuyu 10-12 nazik yukarı-aşağı hareketle homojenleştirin, askı bulanık hale gelene kadar.
   NOT: Homojenizatorun alt kısmında cam havacını yan tarafa döndürmekten kaçının, çünkü aşırı mekanik kuvvet mitokondriyal zarlara zarar verebilir ve mitokondriyal işlevi bozabilir.

3. Diferansiyel santrifüjleme

1. Homojenatı 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 1.000 × g sıcaklıkta 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
2. Süpernatantı taze 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 12.000 × g sıcaklıkta 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın, böylece ham mitokondriyal pellet elde edilir.
   NOT: Süpernatantı dikkatlice 1 mL bir şırınga ile toplayın, böylece pellet ve kalıntı doku kalıntılarını rahatsız etmeyin.

4. Mitokondriyal arındırma ve depolama

1. Ham mitokondriyal pelleti, sukroz (250 mM), HEPES (10 mM, pH 7.4), EGTA (1 mM) ve sığır serum albümini (%0.15 w/v) içeren önceden soğutulmuş yıkama tamponu içinde nazikçe askıya alın. Süspansiyonu 1.000 × g ile 5 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın.
2. Süpernatantı taze bir santrifüj tüpüne aktarın ve 12.000 × g sıcaklığında 10 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın ve saflaştırılmış mitokondriyal pellet elde edin.
   NOT: Mümkün olduğunda hemen taze izole edilmiş mitokondrileri kullanın. Kısa süreli depolama 4 °C'de veya uzun süreli depolama −80 °C'de, mitokondriyal depolama tamponunda sukroz (0,25 M), Tris-MOPS (10 mM, pH 7,4) ve EGTA (0,1 mM) mümkündür. Ancak, donma mitokondriyal enzimatik aktivite ve solunum fonksiyonunu bozabilir. Dondurulmuş örnekleri öncelikle protein analizi için kullanın.

5. Mitokondriyal ve sitozolik protein ekstraksiyonu ve BCA nicelendirmesi

1. Mitokondriyal protein ekstraksiyonu
   1. Saflaştırılmış mitokondriyal pelleti 100 mg başlangıç dokusu başına 50 μL RIPA lizin tamponunda yeniden süzülün ve süspansiyonu 15 dakika boyunca buzda kuluçka edin.
   2. Lizat yaklaşık 14.000 × g sıcaklığında 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüj edilir. Süpernatantı yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktararak mitokondriyal protein fraksiyonu elde edilir.
2. Sitozolik protein ekstraksiyonu
   1. 4.2. adımda elde edilen sitozolik süpernatantı 12.000 × g ile 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüj edin. Üst kısım atılır ve pellet zenginleştirilmiş sitozolik fraksiyon olarak kalır.
   2. Sitozolik pelleti 50 μL RIPA lizin tamponunda yeniden askıya alın ve örneği Adımlar 5.1.1-5.1.2'de açıklandığı şekilde işleyin.
      NOT: Liz tamponunu proteaz inhibitörleriyle taze hazırlayın ve protein bozulmasını en aza indirmek için buz üzerinde tüm işlemleri uygulayın. Bu aşamada kullanılan mitokondriler taze veya dondurulmuş olabilir.
3. BCA protein nicelenmesi
   1. BCA çalışma çözümünü reaktif A ve reaktif B'yi 50:1 (v/v) oranında karıştırarak hazırlayın. 96 kuyruklu bir plakanın her kuyusuna 200 μL çalışma çözeltisi ekleyin.
      NOT: BCA çalışma çözeltisini hemen kullanmadan önce hazırlayın ve oda sıcaklığında 1 saat içinde kullanın.
   2. Sığır serum albümini (BSA) stok çözeltisini (2 mg/mL) 0,5 mg/mL'ye seyreldin ve solüsyeni kullanıma kadar buzda tutun.
   3. Standart eğrisi, ayrı kuyular için 20, 19, 18, 16, 12, 8, 4 veya 0 μL BSA çözeltisi ekleyerek hazırlayın. Son hacmi NaCl çözeltisi kullanarak 20 μL'ye ayarlayın.
   4. Bir kuyuya 4 μL mitokondriyal protein ve 16 μL NaCl çözeltisi ekleyin. Başka bir kuyu setine 4 μL sitozolik protein ve 16 μL NaCl çözeltisi ekleyin.
   5. Her kuyuya 200 μL BCA çalışma çözeltisi ekleyin ve plakayı 37 °C'de karanlıkta 30 dakika kuluçka yapın. 562 nm'de mikroplaka okuyucu kullanarak soğurma noktasını ölçün.
   6. Korelasyon katsayısı (R²) ≥ 0.999 olan bir protein standart eğrisi oluşturulur. Standart eğriden absorbans değerlerini interpolasyon yoluyla protein konsantrasyonlarını (μg/μL) hesaplayın.

