Domates Tohumu ile İlgili Mikrobiyotanın Kontrollü Çimlenme ve Karşılaştırmalı Kültürleme Yoluyla İzolasyonu

Özet

Bu protokol, tohumdan fidene geçiş sırasında domates tohumu ile ilişkili mikrobiyotanın tekrarlanabilir izolasyonunu mümkün kılmak için standartlaştırılmış tohum yüzeyi sterilizasyonunu kontrollü çimlendirme ile birleştirir. Bu yaklaşım, kuru tohumlarda yeterince temsil edilmemiş kültürlenebilir mikroorganizmaların geri kazanılmasını artırır ve erken fide gelişimi sırasında karşılaştırmalı kültürel çalışmaları destekler.

Özet

Yüzey sterilizasyonu, tohumla ilişkili mikroorganizmaları izole etmeye yönelik çalışmalarda kritik ancak sıklıkla optimize edilmemiş bir adımdır; çünkü aşırı sert işlemler endogen mikrobiyal popülasyonları azaltabilir veya çarpıtabilir. Bu protokol, daha önce doğrulanmış yöntemlere dayanan yüzey sterilizasyon koşulları ve kontrollü tohum çimlenmesi ile birleştirilerek kültürlenebilir domates tohumu ilişkili mikrobiyotayı izole etmek için tekrarlanabilir bir yaklaşım sunar. Evrensel olarak optimal sterilizasyon tedavileri tanımlamak yerine, yaklaşım tohum özelliklerine göre ayarlanabilen standartlaştırılmış koşullar uygular, bu da önyargıyı en aza indirir ve endojen mikrobiyal popülasyonları korur.

Tohumdan fideye geçişle ilişkili kültürlenebilir mikroorganizmaların geri kazanılmasını artırmak için, protokol mikrobiyal izolasyondan önce kontrollü bir çimlenme aşaması içerir. Kuru, çimlenmemiş tohumların maserasyona dayalı geleneksel yaklaşımlarının aksine, kontrollü çimlenme, steril koşullarda tohumdan fidene geçiş sırasında mikrobiyal aktivasyonu teşvik eder. Karşılaştırmalı koloni oluşturma birimi (CFU) tabanlı eşdeğer biyolojik kopyaların analizleri, her biri 3–5 kuru tohum veya 3–5 çimlenmiş fideden toplanan materyallerden oluşuyordu ve çimlenme sonrası kültürlenebilir toplulukta belirgin bir değişim olduğunu ortaya koydu. Kuru tohumlarda zayıf temsil edilen cinsler çimlenmeden sonra zenginleşirken, kuru tohumlarda daha bol bulunan diğer taksonlar göreceli temsilini azalmış ve bu da fide yerleşmesi sırasında erken bitki-mikrob etkileşimlerinin çalışmalarını desteklemiştir.

Biyolojik kopyalar boyunca, Stutzerimonas, Stenotrophomonas ve Priestia gibi cinsler, çimlenmiş fidelerden elde edilen izolasyonlar arasında tutarlı olarak zenginleştirilmiş, oysa Paenibacillus koşullar arasında bol kalmış ancak tür düzeyinde belirgin değişiklikler göstermiştir. Standartlaştırılmış sterilizasyon koşullarını kontrollü çimlenme ve kuru ile çimlenmiş materyalin karşılaştırmalı analiziyle entegre ederek, bu protokol, erken fide gelişimi sırasında potansiyel işlevsel önemi olan tohumla ilişkili mikrobiyotaların kültürel izolasyonu için sağlam ve tekrarlanabilir bir çerçeve sağlar ve fide oluşumu sırasında erken bitki-mikrob etkileşimlerinin incelenmesini destekler.

Giriş

Tohumlar, hem iç dokularla hem de dış yüzeylerle ilişkili bakteri ve mantarlardan oluşan çeşitli mikrobiyal topluluklar^{barındırır 1,2,3}. Bu mikroorganizmalar, bitki biyolojisinin ayrılmaz bileşenleri olarak giderek daha fazla tanınmaktadır; çünkü bitkilerin performansını en erken gelişim aşamalarından itibaren etkileyebilirler; çimlenme, fide oluşumu ve biyotik ile abiyotik strese^{yanıtlar 1,2,3}. Ekolojik açıdan, tohumlar sadece bitki üremesi için propagullar olarak değil, aynı zamanda mikrobiyal inokulum rezervuarı olarak da işlev görür; bu da onları bitki yaşam döngüsü boyunca bitkiye bağlı mikrobiyomların nasıl başlatıldığını ve korunduğunu anlamak için kritik bir giriş ^{noktası yapar 1,2,3}.

Tohumla ilişkili mikroorganizmalar, gelişmekte olan bitkinin karşılaştığı ilk mikrobiyal aşıyı oluşturabilir ve bu nedenle tohumdan fidene geçiş sırasında mikrobiyomun birleşmesine^{katkıda bulunabilir 1,3,4}. Bu erken aşı, kökleri ve diğer bitki bölmelerini kolonileştiren mikrobiyal toplulukları etkileyebilir; bu da bitki yerleşimi ve sonraki bitki-mikrob etkileşimleri için sonuçlar^{doğurabilir 1,4}. Ayrıca, tohum mikrobiyotasının bir kısmı çiçekler, yumurlar ve polen gibi üreme yapıları aracılığıyla dikey olarak iletilebilir ve böylece mikrobiyal popülasyonlar bitki nesilleri^{boyunca devam edebilir 4,5}. Bu nesiller arası süreklilik, bazı tohum kaynaklı mikroorganizmaların bitkinin uygunluğu ve uyumuna sürekli katkıda bulunabileceğini göstermektedir.

