Yöntem makalesi

Langendorff Perfüzyonlu Fare Kalplerinde Atriyal ve Ventriküler Mekaniğin Değerlendirilmesi için Optik Sistem

DOI:

10.3791/72264

⸱

14 Ağustos 2026

 , 
1Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN, Unidad Monterrey

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, fare kalbinin çıkarılması ve kanülasyonu prosedürünün yanı sıra Langendorff retrograd perfüzyon sisteminin hazırlanmasını ve konfigürasyonunu açıklamaktadır. Deneysel düzenek, atriyumların ve ventriküllerin doğal dinamiklerini korurken mekanik tepkilerini değerlendirmek için tasarlanmış yüksek çözünürlüklü bir optik sistemle eşleştirilmiştir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fare kalbi, mühendislik teknolojilerindeki ilerlemelerin yardımıyla kardiyovasküler araştırmalarda yaygın olarak kullanılan bir model görevi görmektedir. Ancak, fare kalbinin küçük boyutu nedeniyle atriyal ve ventriküler kontraktilitenin değerlendirilmesi zor olmaya devam etmektedir. Bu çalışma, sağlam, izole bir kalpte kontraktilite ve kalp hızını değerlendirmek için yeni bir metodoloji sunmaktadır. Langendorff perfüzyonlu bir fare kalbinin yüksek çözünürlüklü bir optik sistemle birlikte kullanılması, atriyal ve ventriküler kontraktilitenin değerlendirilmesine olanak tanır. Deneysel kurulum, yüksek çözünürlüklü sinyaller elde ederken küçük kalp boyutu ve hızlı kasılma hızlarıyla ilişkili zorlukları gidermektedir. Dakikada 420 ila 660 atım (bpm) aralığındaki stimülasyon frekansı ile kalp kasılma frekansı arasındaki senkronizasyon, auksotonik yöntemden elde edilen sonuçlarla uyumluydu. Ek olarak, ventriküler kısalma ve atriyal dinamik sinyal ölçümleri, atriyoventriküler kasılmanın belirlenmesine imkan sağlamaktadır. Bu yöntem, farmakolojik veya sistemik etkiler olmaksızın, sağlam, izole bir kalpte kontraktilite ve kalp hızını değerlendirmek için uygundur. Bu sonuçlar, optik sistemin ventriküler ve atriyal kısalma yanıtlarının ölçülmesine olanak tanıdığını göstermektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kardiyak fizyolojide keşfedilecek çok şey vardır; kardiyak pacemaker (kalp pili) aktivitesi ve uyarılma-kasılma eşleşmesi gibi temel süreçler, sürekli olarak araştırılan merkezi ilkelerdir1. Biyolojik gürültünün kardiyak kontraktilite2 ve pacemaker aktivitesi üzerindeki etkileri henüz yeterince anlaşılamamış olsa da1, yeni optik görüntüleme yöntemleri yeni paradigmaların sunulmasına olanak sağlamıştır3,4.

Langendorff sistemini kullanan iki deneysel metodoloji, kardiyak fonksiyonların ölçülmesine paha biçilmez katkılar sağlamıştır. Birincisi, sol ventriküle yerleştirilen küçük bir balondan sinyal elde edilen izovolümetrik kontraksiyon yöntemidir5,6,7. İkincisi, kalbin aksı boyunca auksotonik kontraksiyonları ölçmek için bir ipliğin bir ucunun kalbin apeksine, diğer ucunun ise mekanik bir kayıt cihazına dikilmesiyle sinyal elde edilen auksotonik kayıt yöntemidir2,8. Bununla birlikte, fare kalbinin çok küçük boyutları nedeniyle atriyal ve ventriküler kontraktilitenin değerlendirilmesi zordur. Ayrıca, kalp yaralanmalara karşı hassas olduğundan, hazırlık aşaması belirli bir düzeyde özen ve naziklik gerektirir9,10,11,12,13.

Fare kalplerinin mekanik dinamiklerini değerlendirmek için kullanılan optik sistem, birkaç yeni özelliğe ve avantaja sahiptir. İlk olarak bu yöntem, farmakolojik veya sistemik etkilerin yokluğunda, sağlam ve izole bir kalpte kontraktiliteyi ve kalp hızını değerlendirmek için uygundur. Bu protokol ayrıca farmakolojik, hücre rejenerasyonu veya oksijen tedavisine dayalı tedavilerin incelendiği iskemi-reperfüzyon hasarını değerlendiren deneylerde de etkili bir şekilde kullanılabilir.

Bu makalede, yüksek çözünürlüklü bir optik sistem kullanarak fare kalp kasılma fonksiyonunun biyofiziksel parametrelerini kaydetmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, sağlam, izole bir kalpte kasılma gücünün ve kalp hızının değerlendirilmesine yardımcı olur. Ayrıca, atriyal ve ventriküler kasılmanın değerlendirilmesine olanak tanır. Langendorff fare kalbi preparatı, kas kasılmalarını engellemeden perfüzyon sıvısı sıcaklığı kaybını ve hareket artefaktlarını en aza indirmek için hafif bir modifikasyon içeren bir iyileştirme sunmaktadır.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan prosedürleri, Hayvan Deneyleri ve Bakımı Federal Düzenlemeleri'ne uygun olarak yürütülmüş ve CINVESTAV Hayvan Bakım Komitesi (CINVESTAV Zacatenco, D.F., Meksika) tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmada, 28–34 g ağırlığında ve 8–14 haftalık C57BL/6J erkek fareler kullanılmıştır. Protokolde kullanılan tüm materyal ve ekipmanlar Materyal Tablosu'nda listelenmiştir. Ek Dosyalar 1–11; protokol için destekleyici diyagramlar, yazılım kılavuzları, analiz programları, pacing verileri ve uygulama dosyaları sunmaktadır.

1. Stok hazırlama

  1. Önceden iki stok çözelti hazırlayın ve bunları 4 °C sıcaklıktaki bir buzdolabında saklayın: (1) Stok I, 1 L (deiyonize su içinde; g/L cinsinden: 76,13 NaCl, 4,02 KCl, 1 MgCl2(6H2O), 0,4 NaH2PO4) ve (2) Stok II, 0,1 L (deiyonize su içinde; g/L cinsinden: 73,5 CaCl2(2H2O)).
    NOT: Çözeltiler, hazırlandıktan sonra 30 güne kadar kullanılabilir. 4 °C'de saklayın.

2. Langendorff sisteminin bağlantısı ve temizliği

  1. Şekil 1A'da gösterildiği gibi rezervuarı (1), rezervuar termal banyosunu (2), perfüzyon pompasını (3), serpentini (4), serpentin resirkülatörünü (5), izleme sistemini (6) ve drenaj sistemini (8) bağlayın.
    NOT: İzleme sistemi ile drenaj sistemi arasındaki bağlantı, Ek Dosya 1'de daha ayrıntılı olarak gösterilmiştir.
  2. Langendorff sistemini 50 °C'de 1 L deiyonize su ile doldurun, ardından perfüzyon ve drenaj pompalarını çalıştırın (Ek Dosya 1, drenaj sistemi). Yaklaşık 20–30 dk sonra sıvıyı sistemden boşaltın ve bir sonraki adıma geçin.
    NOT: Sistemde herhangi bir sızıntı veya basınç düşüşü olmadığını doğrulayın. Böyle bir durum oluşursa deneye devam etmeyin.
  3. Sistemi 1 L %1 asetik asit (deiyonize su içinde çözünmüş) ile doldurun, ardından perfüzyon ve drenaj pompalarını kapatıp 60 dk bekleyin ve sıvıyı boşaltmak için pompaları tekrar açın.
  4. 2.2 adımını iki kez tekrarlayın.
  5. Çözelti bileşenlerinin yapışmasını önlemek için sistemi %70 etanol (deiyonize su içinde çözünmüş) ile doldurun.
    NOT: Langendorff perfüzyon sistemi her on deneyde bir veya ayda bir temizlenmelidir. Deney öncesi temizleme protokolü bölüm 4'te açıklanmıştır; deney sonrası temizleme protokolü ise bölüm 8'de detaylandırılmıştır.