6. İskelet kasından kaynaklanan mitokondrilerin saflık değerlendirmesi

1. Mitokondriyal ve sitozolik protein örneklerini son konsantrasyon seviyesi 1,5 μg/μL olarak seyreldin. 30 μg protein ve 4 × yükleme tamponu içeren 20 μL reaksiyon karışımı hazırlayın. Kalan hacmi NaCl çözeltisiyle ayarlayın. Örnekleri 10 dakika kaynatın ve −80 °C'de saklanın.
2. %4%-20 gradyanlı precast jeller kullanılarak ayrı protein örnekleri alın. 140-150 V'da 50 dakika boyunca elektroforez yapın.
3. PVDF membranını (0,22 μm) metanolde 1 dakika boyunca aktive edin. Proteinleri 400 mA'da hızlı transfer tamponu kullanarak 30 dakika aktarın.
4. PVDF membranını transfer sandviçinden çıkarın ve TBST'de 5 dakika boyunca yıkayın. Zarı oda sıcaklığında %5 yağsız sütle 1 saat boyunca nazikçe sallayarak kapatın.
5. Birincil antikorları (COX IV, sitokrom c, β-aktin) 1:1.000 oranında antikor seyreltme tamponunda seyreltirin. Membranı birincil antikorlarla gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
6. Zarı TBST ile üç kez, her yıkamada 10 dakika boyunca yıka.
7. Zarı, oda sıcaklığında 1:10.000 derecesinde seyreltilmiş ikincil antikorla 1 saat kuluçka yapın.
8. Zarı TBST ile üç kez, her biri 10 dakika boyunca yıkayın. Lekeyi geliştir ve görüntüleri yakalay.

7. İskelet kasından kaynaklanan mitokondrilerin MitoTracker boyama

1. Boyama çalışma çözeltisini, kullanımdan hemen önce önceden ısıtılmış ortamda 200 nM nihai konsantrasyona kadar seyreltin.
2. Mitokondriyal peleti 100 μL çalışma çözeltisiyle yeniden askıya alın ve 37 °C'de karanlıkta 20 dakika kuluçka yapın.
3. İnkubasyondan sonra beş hacim önceden soğutulan depolama tamponu ekleyin. Süspansiyonu 12.000 × g ile 10 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj edin ve bağlanmamış boya içeren üst yüzeyi atabilirsiniz.
4. Boyalı mitokondriyal süspansiyonun bir aliquotunu cam slayta aktarın ve örneği bir örtü ile örtün.
5. Kırmızı floresan mitokondriyal boya tespiti için uygun uyarılma ve emisyon ayarlarıyla lazer taramalı konfokal mikroskop kullanarak floresan görüntüleri yakalayın.