Fonksiyonel olarak, tohumla ilişkili mikroorganizmalar, bitki gelişimini modüle eden veya rakipleri ve patojenleri bastıran fitohormonlar, antimikrobiyal bileşikler ve diğer biyoaktif metabolitlerin üretimi dahil olmak üzere konak performansını ^{etkileyebilir 5,6,7}. Tohum yoluyla bulaşan mikrobiyal popülasyonlar da farklı kaynak kullanımı ve ekolojik bölünme yoluyla birlikte var oluyor gibi görünmektedir; bu da tohumun mikrobiyal çeşitliliğin pasif bir kapı yerine seçici bir yaşam alanı temsil ettiğini^{gösterir 7}. Bu bulgular topluca, tohumların erken bitki gelişimini etkileyebilecek ve aşağı yönlü fonksiyonel karakterizasyon için aday teşkil eden mikrobiyal popülasyonları barındırdığı^{fikrini destekler} 2,3,5,7.

Tohumla ilişkili mikroorganizmaları işlevsel olarak bilgilendirici ve deneysel olarak yönetilebilir bir şekilde incelemek için, tohum materyalinden canlı mikrobiyal popülasyonların geri kazanılması gereklidir. Bu bağlamda, mikrobiyal izolasyon, daha sonra deneysel olarak karakterize edilip bitki-mikrob etkileşimleriyle ilgili sonraki analizlerde değerlendirilebilen canlı mikroorganizmalara erişim sağlar. Bu özellikle, tohumla ilişkili mikroorganizmaların erken bitki yerleşmesine katkıda bulunabileceği ve fonksiyonel tarama ile gelecekteki uygulama için aday olabileceği tohum sistemlerinde özellikle önemlidir.

Tohumla ilişkili mikroorganizmaların geri kazanılması, örnek hazırlama prosedürlerine, özellikle yüzey sterilizasyonuna, doku işlemeye ve örneklenen materyalin gelişim aşamasına karşı son derece hassastır. Bu hassasiyet özellikle tohum sistemlerinde önemlidir çünkü mikrobiyal biyokütle genellikle düşüktür ve küçük prosedürel farklılıklar hem koloni oluşturan birim sayısını hem de izole bileşimini güçlü şekilde etkileyebilir. Bu değişkenler arasında, yüzey sterilizasyonu en kritik ve optimize edilmesi zor olanlardan biridir. Mikrobiyal izolasyondan önce epifitik kontaminasyonu azaltmak için sterilizasyon gereklidir, ancak aşırı sterilantlara maruz kalmak, endogen mikroorganizmaların yaşamabilirliğini veya kültürlenebilirliğini azaltabilirken, yetersiz sterilizasyon yüzeyle ilişkili taksonların sonraki kültürlerde baskın olmasına izin^{verebilir 8,9,10}. Buna göre, sterilizasyonun amacı kimyasal maruziyeti maksimize etmek değil, yüzeyden kaynaklanan kontaminasyonu etkili bir şekilde bastıran ve geri kazanılabilir iç^{mikroorganizmaları koruyan} en hafif tedaviyi uygulamaktır ^5,11.

Sterilizasyon verimliliği bitki türüne, doku yapısına, tohum kabuğu özelliklerine ve ilgili mikrobiyal topluluğa bağlı olduğundan, protokoller daha önce doğrulanmış metodolojilerden seçilmeli ve ardından incelenen^{sisteme dikkatlice uyarlanmalıdır 8,12,13}. Domates tohumları gibi düşük biyokütle içeren malzemelerde bu denge özellikle önemlidir: aşırı sterilizasyon mikrobiyal iyileşmeyi keskin şekilde azaltabilirken, az sterilizasyon ise elde edilen izolatlarda hızlı büyüyen yüzey kirleticilerinin baskın olma olasılığını artırır. Bu nedenle, sterilizasyon verimliliği varsayılmamak yerine rutin olarak doğrulanmalıdır. Son durulama suyunun kaplaması, kalan dış kontaminasyona karşı pratik bir kontrol sağlar, ancak bu kontrol her zaman tohum veya fide homojenlerinden mikrobiyal geri kazanımla birlikte yorumlanmalıdır. Steril durulama kontrolleri sağlayan ancak geri kazanılabilir iç mikrobiyota çok az veya hiç olmayan bir protokol, maksimum dekontaminasyon yerine karşılaştırmalı mikrobiyal izolasyon olduğunda^{uygun olmayabilir} 6,8,10,14.

Bu nedenle anlamlı karşılaştırmalar güçlü prosedürel standartlaştırma gerektirir. Düşük biyokütle içeren örneklerde, yıkama, transfer, homojenleştirme, seyreltme, kaplama veya kuluçka aşamalarındaki tutarsızlıklar hem toplam mikrobiyal geri dönüşü hem de bireysel taksonların görünürdeki temsilini değiştirebilir. Bu özellikle, metodolojik varyasyonun kolayca biyolojik değişimle karıştırılabileceği kuru ve çimlenmiş materyal karşılaştırıldığında önemlidir.

Birçok tohum mikrobiyolojisi protokolünün büyük sınırlaması, başlangıç materyali olarak yalnızca kuru, çimlenmemiş tohumlara dayanmalarıdır. Bu, tohum aktivasyonundan önceki mikrobiyal fraksiyon için faydalı bir temel sağlasa da, uykuda olan, metabolik olarak inaktif olan, stresli veya başlangıçta düşük göreceli bollukta bulunan^{mikroorganizmaları hafife alabilir 2,15}.

Kuru durumda, tohumlar hem konak dokuların hem de ilişkili mikroorganizmaların nispeten passif kalabileceği fizyolojik olarak sakin bir ortamı temsil eder. Sonuç olarak, doğrudan kuru tohumlardan elde edilen mikrobiyal popülasyonlar, çimlenme başladığında daha kolay geri kazanılan popülüleri tam olarak temsil etmeyebilir.

Çimlenme sırasında, tohumlar su alımı, metabolik yeniden aktivasyon, besin hareketi ve doku yeniden organizasyonu geçirir; bunların tümü ilişkili mikroorganizmaların yerel ortamını^{değiştirir 11,16}. Bu değişiklikler, mikrobiyal büyümeyi teşvik edebilir, mikrobiyal popülasyonların göreceli temsilini değiştirebilir ve daha önce nadir veya kuru tohumlarda kötü kazanılan taksonların tespit edilmesini veya iyileşmesini kolaylaştırabilir. Ayrıca, radikal çıkışı mikrobiyal çoğalma ve yeniden dağılımını destekleyebilecek yeni bir bitki bölmesi oluşturur; bu da tohumdan fidene geçişi mikrobiyolojik analiz için özellikle bilgilendirici bir aşama^{yapar 1,17}.