3. Deney sırasında Tyrode solüsyonunun hazırlanması

  1. mM cinsinden 1 L çözelti hazırlayın: 130,25 NaCl, 5,4 KCl, 0,53 MgCl2(6H2O), 0,33 NaH2PO4, 1,8 CaCl2(2H2O), 10 D-glukoz, 10 HEPES; pH değeri NaOH ile 7,35 ± 0,05'e ayarlanmalıdır.
    1. 100 mL Stok I'i, sürekli karıştırma altında 700 mL deiyonize su ile karıştırın, ardından çözeltinin sıcaklığını 37 °C'ye çıkarın; Şekil 1A (1)'de gösterildiği gibi O2 tankını hava taşına bağlayarak çözeltinin oksijenasyonunu sağlayın.
    2. 1,8 mM CaCl2(2H2O) elde etmek için 3,6 mL Stok II ve 96,4 mL deiyonize su ekleyin, ardından pH'ı 7,35 ± 0,05'e ayarlamak için NaOH ekleyin.
    3. 1 L Tyrode çözeltisi elde etmek için hacmi deiyonize su ile tamamlayın.
      NOT: Çözeltinin 100 mL'sinin 4 °C'de buzdolabında saklanması önerilir; bu hacim daha sonra 6. adımda gerekecektir.

4. Langendorff sisteminin hazırlanması

NOT: Deney gününde Langendorff sistemi etanolle doldurulmamışsa, prosedüre devam edilmesi önerilmez; bunun yerine bölüm 2 tekrarlanmalıdır.

  1. Perfüzyon ve drenaj pompalarını çalıştırın. Perfüzyon pompası akış hızını 3 mL/min, drenaj pompasını ise 10 mL/min olarak ayarlayın. Sistemi drene edin.
  2. Sistemi 37 °C'de 1 L deiyonize su ile doldurun, ardından suyu drene edin.
  3. Sistemi adım 3'te hazırlanan Tyrode çözeltisi ile doldurun ve çözeltiyi fizyolojik sıcaklıkta ve sabit oksijenasyonda tutun.
  4. Rezervuar termal banyolarını ve serpentin resirkülatörünü çalıştırın. Çözeltiyi fizyolojik koşullar altında tutmak için rezervuar sıcaklığını (Şekil 1A (2)) 38 °C'ye ayarlayın. Serpentinin (Şekil 1A (5)) sıcaklığını 40 °C olarak ayarlayın. Bu, Langendorff sistemi çözeltisindeki sıcaklık kaybını telafi eder.
    NOT: Sistem çıkışındaki Tyrode çözeltisinin sıcaklığı fizyolojik düzeyde (37 ± 0.5 °C) değilse, serpentin resirkülatör sıcaklığını ayarlayın. Sıcaklık uygun değerde stabilize olana kadar 6. adıma geçilmesi önerilmez.
  5. Basınç monitörünü (Ek Dosya 1, izleme sistemi) açın ve 0–200 mmHg aralığında kalibre edin. Sistemin kalibrasyonuna yardımcı olmak için izleme ve pacing uygulaması mevcuttur (Ek Dosya 3 ve Ek Dosya 11).
    NOT: Sistemde basınç kaybı ve hava kabarcığı olmadığının doğrulanması esastır. Sistemde kabarcıklar varsa, serpentinin alt çıkışını geçici olarak kapatın ve üst valfi açın; bu, kolonun dolmasını sağlayarak kabarcıkların dışarı atılmasına imkan tanır. Bu durum doğrulanana kadar deneye devam edilmesi önerilmez.

5. Optik sistem14

  1. CMOS kamerayı monte edin (Şekil 1A, 10), ayarlanabilir kamera lensi (LC) ve aydınlatma sisteminden oluşur.
    NOT: Aydınlatma sistemi iki LED'den oluşur (Şekil 1A, 9), iki adet plano-konveks aydınlatma lensi (LI), bir aydınlatma kontrolü (Şekil 1A, 11), bir veri toplama kartı (Ek Dosya 1, izleme sistemi) ve 3D tasarımlı destek parçaları (Ek Dosya 1).
  2. Hacmi yaklaşık 1.000 mm³ olan bir referans nesne yerleştirin3 kamera lensinden 100–200 mm uzağa (merkezine Şekil 1A).
    NOT: Obje, Langendorff sisteminde kalp konumuna yerleştirilmelidir. Bu konum şurada gözlemlenebilir: Şekil 1B, özellikle ışık ışınlarının çarptığı görüntünün merkezinde.
  3. Kamera görüntüleme yazılımını başlatın, ardından kamerayı 4x alt örnekleme (4 piksel = 1 alt piksel) şeklinde ayarlayın. 200 x 200 alt piksel boyutunda bir ilgi alanı (ROI) belirleyin (Ek Dosya 2).
    NOT: Bu konfigürasyon ile saniyede 750 kare (fps) zamansal çözünürlük mümkündür.
  4. Aydınlatma sistemini açın (Ek Dosya 1), ışık demetlerini referans nesneye odaklanacak şekilde ayarlayın ve homojen aydınlatma sağlayın (Şekil 1B).
  5. Görüntünün aşırı pozlanmasını önlemek için referans nesne üzerindeki ışık şiddetini ayarlayın.
    NOT: Görüntü şu şekilde görünmelidir Şekil 2A (veya Şekil 1C, Kontrol PC'si). Nesnenin (kalp) yüzeyindeki yansımalar, kontur netliği kaybolmadan mümkün olduğunca azaltılmalıdır. Bu işlem, Aydınlatma kontrol gücü ayarlanarak veya kamera ayarlarından pozlama süresi düşürülerek gerçekleştirilebilir.
  6. Referans nesnenin net bir görüntüsünü elde etmek için kamera lensini odaklayın (Şekil 1C, kontrol bilgisayarı). Referans nesnenin görüş alanının %80'ini kapladığından emin olun (Şekil 2A) alt piksel başına yaklaşık 61 µm'lik bir dönüştürme ölçeği elde etmek için.
    NOT: Kamera görüntüleme moduna ayarlandığında, optik sistem aydınlatma sistemini otomatik olarak etkinleştirir (Şekil 1A ve Ek Dosya 2). Aşırı ısınmayı önlemek amacıyla, aydınlatma sisteminin kapalı kalması için kameranın bekleme modunda tutulması ve yalnızca deneysel veri toplama dönemlerinde etkinleştirilmesi önerilir.