8. JC-1 boyama kullanarak mitokondriyal membran potansiyelinin değerlendirilmesi

1. CCCP (karbonil siyanür m-klorofenil hidrazon) tedavi grubu
   1. Mitokondriyal süspansiyonu CCCP ile son konsantrasyon 10 μM'de işleyin ve mitokondriyal membran potansiyelini dağıtmak için 20 dakika kuluçka yapın.
   2. CCCP ile işlenmiş mitokondriyal süspansiyonu 250 μL JC-1 boyama çözeltisi ile 37 °C'de 20 dakika boyunca hafif çalkalama ile inkubasyon yapın.
2. JC-1 tedavi grubu
   1. Mitokondriyal peleti 100 μL JC-1 çalışma çözeltisine yeniden süsle ve 37 °C'de ışıktan korunarak 20 dakika kuluçka yapın.
   2. 1× JC-1 boyama tamponunu 5× stok çözeltisini damıtılmış suyla 2:8 (v/v) oranında seyreltirerek hazırlayın ve tamponu buz üzerinde tutun.
   3. Boyama çözeltisini çıkarın ve mitokondriyal pelleti önceden soğutulmuş 1× JC-1 boyama tamponu ile iki kez yıkayın.
   4. PBS'deki lekelenmiş mitokondrileri tekrar askıya alın ve lazer taramalı konfokal mikroskopla görüntüleyin. Yeşil floresan JC-1 monomerleri ve kırmızı floresan JC-1 agregalarının tespiti için uygun uyarılma ve emisyon ayarları kullanın.

9. Geçirim elektron mikroskopisiyle izole iskelet kası mitokondrilerinin ultrastruktural analizi

1. Taze izole mitokondrileri, 0,2 M fosfat tamponunda (pH 7,4) hazırlanmış %2,5 glutaraldehit ile sabitleyin ve örnekleri gece boyunca 4 °C'de kuluçka altına alın.
2. Örnekleri 0,1 M fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS, pH 7,4) ile yıkayın ve numuneleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca %1 osmiyum tetrooksitle sabitleyin.
3. Örnekleri gradasyonlu etanol serisi ile kurutun, ardından epoksi reçinede infiltrasyon, gömme ve polimerizasyon uygulanır.
4. Gömülü örnekleri 50-70 nm kalınlığında ultramikrotom kullanarak kesimlenin.
5. Kesitleri uranil asetat ve kurşun sitratla çift boyandırın. Örnekleri iletim elektron mikroskobu kullanarak gözlemleyin ve görüntüleyin.

10. İskelet kasından kaynaklanan mitokondrilerin hücresel alımı

1. Culture NCTC klonu 929 (L929; RRID: CVCL_0462) Ticari tedarikçiden alınan hücreler, %10 fetal sığır serumu ve %1 penisilin streptomisin ile takviye edilmiş tam ortamda MEM Alpha.
2. Hücreler %80-90 birleşime ulaştığında, ortamı aspire edin ve hücreleri önceden ısıtılmış PBS ile iki kez yıkayın. Tripsin-EDTA ekleyin ve hücreler ayrılana kadar kuluçka yapın.
3. Sindirimi sonlandırmak için tam ortam ekleyin ve nazik pipetleme ile tek hücreli süspansiyon oluşturulur. Süspansiyonu 1.000 × g ile 5 dakika boyunca santrifüj edin ve süspansiyonu atın.
4. Hücre pelletini taze, tam ortamda yeniden askıya alın ve hücreleri uygun yoğunlukta yeni kültür kablarına tohumlayın. Hücreleri %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir atmosferde 37 °C'de kuluçkaya geçirin.
5. Tohum geçişi 5 (P5) hücrelerini 35 mm cam tabanlı tabaklara yerleştirin ve hücreleri gece boyunca kültürleyin.
6. İzole mitokondrileri, 37 °C sıcaklıkta karanlıkta 20 dakika boyunca mitokondriye özgü kırmızı floresan boya ile etiketleyin ve mitokondrileri PBS ile yıkarak bağlanmamış boya çıkarın.
7. Hücrelere kırmızı floresan boya etiketli mitokondriler (her tabak başına 20 μg mitokondriyal protein) ekleyin ve %5 CO₂ içeren nemli atmosferde 37 °C'de 24 saat kuluçka yapın.
8. Hücreleri 30 dakika boyunca floresan aktin probu ile boyanarak aktin sitoskeletini görselleştirin ve çekirdekleri floresan nükleer boyayla karşı boyayın.
   NOT: Aşırı serum mitokondriyal alım verimliliğini azaltabileceği için ko-inkubasyon sırasında serum konsantrasyonunu dikkatlice kontrol edin. Bu aşamada kullanılan mitokondriler tazedir.