Bu nedenle, kuru tohumlar ve çimlenmiş fidelerin paralel işlenmesi, yalnızca kuru tohumların analizinden daha bilgilendirici bir deneysel tasarım sunar. Kuru tohumlar, aktivasyon öncesi mevcut kültürlenebilir popülasyonlar için bir temel oluştururken, çimlenmiş materyal erken gelişim sırasında daha kolay kurtarılabilir olan taksonların karşılaştırmalı değerlendirmesini sağlar. Bu yaklaşım, yalnızca kurtarılabilir mikroorganizmaları kataloglamak değil, aynı zamanda tohumdan fideme geçişiyle ilişkili taksonları belirlemek ve izolatları sonraki karakterizasyon için önceliklendirmek olduğunda özellikle faydalıdır (Şekil 1).

Şekil 1: Karşılaştırmalı izolasyon iş akışının kavramsal ve prosedürel genel bakışı. (A) Çimlenmeden önce kuru domates tohumunun kavramsal temsili. (B) Tohumdan fidene geçiş sırasında çimlenmiş domates tohumu durumunun kavramsal temsili. (C) Protokolün şematik iş akışı; tohum yüzeyi sterilizasyonu, durulama kontrol değerlendirmesi, kuru tohumların doğrudan işlenmesi veya kontrollü çimlenme, birleştirilmiş biyolojik kopyaların homojenleştirilmesi, seri seyreltme ve kaplama, CFU tabanlı niceliklendirme, izole kurtarılması, taksonomik tanımlama ve kuru ile çimlenmiş materyalin karşılaştırmalı analizini içerir. İş akışında vurgulanan kritik kontrol noktaları arasında sterilizasyon verimliliği, eşdeğer biyolojik kopyalar ve tutarlı kaplama ile CFU analizleri yer alır. Panel A ve B, yalnızca görsel temsil için yapay zeka destekli kavramsal illüstrasyonlar olarak hazırlandı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Protokol, kuru ve çimlenmiş malzemeden mikrobiyal geri kazanımı karşılaştırmayı amaçladığından, katı metodolojik tutarlılık gereklidir. Tüm karşılaştırmalar aynı tohum partisi, aynı sterilizasyon koşulları, aynı kültür ortamı ve eşdeğer seyreltme, kaplama ve kuluçka prosedürleri kullanılarak yapılmalıdır. Bu standartlaştırma düzeyi olmadan, kuru ve çimlenmiş örnekler arasındaki görünür farklar, biyolojik olarak anlamlı zenginleştirme yerine teknik farklılıkları yansıtabilir. Bu özellikle, elde edilen fraksiyonun hem biyolojik örnek hem de deneysel prosedürün seçici etkileriyle şekillendiği izolasyon iş akışlarında^{önemlidir 4,15}.

Biyolojik çoğaltma da vazgeçilmezdir. Düşük bolluklu taksonlar tohum partileri arasında değişebilir ve düşük biyokütle örneklerinden mikrobiyal geri kazanım, dikkatlice kontrol edilen koşullarda bile doğası gereği stokastiktir. Her durum için en az beş bağımsız biyolojik kopya sağlam karşılaştırma için önerilir. Bu iş akışında, her biyolojik replika, 3–5 kuru tohum veya 3–5 çimlenmiş fideden toplanan materyalden oluşur ve tek bir örnek olarak işlenir. Ayrıca, sterilizasyon sonrası tüm manipülasyonlar aseptik koşullarda yapılmalıdır; böylece ikincil kontaminasyon en aza indirilebilir ve ortaya çıkan izolat setinin yorumlanabilirliğini korur.

Çimlenme süresi de dikkatlice seçilmelidir. Radikal çıkışı ve erken fide gelişimine izin verecek kadar uzun olmalı, ancak sonraki bitki büyümesinin tohumdan fideye geçişle ilgisi olmayan ek ekolojik karmaşıklık getirecek kadar uzun olmamalıdır. Domatesler için, steril koşullarda 5 güne kadar çimlenme süresi, fidanın tohum ortamıyla yakından bağlantılı kalması için pratik bir pencere sağlarken, erken mikrobiyal aktivasyon ve yeniden dağıtım zaten gerçekleşebilir. Deneyler arasında tutarlı zamanlama gereklidir çünkü gelişim aşamasındaki farklılıklar mikrobiyal iyileşme kalıplarını etkileyebilir. Bu iş akışı, düşük biyokütleli tohum sistemlerinden kültürlenebilir mikrobiyotanın karşılaştırmalı geri kazanımı için en uygun, çünkü amaç standart koşullarda çimlenmeye bağlı değişimleri değerlendirmek olur. Toplam tohum mikrobiyom çeşitliliğinin doğrudan tahmini için veya daha geniş mikrobiyal topluluğu yakalamak için kültürden bağımsız yaklaşımların gerektiği deneysel sistemler için daha az uygundur.

Bu protokolün amacı, standartlaştırılmış yüzey sterilizasyonunu kontrollü tohum çimlenmesiyle entegre ederek kültürlenebilir domates tohumu ile ilişkili mikrobiyotanın izolasyonu için tekrarlanabilir bir çerçeve sağlamaktır. Bu yöntem, her biri 3–5 kuru tohum veya 3–5 çimlenmiş fideden toplanan materyalden oluşan eşdeğer biyolojik kopyalar kullanılarak kuru tohumlar ve çimlenmiş fidelerin karşılaştırmalı analizini sağlar; böylece koloni oluşturan birim (CFU) iyileşmesi ve taksonomik bileşimdeki çimlenmeye bağlı değişimleri değerlendirir. Tohumdan fidene geçiş sırasında sterilizasyon yanlılığını en aza indirerek ve mikrobiyal iyileşmeyi teşvik ederek, bu yaklaşım erken fide gelişiminde potansiyel fonksiyonel önemi olan mikroorganizmaların izolasyonunu kolaylaştırır ve erken bitki-mikrob etkileşimlerinin sonraki çalışmalarını destekler.