6. Cerrahi ve kanülasyon prosedürleri

  1. Heparinizasyon ve anestezi
    1. Tiletamin-zolazepam (40 mg/kg fare vücut ağırlığı) ve ksilazin (10 mg/kg fare vücut ağırlığı) içeren bir anestezik karışım hazırlayın, ardından salin solüsyonu ile 200 µL'ye seyreltin.
    2. Anestezik karışımı 27 G iğne kullanarak intraperitoneal olarak enjekte edin. Fareye derin anestezinin gelişmesi için zaman tanıyın.
      NOT: Uzuvlarda veya kuyrukta bir uyarana karşı refleksin yokluğunu doğrulayın (genellikle 10 dk yeterlidir).
    3. 27 G iğne kullanarak 200 UI fraksiyone edilmemiş heparini intraperitoneal olarak enjekte edin ve deneye devam etmek için yaklaşık 5 dk bekleyin.
  2. Ekstraksiyon ve kanülasyon
    1. Fareyi sırt üstü pozisyona getirin, göğüs bölgesindeki tüy ve deriyi cerrahi makasla temizleyin.
    2. Diyaframın bütünlüğünü koruduğunuzdan emin olarak, diyaframın altına bir abdominal insizyon yapın.
    3. Diyaframda transvers bir insizyonla devam edin ve kaburgalar aracılığıyla hızlıca bilateral asendan torakotomi gerçekleştirip kaburga duvarını kaldırın.
      NOT: Kalbe zarar vermemeye dikkat edin. İşlem sırasında kalbin zarar görmesi veya hasar alması durumunda, deneyin sürdürülmemesi önerilir.
    4. Kalbin üst yapılarını, aortik arkı ve komşu damarları ince cımbızlar kullanarak nazikçe tutun. Alt taraftan yukarıya doğru bir kesi yapmak için nazikçe kaldırın ve kalp ile akciğerleri birlikte çıkarın.
    5. Kalbi, ilk yıkama için 4 °C'de 50 mL Tyrode solüsyonu içeren bir petri kabına hızlıca aktarın.
      NOT: Diyafram kesildiği andan itibaren hayvan solunum sıkıntısı çekmeye başlayacaktır; bu noktadan itibaren 6.2.3–6.2.6 arasındaki adımları gerçekleştirmek için 60 s'lik bir zaman dilimi vardır. Bu süre sınırının aşılması iskemik hasara yol açabilir.
    6. Bir stereoskopik mikroskop ve ince makas kullanarak, aortik arkı açığa çıkarmak için akciğerleri ve fazla adipöz dokuyu temizleyin.
      NOT: Dokuyu temizlerken aortik arkın zarar görmediğinden emin olun. Aort brakiyosefalik arterin altından kesilirse kanülasyon zorlaşacak ve bu durum potansiyel olarak basınç sızıntılarına yol açacaktır.
    7. Kalbi, 4 °C'de 50 mL Tyrode tamponu içeren özel yapım kanülasyon tabanına aktarın ve aortik ekstremiteyi 20 G iğneden özel olarak yapılmış kanülün içine yerleştirin (Ek Dosya 1).
      NOT: Aort kapağına zarar vermemeye dikkat edin. Kapak zarar görürse kalp şişer ve koroner dolaşım düzgün şekilde yıkanmaz.
    8. 4/0 ipek sütür kullanarak iki kanülasyon düğümü atın: birincisi kanül ucunun distalindeki girintiye ve ikincisi brakiyosefalik trunkus öncesine (Ek Dosya 1).
    9. Oda sıcaklığındaki tamponla doldurulmuş 1 mL'lik bir şırınga kullanarak yavaşça Tyrode solüsyonu uygulayın. İyi bir kanülasyonu doğrulamak için koroner dokunun berraklaştığını kontrol edin.
    10. Ventriküllere ve atriyumlara erişim sağlamak için adipöz dokuyu temizleyin.
      NOT: Kalp canlılığını korumak için kanülasyon süresinin 5 dk'yı aşmamasını sağlayın.
    11. Kalbi bir Langendorff sistemine aktarın ve 30 dk boyunca stabilize olmasına izin verin.
      NOT: Kalp, sistemin merkezine (Şekil 1A,B) dikey olarak asılı şekilde yerleştirilir. Kalbi asarken hava kabarcığı oluşmasını önlemek için azami dikkat gösterin. Bu durum meydana gelirse, basınç 140 mmHg'nin üzerine çıkar, kalp şişmeye başlar ve artık canlı olmaz.
      NOT: Kalp mekanik olarak stabil bir yanıt, yaklaşık 360 atım/dakika (BPM) doğal bir osilasyon frekansı ve 60 ile 110 mmHg arasında bir perfüzyon basıncı sergilediğinde Langendorff düzeneği tamamlanmış olur.

7. Tempo protokolü ve video kaydı

  1. Kalp canlılığı
    1. 3 mL/min perfüzyon pompası ile koroner basıncın 60–110 mmHg aralığında olduğunu doğrulayın. Koroner perfüzyon basıncı 60 mmHg'nin altına düşerse, perfüzyon pompası akış hızını hafifçe artırın (düşük basınç, kalbin soluklaşmasına ve gevşemesine neden olur). Aksine, basınç 110 mmHg'yi aşarsa, pompa akış hızını hafifçe azaltın (aşırı basınç, doku ödemine ve kalp durması gerçekleşene kadar basınçta kademeli bir artışa yol açar).
      NOT: Perfüzyon basıncının yukarıda belirtilen optimal aralığın dışında uzun süre tutulması, kalp canlılığını geri döndürülemez şekilde bozar.
    2. Kalbi, kamerada tam frontal görünüm elde edilecek şekilde frontal pozisyona getirin. Her iki atriumun da kamerada görünecek şekilde konumunu ayarlayın (Şekil 2A).
    3. Platin elektrotları sağ atriumun üst kısmındaki pacemaker düğümüne yüzeysel olarak nazikçe yerleştirin. Elektrotları görüş alanına getirmek için kamera akışını kılavuz olarak kullanın. Elektrodu sağ atriumu engellemeyecek şekilde konumlandırın. Kamera canlı görünümünü izlerken, aşırı kompresyon uygulamamaya (bu durum görüntüde sağ atriumu düzleştirir) dikkat ederek, elektrodu atrium dokusuyla temas edene kadar yavaşça ilerletin.
      NOT: Doğru şekilde gerçekleştirildiğinde, kamera görünümü Şekil 2A'ya benzeyecektir.
    4. İzleme ve pacing uygulamasını başlatın (Ek Dosya 11) ve veri toplama kartını açın (Şekil 1A (6)). Stimülasyon parametre değerlerini ayarlayın: amplitüd 2 V, frekans 420, 540 ve 720 pulses per minute (PPM), 7 ms duty-cycle kare dalga pulse (Şekil 2A'nın iç eki).
    5. Canlılık stimülasyonlarını en düşük frekanstan başlayarak uygulayın; her olay arasında 20 s stimülasyon süresi ve ardından 20 s recovery süresi (dinlenme süresi) kullanın.
      NOT: Kalp canlılığını kamera izleme yoluyla değerlendirin. Organ fizyolojik olarak fonksiyonel ise, uygulanan stimülasyon ile kardiyak yanıt arasında bir senkronizasyon ve kalp odacıkları arasında uygun bir koordinasyon gözlemlenecektir. Aksine, canlılık eksikliği, odacık koordinasyonunun kaybı veya yalnızca izole atrial kasılmaların varlığı ile kendini gösterecektir.
    6. Deney oda ışığına ve termal dalgalanmalara duyarlı olduğundan hazne kapağını kapatın (Şekil 1C).
      NOT: Deney süresince hazne kapağı kapalı kalmalıdır. Kalp canlılığını kamera ve perfüzyon basıncı ile izleyin.
  2. Veri kaydı
    1. 30 s süreli kare dalga pulse trenlerinden ve ardından 30 s sinyalsiz dönemden oluşan pacing protokolünü uygulayın. Her pacing trenindeki stimülasyon parametre değerlerini şu şekilde ayarlayın: amplitüd 2 V, 7 ms duty cycle ve frekans 360 ile 720 PPM aralığında.
      NOT: Pacing protokolü 360 PPM ile başlar ve her zaman noktasında 60 PPM artar (Şekil 2A'nın iç eki).
    2. Kamera veri toplama yazılımını (Ek Dosya 2) kullanarak kalbin frontal görünüm dinamiklerinin videolarını sürekli olarak .avi formatında kaydedin. Her pacing treninin 20 s'lik bir video kaydını yapın. Pacing'den 5 s sonra başlayan 20 s'lik segmenti kaydedin. Temsili bir ham kayıt Ek Video 1'de sunulmuştur.
      NOT: Bir bilgisayar, izleme ve pacing uygulaması ile kamera veri toplama yazılımı tarafından sırasıyla oluşturulan, her kaydedilen videoya (.avi) karşılık uygulanan pacing trenini (.xls, Ek Dosya 9) eş zamanlı olarak kaydeder (Ek Dosya 2 ve Ek Dosya 3).
    3. Stimülasyon protokolü başlamadan önce kaydedilen birinci videoyu, protokol uygulandıktan sonra kaydedilen ikinci video ile karşılaştırarak kalp canlılığını doğrulayın (Şekil 2B).