11. Mitokondriyal solunum fonksiyonunun yüksek çözünürlüklü respirometri kullanılarak ölçülmesi

1. Enstrüman hazırlığı
   1. Solunum odalarını, elektrot bölmelerini ve stoperleri temizleyin.
   2. Her odaya manyetik bir karıştırma çubuğu yerleştirin ve oksijen elektrot zarının bütünlüğünü doğrulayın.
2. Cihaz kalibrasyonu
   1. Her solunum odasına 2,1 mL mitokondriyal solunum tamponu (MiR05, pH 7,10) ekleyin ve hava kabarcıklarının bulunmadığından emin olun.
   2. Yüksek çözünürlüklü respirometri sistemini 37 °C'de 30 dakika boyunca dengeleyin ve oksijen baz çizgisinin stabilizasyonundan sonra günlük hava kalibrasyonu yapın.
      NOT: Hava kabarcıklarını solunum odasına sokmaktan kaçının; çünkü bunlar oksijen elektrot sinyallerine müdahale eder ve veri kalitesini tehlikeye atarlar. Bu aşamada kullanılan mitokondriler tazedir.
3. Örnek yüklemesi ve dengelenmesi
   1. Yaklaşık 30 μg protein içeren taze izole mitokondrileri solunum odasına ekleyin ve odayı mühürleyin.
   2. Odayı 5-8 dakika dengeleyin ve bazal oksijen tüketimini kaydedin.
      NOT: Mitokondrileri buz üzerinde tutun ve izolasyondan hemen sonra solunum ölçümleri yapın, böylece aktivite devam eder.
4. SUIT protokolü
   1. Sırayla 5 μL piruvat (2 M), 10 μL glutamat (2 M) ve 10 μL malat (400 mM) ekleyin. Reaksiyonu 5 dakika stabilize edin ve CI Sızıntısı solunumunu kaydedin.
   2. Oksidatif fosforilasyonu indüklemek ve CI OXPHOS solunumunu kaydetmek için 10 μL ADP (500 mM) ekleyin. 10 μL magnezyum klorür (0,3 M) ekleyin.
   3. 20 μL suksinat (1 M) eklenir ve stabilizasyondan sonra CI+CII OXPHOS solunumunu kaydeder.
   4. 2 μL ATP sendaz inhibitörü (0.01 mM) ekleyin ve proton sızıntısı kaydedilir.
   5. CCCP (1 mM) eklenir, oksijen tüketimi bir düzleşmeye ulaşana kadar 2 dakika aralıklarla üç adet 2 μL ekleme ile kademeli olarak eklenir. Maksimum elektron transfer sistemi kapasitesini kaydedin.
   6. Kompleks I aktivitesini engellemek için 1 μL rotenon (1 mM) ekleyin.
   7. Kompleks III aktivitesini inhibe etmek ve kalan oksijen tüketimini kaydetmek için 1 μL antimisin A (5 mM) ekleyin.
   8. 5 μL askorbat (800 mM) ve 5 μL N,N,N',N'-tetrametil-p-fenilenediamin (200 mM) ekleyin. Stabilizasyondan sonra maksimum kompleks IV solunum aktivitesini kaydet.
      NOT: Tekrar eden donma-çözülme döngülerini önlemek için tüm reaktifleri dondurmadan önce Aliquot yapın. CCCP'yi kademeli olarak ekleyin, çünkü aşırı ayrılma mitokondriyal solunumu engeller.
5. Veri analizi
   1. Veri analiz yazılımını kullanarak CI Leak, CI OXPHOS, CI+CII OXPHOS, CI+CII Leak, CI+CII Leak, CI+CII ET, CII ET ve CIV dahil olmak üzere mitokondriyal solunum parametrelerini elde edinin.
   2. Solunum kontrol oranını hesaplayın (RCR; Durum 3 solunum/Durum 4 solunum) ve ATP üretim kapasitesi ile birlikte bulundu. Tüm değerleri istatistiksel analiz için üç önemli rakama kadar koruyun. Veri analizi için kullanılan yazılım Oroboros Datlab 8 (Oroboros Enstrümanları) idi.