Protokol

1. Reaktifler, ortam ve steril malzemelerin hazırlanması

1. %70 (v:v) etanol çözeltisi hazırlayın, steril damıtılmış su kullanın.
2. Ticari çamaşır suyundan %5 kullanılabilir sodyum hipoklorit içeren %20 (v:v) çalışma çözeltisi, 80 mL steril damıtılmış suda 20 mL çamaşır suyu seyreltirilerek hazırlanır.
3. Yıkama adımları için steril damıtılmış su hazırlayın.
4. Homojenleştirme ve seri seyreltme için steril %0,45 NaCl hazırlayın ve bu çözümü iş akışı boyunca tutarlı şekilde kullanın.
5. Luria Bertani (LB) agar kültür ortamı hazırlayın (litrede: 10 g tripton, 5 g maya özdüsü, 10 g NaCl ve 15 g agar) ve steril koşullarda önceden plakalar dökün.
6. Sterilizasyon sonrası tohum veya fidelerle temas edecek tüm aletleri, forseps, tokmak, yayıcı, makas ve tüp rafları dahil olmak üzere otoklavlama veya doğrulanmış aseptik tedavi ile sterilize edin.
7. Tohum işlemeye başlamadan önce steril Petri kapları, tüpler, pipet uçları ve kültür plakalarını laminar akış başlığı içinde yerleştirin.
   NOT: Tohumla ilişkili mikrobiyal biyokütle düşük olabildiğinden, gereksiz işlem süresini en aza indirmek ve sterilizasyona başlamadan önce tüm malzemelerin hazır olması önemlidir. Kimyasal işlemler, yıkama, kaplama veya çimlenme kurulumu arasındaki gecikmeler, iyileşmede değişkenlik yaratabilir. Alternatif steril tamponlar diğer deneysel sistemlerde kullanılabilir, ancak herhangi bir karşılaştırmalı deney boyunca tek bir tampon korunmalıdır. Reasoner's 2A (R2A) veya seçici medya gibi ek medya genişletilmiş kültürel iş akışlarına dahil edilebilir, ancak burada tanımlanan karşılaştırmalı protokol için standart ortam olarak LB agar kullanılmıştır.

2. Tohumların seçimi ve dağıtımı

1. Her deney için mümkün olduğunca tek bir domates tohumu partisinden tohum kullanın.
   NOT: Burada açıklanan temsil iş akışında, her deneyde cv. Money Maker'ın tek bir tohum partisinden domates tohumları kullanıldı.
2. Tohumları görsel olarak inceleyin ve hasarlı, görünür şekilde kırılmış veya deformasyona uğramış tohumları atın.
3. Tohumları çalışma için gerekli deneysel gruplara ayırın. En azından, tohumları sterilizasyon sonrası kuru tohum izolasyonu, filizasyon ve ardından fide izolasyonu ile ayırın.
4. Birden fazla sterilizasyon koşulu test edilecekse, tohum boyutu veya durumuna bağlı tedavi yanlılığını önlemek için tohumları sterilasyon tedavileri arasında rastgele olarak atandırın.
   NOT: Tüm sonraki karşılaştırmalar, paralel olarak işlenen aynı tohum partisine dayandığında daha güçlüdür. İş akışı diğer domates genotiplerine veya çeşitlerine uyarlanabilir, ancak bir deney içindeki herhangi bir karşılaştırma paralel işlenmiş tek bir tohum partisi kullanılarak yapılmalıdır.

3. Domates tohumlarının yüzey kısırlaştırılması

1. Her steril 2 mL mikrosantrifüj tüpüne laminar akış başlığı içinde 3–5 tohum aktarın.
2. Tohumları tamamen batırmak için her tüpte 1 ml %70 (v:v) etanol ekleyin.
3. Tüpleri 25 rpm'de tüp rotatörüyle nazikçe karıştırarak 5 dakika kuluçka edin.
4. Etanolü steril bir pipet kullanarak tamamen çıkarın.
5. Tohumları tamamen batırmak için hemen her tüpte %20 (v:v) sodyum hipoklorit çalışma çözeltisinden 1 mL ekleyin.
6. Tüpleri 10 dakika boyunca inkübe edin, tüp rotatörü ile 25 rpm'de hafif bir karıştırma yapın.
7. Sodyum hipoklorit çözeltisini steril pipet kullanarak tamamen çıkarın.
8. Tohumları her yıkamada 1 mL steril damıtılmış suyla üç kez yıkayın.
   1. Her yıkamada steril su ekleyin, 30 saniye boyunca nazikçe karıştırın, gerekirse tohumların 30 saniye yerleşmesini bekleyin ve temiz steril su eklemeden önce yıkama çözelyonunu tamamen çıkarın.
9. Her tüpten son durulama suyunu sterilizasyon verimliliği kontrolleri için tutun.
10. Sterilize edilmiş tohumları, hemen kuru tohum olarak işlenip işlenmeyeceğine veya kontrollü çimlenme için kullanılıp kullanılmayacağına göre steril Petri kaplarına veya steril tüplere aktarın.
    DIKKAT: Sodyum hipokloriti uygun kişisel koruyucu ekipmanla kullanın ve tüm adımları kurumsal kimyasal güvenlik prosedürlerine uygun şekilde gerçekleştirin.
    NOT: Burada kullanılan etanol-sodyum hipoklorit dizisi, daha önce doğrulanmış sterilizasyon iş akışlarına dayanarak domates tohumları için standart bir çalışma koşulu olarak seçilmiştir. Karşılaştırmalı deneye dahil edilen tüm örnekler için aynı sterilizasyon koşullarını kullanın. Birden fazla sterilizasyon rejimi değerlendirilirse, her tedaviyi paralel işleyin ve her durum için bağımsız olarak sterilizasyon verimliliği değerlendirin. Mikrobiyal geri dönüşümdeki değişkenliği azaltmak için son yıkama ile sonraki işlem arasındaki zamanı en aza indirin.