8. Langendorff perfüzyon sisteminin deney sonrası temizliği

  1. Stimülasyon ve EKG platin elektrotlarını çıkarın. Kalbi sistemden çıkarın ve tüm kalıntı Tyrode çözeltilerini boşaltın.
  2. Optik sistemi kapatın ve O2 vanasını kapatın.
  3. Sistemi 37 °C'de 1 L deiyonize su ile durulayın ve sistemi boşaltın.
  4. 2.4 ve 2.5 numaralı adımları tekrarlayın.
  5. Tüm sistemleri ve ekipmanları kapatın.

9. Video işleme

  1. Her bir videoyu hesaplama yazılımına aktararak ve bir video normalleştirme işlevi uygulayarak başlayın15.
  2. Kalp bölgesini içeren bir ilgi alanı (ROI) seçin. Arka plan gürültüsünü, elektrotları ve kanülü temizlemek için görüntü segmentasyonu gerçekleştirin (Ek Dosya 4).
    NOTKaldırılacak görüntü alanını doğru şekilde seçmek için lütfen şuraya başvurun: Ek Dosya 10.
  3. küresel mekanik dinamik analizi gerçekleştirin (Ek Dosya 5). Destekleyici değişkenlik ve sinyal örnekleri şurada gösterilmiştir: Ek Şekil S1, Ek Şekil S2ve Ek Şekil S3.
    1. Kalp çevresini tespit etmek için her bir video karesine morfolojik operatörler uygulayın, ardından bir maske oluşturmak için kare doldurma algoritması uygulayın15.
    2. Her karedeki segmente edilmiş alan içindeki pikselleri sayın, ardından dinamik bir sinyal üretmek için bu sayıyı görüntüdeki toplam piksel sayısına oranlayarak normalize edin (eklenmiş görünüm Şekil 2B ve Ek Şekil S3).
    3. Yüksek frekanslı gürültüyü ve perfüzyon damlama artefaktlarını bastırmak için elde edilen sinyale 3 ila 100 Hz arasında 5. dereceden çift yönlü bir Butterworth filtresi uygulayın15.
    4. Kayıt altına alınan maksimum ve minimum değerleri kullanarak tüm videolardaki sinyalleri normalize edin.
    5. Her bir dinamik ve stimulus sinyali için iki maksimum genlik değeri arasındaki aralığı (IAA (s)) hesaplayarak kalp hızını belirleyin.
    6. Aşağıdaki formül ile BPM cinsinden frekansı elde edin:
      Frequency calculation formula, Frequency(BPM)=60/IAA, used in heart rate analysis.
    7. Kısa ve uzun dönemli değişkenliği göstermek için IAA verilerinden Poincaré haritaları oluşturun16,17,18 (Ek Şekil S1 ve Ek Şekil S2).
      NOT: Daha detaylı bilgi için lütfen şuraya bakınız: Ek Dosya 10.
  4. ventriküler mekanik dinamiklerin segmental analizini gerçekleştirin (Ek Dosya 6).
    1. Görüntü ikiliyleştirmesi uygulayın. ROI'den ödün vermeden, ventriküler alanı sınırlamak için morfolojik operatörler kullanarak alanı eliptik bir geometriye göre ayarlayın.15.
    2. Her karedeki ventriküler alana minimum bir elips uydurun. Bir karedeki bir dizi distal noktanın koordinatlarını çıkarın. Y ekseni boyunca her iki uç noktada 10-20 noktalık bir set kullanın (Şekil 3A). Temsili bir elips kestirim çıktısı şurada sunulmuştur: Ek Video 2.
    3. Ventriküler kısalmayı, her videodaki Y ekseni boyunca uç noktalar arasındaki ortalama mesafe olarak hesaplayın19.
    4. Yüksek frekanslı gürültüyü ve perfüzyon damlama artefaktlarını bastırmak için elde edilen sinyale 3 ile 100 Hz arasında 5. derece çift yönlü bir Butterworth filtresi uygulayın15.
    5. Ventriküler kısalma sinyalini her bir pacing için elde edilen tüm videolara göre normalize edin ve kalp hızını ile gecikmeyi 9.3.5–9.3.6. adımlarında olduğu gibi hesaplayın.
      NOT: Ventriküler döngü süresi (DVE), gevşeme süresi (DVW), interventriküler aralık (IVV) ve ventriküler genlik (VA) gibi parametreler elde edilir (Şekil 3A).
      NOT: Daha ayrıntılı bilgi için lütfen şuraya başvurun: Ek Dosya 10.
  5. atriyumlardaki mekanik dinamiklerin segmental analizini gerçekleştirin (Ek Dosya 7).
    1. Atriyumları belirlemek için iki ROI (ilgi alanı) kullanın (Şekil 3C).
    2. Her bir atriumu ayrı ayrı analiz edin.
      1. ROI'yı riske atmadan ayarlama yaparken, atriyumları belirlemek için morfolojik operatörler kullanın15Her bir atriyumu belirlemek için kontrast artırıcı bir algoritma kullanın.20,21.
      2. Görüntü ikileştirme uygulayın ve her karede sıfırdan farklı olan piksel sayısını nicelendirerek bir atriyal dinamik sinyal elde edin.
      3. Yüksek frekanslı gürültüyü ve perfüzyon damlama artefaktlarını bastırmak için elde edilen sinyallere 3 ile 100 Hz arasında 5. derece çift yönlü Butterworth filtresi uygulayın15.
      4. İki atriyal sinyalin ortalamasını hesaplayın (Şekil 3D).
    3. Atriyal kısalma sinyalini, her pacing için elde edilen tüm videolara göre normalize edin ve 9.3.5–9.3.6. adımlarında olduğu gibi kalp hızını ve gecikmeyi hesaplayın.
      NOT: Atriyal döngü süresi (DAE), atriyal-atriyal aralık (IAT) ve atriyal amplitüd (AA) gibi parametreler elde edilir (Şekil 3D). Daha ayrıntılı bilgi için Ek Dosya 10'a bakınız.
  6. Elektromekanik analiz gerçekleştirin13,22 (Ek Dosya 8).
    1. pacing verilerinile atriyal ve ventriküler sinyalleri karşılaştırın (Şekil 3D).
    2. Kalp iletim sistemindeki yayılım süresini hesaplayarak atrium ve ventriküler olaylar arasındaki gecikmeyi elde edin (AVD), uygulanan uyaranı referans alarak.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kardiyak mekanik fonksiyon deneyleri, Şekil 1A(Üst)'da gösterildiği gibi Langendorff aparatı kullanılarak gerçekleştirilir. İzleme ve optik sistemler, Şekil 1A(Alt)'da gösterildiği gibi, aydınlatma kontrolü tetiklendiğinde video kaydına olanak tanır. Şekil 1C, kalbi ortamdaki termal dalgalanmalardan ve ışıktan izole etmek için tasarlanmış olan termostatik kontrollü kabinin dış görünümünü göstermektedir. Şekil 1B'de tasvir edildiği gibi, izole edilen kalp; Langendorff, optik sistem ve stimülasyon sistemlerini içeren deneysel düzeneğe bir referans nesne olarak yerleştirilir.