Sonuçlar

Mitokondriyal izolasyon ve arındırma iş akışının şematik bir genel görünümü Şekil 1'de gösterilmiştir. Tüm işlemler mitokondriyal bütünlüğü ve fonksiyonel aktiviteyi korumak için 4 °C'de gerçekleştirildi. Taze izole edilen iskelet kas dokusu, doku ayrışmasını kolaylaştırmak için tripsinle doğranıp sindirildi, ardından cam homojenizatör kullanılarak izotonik izolasyon tamponunda homojenleştirildi. Daha sonra mitokondrileri doku kalıntılarından ve sitozolik ki...

Tartışma

Mitokondriyal nakil, hücre tedavisi ve rejeneratif tıpta yeni ortaya çıkan bir stratejidir ve fonksiyonel olarak sağlam mitokondrilerin sağlanması yoluyla enerji metabolizması bozulmuş hücrelerde fizyolojik işlevi yeniden kazandırır. Hücresel enerji metabolizmasını düzenlemenin yanı sıra, bu teknik apoptoz ve oksidatif stres gibi temel biyolojik süreçleri de modüle edebilir ve böylece çeşitli hastalıklar için yeni terapötik^{fırsatlar sunar} 4,17,18,19.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Anti-Cytochrome C antibody	Abcam	EPR1327	Mitokondri Karakterizasyonu
Anti-fade mounting medium	PlantChemMed	PC-90016	Fluoresan boyaların fotobleachingini azaltmak için
BCA Protein Assay Kit	Zhonghui Hecai Biotechnology Co., Ltd.	PQ003	Protein konsantrasyon ölçümü
Beta-actin antibody	Cell Signaling technology	3700s	Beta-aktin antikoru, izole edilen mitokondrilerin saflığını tespit etmek için kullanıldı
BSA	Sigma	A6003	Yalıtım sırasında, mitokondriyal aktiviteyi korumak için serbest yağ asitlerini bağlar.
Centrifuge	Eppendorf	5418R	4 °C Santrifüjleme
CCCP	Solarbio	C6700	Mitokondri oksidatif fosforilasyonunu çözmek ve maksimum proton sızıntısını indüklemek için
Confocal Laser Scanning Microscope	Olympus Corporation	FV4000	İmmünofloresan Boyama Gözlemi
COX IV polyclonal antibody	Proteintech	11242-1-AP	Mitokondri Karakterizasyonu
DAPI	Plant Chem Medicine	PC-90004	Nükleer karşı boyama için
D-mannitol	Solarbio	IM00402	Yalıtım sırasında ozmotik dengeyi korumak ve mitokondriyal şişirmeyi önlemek için
EGTA	Sigma	E4378	Genellikle mitokondriyal yalıtım tamponlarında kullanılır, spesifik olarak Ca2+ ile bağlanarak mitokondriyal fonksiyonu korur
Fetal bovine serum	Every Green	11011-08611	L929 hücrelerinin kültürü
Forceps	RWD Life Science Co., Ltd.	F11003-11	Dokuların tutulması, tutulması ve kaldırılması için kullanılır
Glass homogenizer	Beyotime	FGH005	Dokular homojenizasyonu ve mitokondri yalıtımı için kullanılır
Glutaraldehyde	LEAGENE	DF0151	Proteinleri çapraz bağlayarak hücresel ultra yapıyı hızla sabitler ve stabilize eder, organellerin doğal morfolojisini koruyarak otolizmi önler.