4. Sterilizasyon verimliliğinin doğrulanması

1. Son durulama suyunu steril %0,45 NaCl içinde 10 kat seri seyreltme yapın; 100 μL durulama suyu 900 μL sulandırıltıya aktarılır ve aynı adımı ardışık olarak ^10-4 μL sıvılaştırıcıya kadar tekrarlayın. Her seyreltmeden 100 μL levha, aynı kaplama yöntemiyle LB agar'a yerleştirilir, kuru tohum ve çimlenmiş fide homojenleşir.
2. Plakaları 28 °C'de 24–48 saat boyunca kuluçka edin.
3. Kuluçkadan sonra koloni büyümesi için plakaları kontrol edin.
4. Her seyreltme için koloni varlığını veya yokluğunu kaydedin. Koloni varsa, seyrelme seviyesini, yaklaşık koloni sayısını ve görünür koloni morfolojisini kaydedin.
   NOT: Deney boyunca aynı kaplama hacmi ve kaplama formatını kullanarak durulama kontrolleri ile biyolojik örnekler arasında doğrudan karşılaştırma yapılmasına olanak tanıyabilir. Eğer seyreltilmemiş veya en düşük seyreltilmiş durulama kontrol plakalarında koloni tespit edilmezse, örnek kullanılan kültür koşullarında tespit edilebilir büyüme olmadığı şeklinde kaydedilir.

5. Kuru (çimlenmemiş) tohumların işlenmesi

1. Bir biyolojik kopyaya karşılık gelen 3–5 sterilize kuru tohumdan oluşan grup setlerini, 1 mL steril %0,45 NaCl içeren steril 2 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın.
2. Tohumları steril tek kullanımlık bir tokmakla homojenleştirin, ta ki tohum dokuları gözle görülür şekilde bozulana ve sağlam bir tohum yapısı kalmayana kadar.
3. Mikrobiyal hücreleri eşit şekilde yeniden süspansiyon etmek için homojeni 30 saniye girdabla geçirin.
4. Homojenatın steril %0,45 NaCl içinde 10 kat seri seyreltmelerini, ilk seyreltme için 100 μL homojenatı 900 μL seyreltici sıvıya aktararak ve aynı oranı ardışık olarak ^10-6'ya kadar tekrarlayarak hazırlayın.
5. Seçilen seyreltmelerden 100 μL levha LB agar'a yayılmış kaplama ile yerleştirilir.
6. Plakaları 28 °C'de 24–72 saat boyunca kuluçka edin.
7. Aşağı akış CFU tahmini için izole ve sayılabilen koloniler elde eden seyreltme aralığına uygun plakaları seçin ve izole kazanım.
8. Toplam koloni sayısını, görünür koloni morfotiplerini ve replikalar arasındaki büyüme desenindeki farkları kaydedin.
   NOT: Aynı kültür ortamı, seyreltme şeması, kaplama hacmi ve kuluçka koşulları kullanılarak çimlenmiş fide örnekleriyle paralel kuru tohum işleme işlemi yapılmalıdır. LB agar, burada tanımlanan karşılaştırmalı iş akışı için standart ortam olarak kullanılmıştır. Yavaş büyüyen taksonların daha geniş bir iyileşmesi gerektiğinde genişletilmiş izolasyon iş akışlarına ek medya dahil edilebilir.

6. Sterilize edilmiş tohumların aksinik çimlenmesi

1. Sterilize edilmiş tohumları, Murashige ve Skoog (MS) agar plakaları gibi steril çimlenme desteğine yerleştirin.
2. Tohumları eşit aralıklarla ayırın, böylece fideler arasında temas önlenir.
3. Plakaları, dış kirliliği azaltırken normal çimlenmeye izin veren laboratuvar sızdırmazlık filmi veya eşdeğer malzemeyle mühürleyin.
4. Plakaları karanlıkta 25 °C sıcaklıkta yatay olarak kuluçka altına alın.
5. Tohumların steril koşullarda erken kök oluşumu net görünene kadar çimlenmesine izin verin; Temsilci deneyde bu, 5 gün kuluçka süresine karşılık geliyordu.
6. Plakaları düzenli olarak kontaminasyon, anormal çimlenme veya aşırı yoğuşma belirtileri açısından kontrol edin.
   NOT: Çimlenme koşulları replikalar arasında sabit tutulmalıdır. Çimlenme süresi veya fide evresindeki değişkenlik, incelenen etkiden bağımsız olarak mikrobiyal iyileşmeyi değiştirebilir. Phytoagar plakaları veya steril nemli filtre kağıdı gibi diğer steril çimlenme destekleri, her deneyde destek sabit kalırsa uyarlanmış iş akışlarında kullanılabilir. Çimlenme kabına bağlı olarak kuluçka için alternatif plaka yönleri kullanılabilir, ancak deney içinde yönelim sabit tutulmalıdır. (Duraklama noktası) Çimlenmiş fideler gerekirse işlemeden önce kısa bir süre 4 °C'de tutulabilir, ancak mümkün olduğunda hemen işleme tercih edilir.

7. Çimlenmiş fidanlardan mikroorganizmaların izolyasyonu

1. Steril forseps kullanarak laminar bir akış başlığı içinde çimlenmiş fideleri toplayın.
2. 3–5 çimlenmiş fidenden, bir biyolojik kopyaya karşılık gelen biriktirilmiş materyal, steril 2 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarılır.
3. Her tüpe 1 mL steril %0,45 NaCl ekleyin.
4. Biriktirilmiş fide materyalini, steril tek kullanımlık bir havanla iyice homojenleştirin; böylece hem çıkan kök hem de ilgili kalıntı tohum dokusu dahil edildiğinden emin olun, dokular gözle görülür şekilde bozulana kadar.
5. Vortex, mikrobiyal hücreleri eşit şekilde serbest bırakıp yeniden süspansiyona almak için 30 saniye homojenat yapın.
6. Homojenatın steril %0,45 NaCl içinde 10 kat seri seyreltmelerini, ilk seyreltme için 100 μL homojenat 900 μL seyreltici sıvıya aktararak ve aynı oranı ardışık olarak ^10-4'e kadar tekrarlayarak hazırlayın.
7. Seçilen seyreltmelerin 100 μL'sini LB agara sektör ile plaka ile bırakın.
8. Plakaları 28 °C'de 24–72 saat boyunca kuluçka edin. Toplam koloni sayısını, görünür koloni morfotiplerini ve kuru tohum örneklerine göre farkları kaydedin.
   NOT: Bir biyolojik replikatı, 3–5 çimlenmiş fideden toplanan materyal olarak tanımlayın ve tüm çoğaltmaları aynı seyreltme şeması, kaplama hacmi, kültür ortamı ve kuluçka koşulları kullanılarak paralel olarak işleyin. Hem kalıntı tohum dokusunu hem de çıkan kökü homojenata dahil ederek çimlenmiş fide örnekleri arasında tutarlılığı koruyun.