Şekilde gösterildiği gibi Şekil 2Aizole kalp, retrograd perfüzyon altında atriyumların ve ventriküllerin net bir frontal görüntüsünü elde etmek üzere konumlandırıldı. Drenaj tabanının kullanımı (Ek Dosya 1, drenaj sistemi) damlayan perfüzyon sıvısının oluşturduğu hareket artefaktlarını azaltmak ve elde edilen sinyalleri stabilize etmek için temel bir gereklilikti. Stimülasyon protokolleri, her biri 30 saniye süren ve 360 ile 720 bpm arasında değişen frekanslardaki puls trenlerinden (2 V, 7 ms) oluşmaktaydı.

Optik sistem, kalp bölgesindeki (HA) değişimleri kaydeder. Bu dinamik sinyal, aynı zamanda pikler arası zaman aralığının (IAA) elde edilmesine olanak tanır (Şekil 2B'deki ek). Model canlılığı, n = 6 kalplik bir kohortta, stimülasyon protokolü öncesindeki (Başlangıç) ve sonrasındaki (Bitiş) ortalama kalp hızları karşılaştırılarak değerlendirilmiştir. Ortalama kalp hızlarında anlamlı bir fark saptanmamıştır (Başlangıç: 385 ± 38 BPM'ye karşılık Bitiş: 372 ± 18 BPM, Student t-testi P > 0.05), bu durum deneysel prosedürün kardiyak fonksiyonu etkilemediğini göstermektedir (Şekil 2B).

Şekil 2C, kalbin yedi farklı stimülasyon frekansına verdiği frekans yanıtını sunmakta ve belirgin bir lineer ilişki sergilemektedir2 (R2 = 0.98 ± 0.01, 1:1 mod). Minimum pacing değeri, farenin fizyolojik özellikleri ile sınırlandırılmıştır (360 bpm)22,23. Langendorff perfüzyonuna tabi kalp, taşikardik bir profil göstermektedir. Temsili pacing stimülasyonları ve bunlara karşılık gelen yanıtlar, Şekil 2C'nin iç görsellerinde betimlenmiştir.

Ardından, kalp odacıklarının dinamiklerini değerlendirmek için spesifik segmentasyon teknikleri uygulanır. Ventriküler kısalma parametreleri optik kayıtlardan elde edilmiştir (Şekil 3A). Şekil 3A'daki ek kutu, normalize edilmiş ventriküler kısalmayı göstermektedir. Bu dinamik sinyalden dört parametre elde edilir: ventriküler kısalma genliği (VA), ventriküler kasılmalar arasındaki zaman aralığı (IVV), ventriküler kasılma süresi (DVE) ve ventriküler gevşeme süresi (DVW).

Şekil 3B yedi farklı pacing değeri için ventriküler kısalma genliğini göstermektedir. Mavi çubuklar bu çalışmayı temsil etmektedir. Turuncu çubuklar ise auksotonik kayıt yöntemiyle2 elde edilen verilere karşılık gelmektedir. İki yönlü ANOVA ve ardından Sidak testi kullanılarak istatistiksel analiz uygulanmıştır. Daha yüksek pacing değerleri olan 600 PPM ve 660 PPM için ventriküler kısalma genliği (VA), sırasıyla anlamlı şekilde artış göstermektedir (P < 0.05*, P < 0.005**). VA (ref. 15'e karşı 360 P > 0.05, ref. 15'e karşı 420 P > 0.05, ref. 15'e karşı 480 P > 0.05, ref. 15'e karşı 540 P > 0.05, ref. 15'e karşı 600 P < 0.005, ref. 15'e karşı 660 P < 0.05, ref. 15'e karşı 720 P > 0.05).

Atrial alanı elde etmek için özel segmentasyon teknikleri uygulanır (Şekil 3C). Her bir atriumda bir ROI tanımlanır. Şekil 3D, atrial ortalama sinyali ve ventriküler kısalmayı göstermektedir. Bu dinamik sinyalden iki parametre elde edilir: atrial amplitüd (AA) ve atrial kontraksiyonlar arasındaki zaman aralığı (IAT). Ventriküler ve atrial sinyaller karşılaştırılarak, atria ile ventriküler olaylar arasındaki gecikme (AVD) belirlenir.

Kardiyak araştırmalar için Langendorff sistem diyagramı ve kurulumu; perfüzyon pompası ve optik sistem içerir.
Şekil 1. Kabine monte edilmiş Langendorff izole kalp ve optik sistem deneysel kurulumu. (A) Bir optik sisteme bağlı, sabit akışlı retrograd Langendorff perfüzyon sisteminin şematik diyagramı. Langendorff sistemi (Üst), şunları içerir: (1) sürekli oksijenlendirilen Tyrode çözeltisi içeren bir rezervuar. Perfüzat sıcaklığı, (2) bir termal banyo rezervuarı ve (5) serpentin resirkülatör ile 37 °C'de tutulur. (3) Peristaltik perfüzyon pompası 3 mL/min sabit akış sağlar. (8) Bir drenaj sistemi çözeltiyi uzaklaştırır. (4) Soğutma bobini, hem bir ısı eşanjörü hem de bir kabarcık tuzağı görevi görür. Basınç izleme ve elektriksel stimülasyon uygulamaları (6) izleme sistemi tarafından kontrol edilir. Optik sistem (alt), (11) aydınlatma kontrolü, (10) telesentrik lensli yüksek hızlı kamera ve iki ışık kaynağı (LED'ler) arasındaki senkronizasyonu içerir. Kamera lensi 100–200 mm aralığında manuel odaklamaya izin verir. Plano-konveks bir lens (LI) ile eşleştirilmiş (9) iki LED, kalbi homojen bir şekilde aydınlatır. Stimülasyon verileri, izleme ve stimülasyon uygulaması (Ek Dosya 11) kullanılarak kaydedilir. (7) Kontrolör PC, verileri (video ve elektriksel stimülasyon) eş zamanlı olarak kaydetmek için kameraya ve izleme ve stimülasyon uygulamasına bağlıdır. (B) Kabin iç görünümü. Kalbin dikey konumu referans nesne aracılığıyla gösterilmiştir. Langendorff düzeneğinin diğer elemanları gösterilmektedir. (C) Kabin dış görünümü. Kabin termal olarak izole edilmiştir ve siyah iç ve dış duvarlar yansımaları ve ortam ışığını minimize eder. İzleme ve video yakalama uygulamalarını çalıştıran bilgisayar gösterilmektedir. Kısaltmalar: LC = telesentrik lens; LEDs = ışık yayan diyotlar; LI = aydınlatma lensi; PC = kişisel bilgisayar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.