HEPES	Thermo Fisher	J67485	Kararlı bir pH ortamı sağlar.
Incubator	Thermo Fisher	51032874	L929 hücrelerinin kültürü
JC-1	Solarbio	M8650	Saflaştırılmış mitokondri zar potansiyelinin değişikliklerini tespit etmek.
L929 cell line	Procell	CL-0137	Mitokondri endositoz tahlili için
Lead citrate	Sigma	15326	İnce alt hücresel yapı gözlemi için ultra ince kesitleri boyamak için.
MEM Alpha basic (1x)	Gibco	6125510	L929 hücrelerinin kültürü
Methanol	Fuyu Chemical (China)	67-56-1	Aktarım tamponunun bir bileşeni olarak, SDS'yi çıkarmak ve proteinlerin jelden katı fazlı membrana aktarılmasını kolaylaştırmak için kullanılır.
Microplate Reader	Thermo Fisher	Varioskan LUX	JC-1 boyalı mitokondri'nin absorbansını ölçmek
Mitochondrial Membrane Potential Detection Kit	Solarbio	M8650	İskelet Kasında Mitokondriyal Membran Potansiyelinin Algılanması
Mitochondrial isolation Buffer	Solarbio	SM0020	Diferansiyel Santrifüjleme Temelli Ekstraksiyon Kitleri
Mitochondria Storage Buffer	Solarbio	SM0020	Mitokondri korunması için
Mito Tracker  Red CMXRos	Yeasen Biotechnology	40741ES50	Mitokondri Karakterizasyonu
MOPS	MedChemExpress	HY-D0859	Çözelti hazırlamada tampon olarak
Multi-rAb HRP-Goat Anti-Mouse Recombinant Secondary Antibody (H+L)	Proteintech	RGAM001	RGAM001, Western blot'ta Fare IgG (H+L) hedefler
Multi-rAb HRP-Goat Anti-Rabbit Recombinant Secondary Antibody (H+L)	Proteintech	RGAR001	RGAR001, ELISA ve Western blot'ta Tavşan IgG (H+L) hedefler
Non-fat dry milk	NCM Biotech	WB6503	Özellikle membran üzerindeki spesifik olmayan bağlanma bölgelerini işgal ederek arka plan sinyalini azaltmak için bir engelleyici madde olarak kullanılır.
O2k-FluoRespirometer	Oroboros Instruments	O2K	Mitokondri solunum fonksiyonunu ve oksijen metabolizmasını belirleme.
Osmium tetroxide	Sigma	75633	ya da postfiksasyon için, TEM numunelerinde lipitleri korumak ve membran kontrastını artırmak için.
PBS (1x)	Plant Chem Medicine	PC-00003	Kas Dokusunu Temizleme
Penicillin-Streptomycin	Procell	PB180120	L929 hücrelerinin kültürü
Phalloidin-488	Beyotime	C1035	Floresan mikroskopik görüntüleme için sitoskelet F-aktinini etiketleme
Polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane	Millipore (Merck)	IPVH00010	Western blotlama
PowerPac Basic	BIO-RAD	164-5050	SDS-PAGE elektroforezi ile protein ayrımı için
Precast gradient polyacrylamide gel (4–12%)	ACE Bioscience	ET12412LGel	Mitokondri ve hücresel toplam proteinlerin SDS-PAGE ayrımı için kullanılır
Protease inhibitor	Shaanxi Zhonghui Hecai Biomedical Technology	PL032	Endojen ve ekzojen proteazların aktivitesini inhibe eder, numune işleme sırasında hedef proteinlerin bozulmasını önler.
RIPA lysis buffer