8. Koloni sayımı ve izole kurtarma

1. İnkubasyondan sonra, sayılabilen ve iyi ayrılmış koloniler veren seyreltme plakalarını seçin. CFU tahmini için 30–300 koloni içeren plakalar kullanın.
2. Seçilen plakalardaki kolonileri sayın ve biyolojik çoğaltma başına CFU'yu aşağıdaki formülle hesaplayın:
   Çoğaltma başına CFU = (koloni sayısı × seyreltme faktörü)/kaplama hacmi (mililitre)
   1. Aynı seyreltmeden birden fazla plaka kullanılırsa, formülü uygulamadan önce o seyreltme için ortalama koloni sayısını hesaplayın.
3. Koloni morfolojisini, boyut, şekil, renk, kenar, yükseklik ve opaklık gibi standart tanımlayıcılarla kaydedin.
4. Örnekleme yanlılığını en aza indirmek için aşağı akış izolasyonu için koloniler seçin. Koloni sayısı düşük olduğunda tüm ayırt edilebilir morfotipleri seçin veya koloni sayıları yüksekse plakalar arasında rastgele birden fazla koloni seçin.
5. Seçilen kolonileri taze LB agar plakalarına yeniden yerleştirerek saf kültürler elde edin.
6. Her izolat plakada uniform bir koloni morfolojisi gösterene kadar tekrar tekrar tekrar edin.
   NOT: CFU değerlerinin biyolojik çoğaltma başına mı yoksa birim biyokütle başına mı yoksa başka bir normalizasyon yöntemi kullanılarak mı ifade edildiğini net bir şekilde bildirin. Biyokütle tabanlı normalizasyon dahil ek normalizasyon yaklaşımları uygulanırsa, hesaplama yöntemini Veri analizi bölümünde açıkça açıklayın.

9. Arındırılmış izolatların korunması

1. Saf kolonileri sıvı LB kültür ortamına aşılayın ve görünür büyüme elde edilene kadar kuluçka yapın.
2. Kültürü (1:1, v:v) standart mikrobiyolojik uygulamalara göre steril %80 gliserol ile karıştırın.
3. Kriyostokları -80 °C'de sakla.
4. Her izolat için dijital bir kayıt tutun; örnek kökeni, çoğaltma sayısı, durumu (kuru tohum veya çimlenmiş fide), kısırlaştırma işlemi, izolasyon tarihi, levha ortamı, koloni morfolojisi ve sonraki kimlik durumu.
   NOT: Zenginleştirme desenlerinin tohum aşamasına, tedaviye veya biyolojik çoğaltmaya bağlanması için doğru izole meta verileri gereklidir.

10. İzolatların moleküler tanımlanması

1. Üreticinin talimatlarına göre bakteriyel DNA çıkarma kiti kullanarak saflaştırılmış bakteriyel kültürlerden genomik DNA çıkarın.
2. Bakteriyel 16S rRNA genini V5-V8 hiperdeğişken bölgesi veya neredeyse tam uzunlukta olan 16S rRNA geniyle amplifikasyon yapın.
   1. V5–V8 bölgesinin (~700 bp) amplifikasyonu için 799F (5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′) ve 1392R (5′- ACGGGGGTGTGTGTRC-3′) primerleri kullanılır.
   2. Neredeyse tam uzunluktaki 16S rRNA geninin (~1500 bp) amplifikasyonu için 27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) ve 1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′) primerleri kullanın.
   3. Her polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) reaksiyonunu PCR master karışımı, her primerden 0,4 μM ve 1 μL şablon DNA kullanılarak 25 μL'lik nihai hacimde hazırlayın.
   4. Termal döngücü ile şu koşullarda çalıştırılır: 95 °C'de 2 dakika boyunca ilk denatürasyon; 3 saniye boyunca 95 °C'de 40 denatürasyon, 30 saniye boyunca 45 °C'de tavlama ve 2 dakika 72 °C'de uzatma; ardından 72 °C'de 7 dakika boyunca son bir uzatma yapıldı. Her PCR girişinde şablonsuz bir kontrol ekleyin.
3. PCR ürünlerini %1 agaroz jel üzerinde elektroforezle doğrulayın ve amplikonları jel elektroforezi ve görüntüleme sistemi ile görselleştirin.
4. PCR ürünlerini üreticinin talimatlarına göre PCR temizleme kiti ile arındırın ve arıtılmış amplikonları Sanger dizileme için gönderin.
5. Kalite kontrolü, kırpma ve gerektiğinde ortaya çıkan dizileri birleştirin.
   1. Her diziyi BLASTn (çok benzer diziler için Megablast ayarları) kullanarak Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi (NCBI) nükleotit veritabanıyla karşılaştırın.
   2. Taksonomi atamak için en iyi desteklenen hiti kullanın. İzolasyonları cins seviyesine atayın, en iyi isabet yeterli hizalama kapsamı ve en az %94,5 dizi kimliği gösterdiğinde.
   3. En iyi sonuç en az %98,7 dizilik kimliği, yüksek sorgu kapsamı ve yakın akraba türler arasında çelişkili üst eşleşmeler olmadığında yalnızca geçici tür düzeyinde atamayı kullanın.
   4. Tekrarlanan amplifikasyon başarısız olursa veya dizi kalitesi yetersizse, izole Tanımlanmamış olarak kaydedilir. 16S rRNA benzerliği tek başına yakın akraba bakteri türlerini çözemeyebileceğinden, tüm tür düzeyindeki atamaları geçici olarak kabul edin ve gerektiğinde filogenetik veya genom tabanlı analizlerle doğrulayın.
6. İzole kimliğini en yüksek desteklenen taksonomik çözünürlükte bildirin. Bu tanımlamaları, morfoloji temelli gruplamaları doğrulamak ve aşağı akış genomik ve fonksiyonel analizler için temsilci izolasyonları önceliklendirmek için kullanın.
   NOT: Bu moleküler tanımlama adımı, izole sınıflandırmasını ve temsil suş seçimini desteklemek amacıyla tasarlanmıştır. Tedavi yöntemleri arasında topluluk yapısını veya nicel bolluk kalıplarını çıkarmak için kullanılmamalıdır.