EKG ile kalp stimülasyonu deney düzeneği; yanıt frekans grafiği; stimülasyon frekansı grafiği.
Şekil 2. Monte edilmiş fare kalbi ve optik sistem doğrulaması. (A) Atriyumları, ventrikülleri, pacing ve EKG elektrotlarını gösteren frontal kalp görünümü. Görüntü, 420 bpm pacing hızındaki bir kareye karşılık gelmektedir (Ek Film 1). Küçük resim uygulanan pacing işlemini göstermektedir. Video, stimülasyon protokolünün 5. ve 25. saniyeleri arasında kaydedilmiştir. (B) Kalp canlılık testi. Osilasyon frekansını elde etmek için biri pacing protokolü uygulanmadan önce, diğeri uygulandıktan sonra olmak üzere iki video kaydedilmiştir. Yanıt frekansı hesaplanmıştır. Student’s t-testi uygulanmıştır (P > 0.05). Gruplar arasındaki fark anlamlı değildir. Veriler ortalama değerler ± standart sapma (n = 6) olarak sunulmuştur. Küçük resim, protokol adım 9.3'ten elde edilen kalp alanını (HA) ve uygulanan pacing işlemini göstermektedir. (C) Uygulanan pacing işlemine karşı kalp hızı yanıtı. Mavi çubuklar, yedi pacing değerine verilen kalp yanıtını göstermektedir (R2 = 0.98 ± 0.01). Turuncu çubuklar Peña-Romo tarafından rapor edilen verilere karşılık gelmektedir2. Küçük resim tipik yanıt izlerini göstermektedir. İstatistiksel analiz, iki yönlü ANOVA ve ardından Sidak testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Gruplar arasındaki fark anlamlı değildir (P > 0.05). Veriler ortalama değerler ± standart sapma (n = 6) olarak sunulmuştur. Kısaltmalar: ANOVA = varyans analizi; BPM = dakika başına atım; ECG = elektrokardiyogram; HA = kalp alanı; PPM = dakika başına darbe. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.

Kardiyak görüntüleme ve grafik analizi; vs/RA+LA; amplitüd grafiği; normalize edilmiş sonuçlar; deneysel düzenek.
Şekil 3. Atriyal ve ventriküler mekanik yanıtın analizi. (A) Ventriküler kısalma. Görüntü, 420 bpm pacing hızındaki bir kareye karşılık gelmektedir (Supplementary Movie 1). Kırmızı bir elips, ventriküler kısalmanın (VS) tahmin edilmesine olanak tanır (Supplementary Movie 2). VS, majör eksen boyunca 10–20 hatlık bir set (NV; turuncu çizgiler) üzerinden maksimum ve minimum değerlerin ortalaması alınarak hesaplanır. Normalize edilmiş ventriküler kısalma iç ekte gösterilmiştir. Bir dizi parametre elde edilebilir: kısalma süresi (DVE), gevşeme süresi (DVW), ventriküler kasılmalar arasındaki zaman aralığı (IVV) ve ventriküler kısalma amplitüdü (VA). (B) Pacing'in bir fonksiyonu olarak kardiyak yanıt amplitüdü VA gösterilmiştir. Mavi çubuklar bu çalışmayı temsil etmektedir. Turuncu çubuklar, auksotonik kayıt yöntemiyle2 elde edilen verilere karşılık gelmektedir. İki yönlü ANOVA ve ardından Sidak testi kullanılarak istatistiksel analiz uygulanmıştır. Daha yüksek pacing değerleri olan 600 PPM ve 660 PPM için ventriküler kısalma amplitüdü (VA), sırasıyla anlamlı şekilde artmaktadır (P < 0.05*, P < 0.005**). VA (ref. 15 vs. 360 P > 0.05, ref. 15 vs. 420 P > 0.05, ref. 15 vs. 480 P > 0.05, ref. 15 vs. 540 P > 0.05, ref. 15 vs. 600 P < 0.005, ref. 15 vs. 660 P < 0.05, ref. 15 vs. 720 P > 0.05). Veriler ortalama değerler ± standart sapma (n = 6) olarak sunulmuştur. (C) Atriyal segmentasyon. Görüntü, 420 bpm pacing hızındaki bir kareye karşılık gelmektedir (Supplementary Movie 1). Görüntü, sağ atriyuma (sarı daire) ve sol atriyuma (mavi daire) uygulanan ilgi bölgelerini (ROI) göstermektedir. Atriyal mekanik sinyal, her iki ROI'nin ortalaması alınarak elde edilir. (D) Atriyal ve ventriküler dinamikler. Ortalama atriyal alan (siyah çizgi), ventriküler kısalma (mavi çizgi) normalize yanıtları ve 420 bpm'deki pacing (kırmızı çizgi) gösterilmiştir. Bir dizi parametre elde edilebilir: atriyal kasılmalar arasındaki zaman aralığı (IAT), ortalama atriyal amplitüd (AA) ve atriyo-ventriküler gecikme (AVD). Kısaltmalar: AA = atriyal amplitüd; ANOVA = varyans analizi; AVD = atriyo-ventriküler gecikme; DVE = ventriküler kısalma süresi; DVW = ventriküler gevşeme süresi; IAT = atriyo-atriyal aralık; IVV = interventriküler aralık; NV = ventriküler hat sayısı; PPM = dakika başına darbe; ROI = ilgi bölgesi; VA = ventriküler kısalma amplitüdü; VS = ventriküler kısalma. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video 1. 420 PPM stimülasyon altındaki video. 200 x 200 alt piksel uzaysal çözünürlükte ve 750 fps zamansal çözünürlükte kaydedilmiş izole bir fare kalbinin kaydı. Kısaltmalar: fps = saniyedeki kare sayısı; PPM = dakika başına darbe sayısı.Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.

Ek Video 2. Ventriküler kısalma için elips kestiriminin temsili videosu. Ek Video 1'deki kaydın 75 fps hızında yeniden örneklenerek segmentasyon algoritmasının gösterimi. Kısaltma: fps = saniye başına kare sayısı.Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.

Ek Şekil S1. Kalp alanı aralıklarının değişkenlik analizi. (A) Stimülasyonsuz bazal durum, (B) 360 PPM, (C) 420 PPM ve (D) 480 PPM. Kısa süreli ve uzun süreli değişkenlik, kırmızı elips ile gösterildiği üzere, veri ortalamasına göre dağılım olarak hesaplanmıştır. Kısaltmalar: IAA = kalp alanı aralığı; PPM = dakika başına atım sayısı; SD1 = kısa süreli değişkenlik; SD2 = uzun süreli değişkenlik.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S2. Kalp alanı aralıklarının değişkenlik analizi. (A) 540 PPM, (B) 600 PPM, (C) 660 PPM ve (D) 720 PPM. Kısa dönemli ve uzun dönemli değişkenlik, kırmızı elipsle belirtildiği üzere, veri ortalamasına göre dağılım olarak hesaplanmıştır. Kısaltmalar: IAA = kalp alanı aralığı; PPM = dakika başına atım sayısı; SD1 = kısa dönemli değişkenlik; SD2 = uzun dönemli değişkenlik.Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek Şekil S3. Kontraktil dinamiklerden elde edilen normalize edilmiş sinyallerin zamansal grafiği. Uygulanan stimülasyon 420 PPM (kırmızı) idi ve yanıtlar genel kalp alanını (siyah), ventriküler kısalmayı (mavi) ve atriyal alan dinamiklerini (sarı) içermektedir. Kısaltma: PPM = dakika başına atım sayısı.Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.