11. Veri analizi

1. Her koşulda en az beş biyolojik kopya ile deneyi yapın.
   NOT: Bu iş akışında, her biyolojik çoğaltma 3–5 kuru tohum veya 3–5 çimlenmiş fide toplanmış materyalden oluşur ve tek bir örnek olarak işlenir.
2. Her koşul için, (i) toplam CFU geri kazanılması, (ii) görünür koloni morfotiplerinin sayısı, (iii) saflaştırılmış izolat sayısı ve (iv) cins düzeyinde ve ilgili olduğunda tür düzeyinde kurtarılan kültürlenebilir mikrobiyotanın taksonomik bileşimi.
3. Kuru tohum ve çimlenmiş fide örneklerini karşılaştırarak toplam iyileşme ve taksonomik bileşimdeki çimlenmeye bağlı değişiklikleri değerlendirin.
4. Her taksonun göreli temsilini, her koşul altında toplam geri alınan CFU'ların yüzdesi olarak hesaplayın. Mutlak CFU değerleri kullanılarak katlanma değişimlerini hesaplayın.
5. Uygun istatistiksel analiz yazılımı kullanarak nicel verileri analiz edin (örneğin, GraphPad Prism [v11.0.2]). Verileri ortalama ± standart sapma (SD) olarak bildirin.
   1. Kuru tohumlu ve çimlenmiş fide örnekleri arasında çift karşılaştırmalar için, veriler normallik varsayımlarını karşıladığında iki kuyruklu Öğrenci t-testi kullanın.
   2. Bu varsayımlar karşılanmadığında, Mann–Whitney U testi kullanın. P < 0.05'te istatistiksel olarak anlamlı farkları ele alın.
6. Gösterilen her değerin mutlak CFU'lara, göreceli CFU'ya türetilen yüzdelere veya mutlak CFU değerlerinden hesaplanan katlama değişimlerine karşılık gelip etmediğini net bir şekilde bildirin.
   NOT: Çalışma boyunca aynı hesaplama kriterlerini kullanarak kuru tohumlu ve çimlenmiş fide örnekleri arasında doğrudan karşılaştırma yapılabilir. Taksonomik bileşim sunarken, değerlerin cins düzeyinde mi yoksa tür düzeyinde mi gösterildiğini açıkça belirtin.

12. Kritik kalite kontrol noktaları ve sorun giderme

1. Steril son bir durulama tek başına seçilen sterilizasyon rejiminin deneysel hedef için optimal olduğunu göstermez. Dış kirlenmeyi sınırlayın ve iç veya tohumla sıkı ilişkili fraksiyondan kültürlenebilir mikroorganizmaların geri kazanılmasını korurken. Kuru tohum ve çimlenmiş fide homojenlerinden mikrobiyal geri kazanımı ile birlikte durulama kontrol sonuçlarını yorumlayın.
2. Hem kuru hem de çimlenmiş örneklerden düşük geri alım, aşırı sterilizasyon, aşırı sert homojenleşme, uygunsuz kültür koşulları veya gecikmeli örnek işleme belirtileri gösterebilir. Bu durumlarda, sterilizasyon sürelerinin tutarlı uygulandığını doğrulayın, doku bozulmasının yeterli olup aşırı olmadığını doğrulayın ve seyreltme, kaplama ve kuluçka işlemlerinin hemen ve aynı koşullar altında örnekler arasında yapılmasını sağlayın.
3. Durulama kontrollerinde yüksek kontaminasyon veya az sayıda koloni tipinin hızlı aşırı büyümesi, sterilizasyon sonrası işlem sırasında yetersiz sterilizasyon veya kontaminasyon olduğunu gösterebilir. Bu durumlarda, deneyi tekrarlamadan önce sterilizasyon zamanlamasını, yıkama adımlarını, aseptik kullanımını ve laminar akış başlıktaki malzemelerin organizasyonunu gözden geçirin.
4. Kuru ve çimlenmiş örnekler arasındaki farkları biyolojik olarak yalnızca çimlenme aşaması, biyolojik çoğaltma yapısı, kültür ortamı, seyreltme şeması, kaplama hacmi ve kuluçka koşulları deney genelinde standartlaştırıldığında yorumlayın.
5. Düşük biyokütleli tohum materyaliyle çalışırken, bir durumda belirli taksonların görünen yokluğu da gerçek yokluktan ziyade yetersiz örneklemi yansıtabilir. Bu nedenle, çimlenmeye bağlı kaymaları sağlam bir şekilde yorumlamak için tutarlı replikasyon işleme ve izole seviyesinde tanımlama gerçekleştirin.

13. Örnekleri diğer yaklaşımlar için kaydetmek

1. Sterilizasyon verimliliği doğrulandıktan ve kaplamadan önce, her kuru tohum veya çimlenmiş fide homojenatından ek 200 μL aliquot steril 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarılır.
2. Her tüpü örnek türü, biyolojik çoğaltma numarası, işlem koşulları ve toplama tarihiyle etiketleyin.
3. Aliquotları hemen dondurun ve -80 °C'de depolayın, sonra sonraki analizlerde kullanılana kadar.
4. Depolanan homojen materyali, DNA tabanlı analizler, mikroskopi tabanlı testler veya aynı başlangıç biyolojik çoğaltmayı gerektiren doğrulama deneyleri gibi tamamlayıcı yaklaşımlar için kullanın.
   NOT: Aliquotları, orijinal homojen bileşimi korumak için seri seyreltme ve kaplamadan önce saklayın. Birden fazla sonraki analiz planlandığında ayrı aliquotlar hazırlayarak tekrar eden donma–erime döngülerini önleyin.