Ek Dosyalar 1–11. Algoritmalar ve teknik dokümantasyon. Şunları içeren sıkıştırılmış klasör: 1) 3B yazıcıyla üretilen parçaların görüntüleri ve spesifikasyonları. 2) Kamera görüntüleme yazılımı için ayrıntılı kılavuzlar. 3) İzleme ve pacing uygulamaları için ayrıntılı kılavuzlar. 4) Video normalizasyonu ve segmentasyonu için hesaplama programı (adımlar 9.1–9.2). 5) Kalbin global mekaniklerini hesaplamak için hesaplama programı (adım 9.3). 6) Ventriküler mekaniklerin segmente hesaplamaları için hesaplama programı (adım 9.4). 7) Atriyum mekaniklerinin segmentasyonu için hesaplama programı (adım 9.5). 8) Atriyoventriküler gecikmeyi hesaplamak için hesaplama programı (adım 9.6). 9) Ek Video 1'e uygulanan elektriksel pacing. 10) Hesaplama programlarının çalıştırılmasına yönelik ayrıntılı kılavuz (Dosyalar 4–7). 11) İzleme ve pacing uygulaması. Ayrıca, hesaplama programlarının çalışması için gerekli olan beş harici fonksiyon (AumCont, filterPeaks, FucCordenada, FucMaskIm, FucPoincare) bulunmaktadır.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fare kalbi sıcaklık değişimlerine karşı oldukça hassastır2,9,10,11,22. Bu deneyde, perfüze edilen kalp dikey olarak konumlandırılmıştır. Langendorff perfüzyon yönteminde perfüzat sıcaklığı kaybını ve hareket artefaktlarını en aza indirmek için hafif bir modifikasyon ekledik. Perfüzat sıcaklığı kaybını 37 ± 0.5 °C düzeyinde minimize etmek için serpentin sistemine bir resirkülasyon pompası ve hareket artefaktlarını azaltmak için bir drenaj tabanı eklenmiştir. Ayrıca, Şekil 1'de gösterildiği gibi, optik bir sistem ve kardiyak dokuyu homojen şekilde ışınlamak amacıyla bilateral olarak yerleştirilmiş iki adet ayarlanabilir yoğunluktaki LED ışık kaynağı ile donatılmış termal yalıtımlı bir kabin kullanılmıştır.

Deneysel montajın fizibilitesini incelemek için, farklı pacing koşulları altında kalp alanı değişimlerini izlemek amacıyla bir dizi deney gerçekleştirilmiştir. Pacing ile kalbin frekans cevabı arasında, auxotonic kayıt yöntemini8 kullanan Peña-Romo tarafından bildirilen senkronizasyon bölgesiyle2 uyumlu bir senkronizasyon aralığı elde edilmiştir. Optik deneysel düzeneğin, ventrikül kısalmasına yönelik daha ileri deneysel çalışmaları desteklemek için yeterli olduğu sonucuna varılabilir (Şekil 2).

Ventriküler kısalma ve atriyal alan dinamikleri sinyallerinin, kalbin elektromekanik eşleşmesinin analizine olanak sağlayıp sağlamadığını daha ayrıntılı olarak inceledik. Ventriküler ve atriyal sinyaller, atriyoventriküler kasılmadaki gecikme süresinin (AVD) belirlenmesine imkan tanır. 420 PPM'lik bir stimülasyon frekansında, 53 ± 14 ms (ortalama ± SD) değeri elde edilmiştir. Bu sonuç, bir elektrokardiyogram (ECG) ile ölçülen 44 ± 6 ms'lik bir PR aralığı bildiren VanderBrink'in24 bulgularıyla uyumludur.

Bu yöntemin bazı kısıtlamaları da vardır; Şekil 3B'de gösterildiği üzere, EKG tekniklerine kıyasla atriyoventriküler gecikmedeki ve auxotonic kayıt yönteminden elde edilen sonuçlara kıyasla ventriküler amplituddaki tutarsızlıklar, harici hareket artefaktlarından kaynaklanmış olabilir.

Bu yöntem, sağlam izole bir kalpte farmakolojik veya sistemik etkiler olmaksızın kontraktilitenin ve kalp hızının değerlendirilmesine katkıda bulunur. Bu sonuçlar, optik sistemin kalbin ventriküler ve atriyal kısalma yanıtlarının ölçülmesine olanak tanıdığını kanıtlayarak, atriyoventriküler koordinasyonu bozan aritmi çalışmalarında veya farmakolojik etkilerin değerlendirilmesinde kullanımının yararlılığını vurgulamaktadır.

Bu yöntemin bazı kısıtlamaları da bulunmaktadır. İlk olarak, 2D bir yaklaşım olduğu için, oksutonik yöntemde olduğu gibi kasılma kuvvetini ölçmek mümkün değildir. Bu yöntem aynı zamanda çözelti damlacıklarından kaynaklanan hareket artefaktlarını azaltmak ve çözelti sıcaklığını kontrol etmek açısından da faydalıdır. İkinci olarak, fare modellerindeki cinsiyet farklılıkları, biyomedikal araştırmaların geçerliliğini, tekrarlanabilirliğini ve güvenilirliğini önemli ölçüde etkilemektedir. Tarihsel olarak araştırmacılar, dişi östrus döngülerinin neden olduğu veri değişkenliğinden kaçınmak için ağırlıklı olarak erkek fareleri tercih etmişlerdir; ancak bu varsayımın büyük ölçüde yanlış olduğu daha sonra gösterilmiştir25,26. Çalışma türüne bağlı olarak, bu protokol erkek veya dişi farelerin dahil olduğu çalışmalara uygulanabilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edilecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Bilim, Beşeri Bilimler, Teknoloji ve İnovasyon Sekretaryası'nın (SECIHTI) LN-2025-C-23 numaralı hibesi tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1 mL şırıngaBD Plastipak302485Cerrahi işlem
20 G iğneNIPROAH-2032Aort kanülü
8x-100x büyütmeli 25 mm ayarlanabilir lensGenericN/AOptik sistem kamera lensi; genel olarak ayarlanabilir kamera lensi olarak belirtilmiştir
27 G iğneBD PrecisionGlide302358Cerrahi işlem
3B tasarımlı destek parçalarıCINVESTAVN/AÖzel 3B tasarımlı destek parçaları
4-0 ipek sütürAMERICAN SUTURETGSN0901Aort kanülü
40-A güç kaynağıSTERENPRL-25LED güç kaynağı
Hava taşıN/AN/ATyrode çözeltisi oksijenasyonu
CaCl2 (2H2O)Sigma-AldrichC3306Tyrode çözeltisi
D-GlikozJ.T. Baker1916-01Tyrode çözeltisi
Drenaj pompasıCINVESTAVN/AÖzel drenaj pompası; genel olarak drenaj pompası olarak belirtilmiştir
F = 25,4 mm, plano-konveks lensTHORLABSLA1951-AOptik sistem aydınlatma lensi; genel olarak plano-konveks aydınlatma lensi olarak belirtilmiştir
Buzul asetik asitSigma-Aldrich695092Langendorff sistemi temizliği
HeparinPiSA060M91Antikoagülan
HEPESSigma-AldrichH3375Tyrode çözeltisi
Yüksek güçlü LED'lerLuminiusCBT-90-G-L11-C12LED ışık kaynağı
Aydınlatma sistemiCINVESTAVN/AÖzel aydınlatma sistemi; genel olarak aydınlatma sistemi olarak belirtilmiştir
KClCTR SCIENTIFICCTR02196Tyrode çözeltisi
LabVIEW yazılımı versiyon 2018NATIONAL INSTRUMENTSN/Aİzleme ve pacing uygulamasını çalıştırmak için kullanılan yazılım; genel olarak izleme ve pacing uygulaması olarak belirtilmiştir
MATLAB yazılımıThe MathWorksN/AVideo normalizasyon, segmentasyon ve analiz programları için hesaplama yazılımı; genel olarak hesaplama yazılımı olarak belirtilmiştir
Tıbbi sınıf oksijenGRUPO INFRAN/ATyrode çözeltisi oksijenasyonu
MgCl2 (6H2O)CTR SCIENTIFICCTR02104Tyrode çözeltisi
Değişken akışlı Mini-PompaCONTROL COMPANY3385Perfüzyon pompası
Fare Cerrahi SetiKent ScientificINSMOUSEKITCerrahi işlem
NaClSigma-AldrichS5886Tyrode çözeltisi
NaH2PO4DEQDEQF290400250Tyrode çözeltisi
NaOHCTR SCIENTIFICCTR03108pH ayarı
NI USB-6009NATIONAL INSTRUMENTS779026-01Veri toplama kartı
Platin elektrotlar, çap 0,25 mmSigma-Aldrich349402Elektriksel stimülasyon elektrotları
Güç kaynağı (12 V, 30 A)KarnickPTA-12V30AResirkülatör güç kaynağı
Basınç monitörüCINVESTAVN/AÖzel basınç monitörü; genel olarak basınç monitörü olarak belirtilmiştir
Basınç transdüseriLA BOUVETB17295Langendorff sistemi basınç monitörü
Saf etil alkolSigma-Aldrich493511Sistem temizliği için etanol
Resirkülasyonlu termal banyo (LXC)PolyScienceL113A0412Rezervuar resirkülatörü
Salin çözeltisiPiSA111848%0,9 sodyum klorür (NaCl) çözeltisi
Serpantin termal banyoCINVESTAVN/AÖzel serpantin resirkülatör/termal banyo
StereomikroskopN/AN/ACerrahi işlem
Stereomikroskop aydınlatmasıN/AN/ACerrahi işlem
uEye Cockpit yazılımıIDS Imaging Development System GmBHN/AKamera görüntüleme yazılımı; genel olarak kamera görüntüleme yazılımı olarak belirtilmiştir
UI-3360CP-NIR-GL Rev.2IDSAB00624Yüksek hızlı CMOS kamera; genel olarak CMOS kamera olarak belirtilmiştir
KsilazinPiSA4001211Anestezik
Zoletil 100Virbac83048907Tiletamin-zolepaze anestezik; genel olarak anestezik karışım olarak belirtilmiştir