Sonuçlar

Yüzey sterilizasyonunun performansı ve dış kirlenmenin kontrolü
Daha önce doğrulanmış metodolojilere dayanan standart koşullarla yüzey sterilizasyonu, tohum kaynaklı materyalden kültürlenebilir mikroorganizmaların geri kazanılmasını korurken dış mikrobiyal kirlenmenin etkili bir şekilde azaltılmasına yol açtı. Son durulama suyunun kaplamasında tespit edilebilir koloni büyümesi görülmedi; bu da kullanılan koşullarda yüzeyle ilişkili mikroorganizmaların etkili şekilde u...

Tartışma

Burada sunulan sonuçlar, standartlaştırılmış yüzey sterilizasyonunun kontrollü tohum çimlenmesi ile entegrasyonunun, tohumla ilişkili mikrobiyotanın kültürel izolasyonu için sağlam bir çerçeve sağladığını göstermektedir. Bu protokolün temel sonucu, dış kirleticilerin etkili şekilde uzaklaştırılması ile endojen mikrobiyal popülasyonların korunmasını dengeleyebilme yeteneğidir. Bu denge, aşırı katı sterilizasyonun mikrobiyen iyileşmeyi azaltabileceği, yetersiz sterilizasyonun epifitik mikr...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Agar	Sigma-Aldrich	01916-500G	LB agar ortamının bir bileşeni; 15 g/L.
Otoklaf	Lab1st	SV120H	Aletleri/malzemeleri sterilize etmek veya aseptik işlemeyi doğrulamak için kullanılır.
Bakteri DNA ekstraksiyon kiti	Promocell	PK-MB708-206-100	DNA ekstraksiyonu
Koloni sayma/kayıt kurulumu	OCS	B079Y5W57N	CFU'ları, morfotipleri ve plaka farklılıklarını kaydetmek için gereklidir; el yazması sayaç/model belirtmez.
Kriyosaklama şişeleri	Sigma-Aldrich	Z359033	-80 °C'de gliserol stoklarının saklanması için ima edilmiştir; açıkça belirtilmemiş ancak koruma aşaması için gereklidir.
Dijital izolat kayıt sistemi	El yazmasında belirtilmemiş	Uygulanmaz	Köken, çoğaltma, koşul, sterilizasyon işlemi, yalıtım tarihi, plaka ortamı, morfoloji, tanımlama durumu gibi izolat meta verilerini kaydetmek için kullanılır.
Etanol	VWR	83813440	Tohum yüzeyi sterilizasyonu için %70 v/v etanol çözeltisi hazırlamak için kullanılır.
Filtre kağıdı	Fisher Scientific	11718772	Opsiyonel alternatif çimlendirme desteği.
Forseps/Cımbız	Sigma-Aldrich	930229	Tohumları taşımak ve çimlenen fideleri toplamak için kullanılır.
Genomik DNA ekstraksiyon kiti	PromoCell	PK-MB708-206-100	Arındırılmış bakteri kültürlerinden genomik DNA çıkarmak için kullanılır; tam kit/metot belirtilmemiştir.
Gliserin, steril %80	VWR	24388364	Kriyostok hazırlama için sıvı kültürle 1:1 v/v oranında karıştırılır.
Laminer akış başlığı Bio48	Faster	LAB-CAP-22	Aseptik tohum işleme, sterilizasyon transferleri ve steril malzemelerin hazırlanması için gereklidir.
LB agar ortamı	VWR	846495000	Karşılaştırmalı kültürler için kullanılan standart ortam; litre başına: 10 g tripsin, 5 g maya özü, 10 g NaCl, 15 g agar.
Mikrosantrifüj tüpleri	Ratiolab	RATI5615000	Tohum sterilizasyonu ve numune işleme için kullanılır.
MS ortamı	Sigma	M0404-10L	Aksenoik çimlendirme için steril çimlendirme desteği olarak belirtilmiştir.
NZYTaq II 2× Master mix	Nzytech	MB35803	Amplifikasyon için PCR karışımı
Parafilm	Parafilm/Merck	HS234526A	Kirlenmeyi azaltarak çimlendirme plakalarını kapatmak için kullanılır.
Petri kabı	Labbox	PDIP-E9N-500	Çimlendirme kurulumu, plakalama ve sterilize edilmiş tohumların işlenmesi için kullanılır.
Fitoagar	Duchefa Biochemie	9002-18-0	Opsiyonel alternatif steril çimlendirme desteği olarak belirtilmiştir.
Pipet seti ve uçları	Merck	EP3123000918-1EA	Sterilize etme çözeltilerini çıkarmak, yıkama, seyreltme ve plakalamak için kullanılır.
R2A agar ortamı	HI-MEDIA	M1743-500G	Uzatılmış kültüromik iş akışları için opsiyonel ek ortam.
Sodyum klorür, NaCl	Fisher Chemical	10040460	Homojenizasyon ve seri seyreltmeler için steril %0,45 NaCl hazırlamak için kullanılır; ayrıca LB ortamının bir parçasıdır.
Sodyum hipoklorit	Carlo Erba	370323	Tohum yüzeyi sterilizasyonu için %20 v/v sodyum hipoklorit çözeltisi hazırlamak için kullanılır. Koroziftir; KKD gerektirir.
Steriller tek kullanımlık havaneli	Eppendorf	EP0030120973	Kuru tohumların ve çimlenen fidelerin homojenizasyonu için kullanılır.
Vorteks karıştırıcı	Fisher Scientific	15901137	Homojenatlardan mikrobiyal hücreleri yeniden süspanse etmek için kullanılır.