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Guarina L et al. Biological noise is a key determinant of the reproducibility and adaptability of cardiac pacemaking and EC coupling. J Gen Physiol. 2022;154(9):e202012613.
  2. Peña-Romo A et al. Noise enhanced the electrical stimulation-contractile response coupling in isolated mouse heart. Int J Cardiol. 2016;221:155-60.
  3. Bychkov R et al. Synchronized cardiac impulses emerge from heterogeneous local calcium signals within and among cells of pacemaker tissue. JACC Clin Electrophysiol. 2020;6(8):907-31.
  4. Clancy CE, Santana LF. Evolving discovery of the origin of the heartbeat: a new perspective on sinus rhythm. JACC Clin Electrophysiol. 2020;6(8):932-4.
  5. Asamudo EU, Ng YH, Bers DM. Langendorff isolated heart perfusion model for functional studies in mice. In: Chandrasekera DNK, Katare R, editors. Cardiomyocytes: Methods and Protocols. Springer Nature; New York; 2025. p. 111-24.
  6. Louradour J et al. Simultaneous assessment of mechanical and electrical function in Langendorff-perfused ex vivo mouse hearts. Front Cardiovasc Med. 2023;10:1293032.
  7. Noly PE et al. Assessment of ex vivo murine biventricular function in a Langendorff model. J Vis Exp. 2022;(190):e64384.
  8. Beckett PR. The isolated perfused heart preparation: two suggested improvements. J Pharm Pharmacol. 1970;22(11):818-22.
  9. Ihara K et al. Electrophysiological assessment of murine atria with high-resolution optical mapping. J Vis Exp. 2018;(132):e56478.
  10. King DR, Hardin KM, Hoeker GS, Poelzing S. Reevaluating methods reporting practices to improve reproducibility: an analysis of methodological rigor for the Langendorff whole heart technique. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2022;323(3):H363-77.
  11. Lang D, Sulkin M, Lou Q, Efimov IR. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. J Vis Exp. 2011;(55):e3275.
  12. Liao R, Podesser BK, Lim CC. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2012;303(2):H156-67.
  13. Sung YL, Tsai YS, Chang CL, Hu YF. Protocol for high-resolution optical mapping of ex vivo rat heart for electrophysiological studies. STAR Protoc. 2025;6(2):103734.
  14. Lee P et al. Low-cost optical mapping systems for panoramic imaging of complex arrhythmias and drug-action in translational heart models. Sci Rep. 2017;7:43217.
  15. Laughner JI et al. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2012;303(7):H753-65.
  16. Hao X et al. TGF-β1-mediated fibrosis and ion channel remodeling are key mechanisms in producing the sinus node dysfunction associated with SCN5A deficiency and aging. Circ Arrhythm Electrophysiol. 2011;4(3):398-406.
  17. Pizzo E et al. Heart rate variability reveals altered autonomic regulation in response to myocardial infarction in experimental animals. Front Cardiovasc Med. 2022;9:843144.
  18. Tayel MB, AlSaba EI. Poincaré plot for heart rate variability. Int J Biomed Biol Eng. 2015;9(9).
  19. Bazan C, Barba DT, Blomgren P, Paolini P. Image processing techniques for assessing contractility in isolated adult cardiac myocytes. Int J Biomed Imaging. 2009;2009:352954.
  20. Christoph J, Luther S. Marker-free tracking for motion artifact compensation and deformation measurements in optical mapping videos of contracting hearts. Front Physiol. 2018;9:1483.
  21. Lebert J, Ravi N, Kensah G, Christoph J. Real-time optical mapping of contracting cardiac tissues with GPU-accelerated numerical motion tracking. Front Cardiovasc Med. 2022;9:787627.
  22. Larsen TS et al. The isolated working mouse heart: methodological considerations. Pflugers Arch. 1999;437:979-85.
  23. Vornanen M. Basic functional properties of the cardiac muscle of the common shrew (Sorex araneus) and some other small mammals. J Exp Biol. 1989;145:339-51.
  24. VanderBrink BA et al. Assessment of atrioventricular nodal physiology in the mouse. J Interv Card Electrophysiol. 1999;3(3):207-12.
  25. Shansky RM, Murphy AZ. Considering sex as a biological variable will require a global shift in science culture. Nat Neurosci. 2021;24(4):457-64.
  26. Shansky RM. Are hormones a “female problem” for animal research? Science. 2019;364(6443):825-6.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Langendorff Perf ze KalpFare Kalp ModeliOptik De erlendirmeAtriyal KontraktiliteVentrik ler KontraktiliteKalp H z l mY ksek z n rl kl G r nt lemeVentrik ler K salmaAtriyal DinamiklerKardiyak Mekanik
Video yakında

İlgili makaleler