Konstipasyon Baskın İrritabl Bowel Sendromunda Mikrobiyal Metabolitlerle İlişkili Konak Genlerinin Önceliklendirilmesi İçin Hesaplamalı Bir İş Akışı

Özet

Bu protokol; deneysel takip için sıralanmış, hipotez oluşturmaya yönelik aday metabolit ilişkili konak genlerin kısa bir listesini ve yapısal olarak önceliklendirilmiş protein-ligand komplekslerini üretmek amacıyla mikrobiyal metabolit hedef tahmini, rektal mukoza transkriptomiği, protein-protein etkileşimi ve yolca zenginleştirme, moleküler kenetleme, moleküler dinamik simülasyonu ve Moleküler mekanik/Poisson-Boltzmann yüzey alanı (MM-PBSA) bağlanma serbest enerjisi tahminini entegre etmektedir.

Özet

Kamuya açık kimyasal, genomik ve yapısal veri tabanlarından, mikrobiyal metabolitlerle ilişkili konakçı genlerini ve protein-ligand komplekslerini sistematik olarak önceliklendirmek için standartlaştırılmış bir hesaplamalı işlem hattı bulunmamaktadır. Bu makale, kullanıcı tarafından tanımlanmış bir bağırsak mikrobiyotasından türetilmiş metabolit setini kabul eden ve deneysel takip için aday metabolit ilişkili konakçı genlerinin sıralanmış bir kısa listesini, zenginleştirilmiş biyolojik yolakları ve yapısal olarak önceliklendirilmiş protein-ligand komplekslerini üreten sekiz aşamalı bir iş akışını açıklamaktadır. İşlem hattı şunları entegre eder: (i) kemoenformatik metabolit profilleme; (ii) protein-kimyasal etkileşim ve ligand tabanlı hedef tahmin aracı ile bir moleküler kenetlenme programı kullanılarak çoklu veri tabanı aday hedef tahmini; (iii) kamuya açık transkriptomik verilerin diferansiyel gen ekspresyon analizi; (iv) hedef-diferansiyel eksprese olmuş gen örtüşmesi; (v) protein-protein etkileşim ağı inşası ve yolak zenginleştirme; (vi) bir moleküler kenetlenme programı ile moleküler kenetlenme; (vii) moleküler dinamik simülasyonları için kullanılan bir protein kuvvet alanı ile bir moleküler dinamik motoru kullanılarak 200 ns moleküler dinamik simülasyonu ve (viii) MM-PBSA bağlanma serbest enerjisi tahmini. Uygulamalı bir örnek olarak, kısa zincirli yağ asitlerini, safra asitlerini, triptofan türevli metabolitleri ve urolithin A'yı temsil eden, bağırsak mikrobiyotasından türetilmiş veya mikrobiyota tarafından modifiye edilmiş dokuz metabolit, kamuya açık IBS-C rektal mukoza transkriptomik veri seti GSE36701 kullanılarak işlenmiştir. İş akışı, bu veri setinde diferansiyel olarak eksprese edilen 17 benzersiz tahmin edilen metabolit ilişkili geni sıralamıştır. Kenetlenme, moleküler dinamik simülasyonu ve MM-PBSA analizleri yapısal olarak beş metabolit-protein kompleksini önceliklendirmiştir: litokolik asit-VDR, litokolik asit-NR1H4/FXR, ursodeoksikolik asit-NR1H4/FXR, triptamin-HTR2A (açık bir 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glisero-3-fosfokolin (POPC) lipid çift katmanında simüle edilmiştir) ve urolithin A-CASP3. Protokol, diğer metabolit setlerine, hastalık transkriptomik veri setlerine ve hedef sınıflarına uyarlanabilir şekilde tasarlanmıştır; tüm çıktılar, nedensel veya terapötik sonuçlar çıkarılmadan önce bağımsız transkriptomik replikasyon, protein düzeyinde doğrulama ve fonksiyonel ligand-yanıt analizleri gerektiren, hipotez üreten hesaplamalı tahminlerdir.

Giriş

Konstipasyonla seyreden irritabl bağırsak sendromu (IBS-C), tekrarlayan abdominal ağrı, değişmiş bağırsak alışkanlıkları, şişkinlik ve konstipasyon ile karakterize, genel popülasyonun yaklaşık %10–15'ini etkilediği tahmin edilen yaygın bir fonksiyonel gastrointestinal bozukluktur^1,2. Sekretagoglar, prokinetikler ve antispazmodikler dahil olmak üzere mevcut farmakolojik tedaviler, hastaların bir kısmında bireysel semptomları iyileştirebilir; ancak, hastalığın karmaşık ve multifaktöriyel patobiyolojisini yansıtır şekilde, tedavi yanıtı heterojen kalmakta ve kalıcı remisyon nadiren sağlanmaktadır^1,3,4. Bu nedenle, yeni terapötik hedefler için test edilebilir hipotezler oluşturmak amacıyla, bağırsak mikrobiyal sinyallerinin mukozal düzeyde nasıl iletildiğine dair daha kapsamlı bir mekanistik anlayış gereklidir.

Bağırsak mikrobiyotası; kısa zincirli yağ asitleri (SCFA'lar), sekonder safra asitleri, triptofan türevli bileşikler ve urolithinler gibi polifenol türevli metabolitler dahil olmak üzere kimyasal olarak çeşitli metabolitlerin üretimi ve biyotransformasyonu aracılığıyla alt gastrointestinal homeostaza katkıda bulunur^5,6,7,8. Bu moleküller, kanonik metabolit algılayan membran reseptörlerinin çok ötesine geçerek nükleer reseptörleri, sitozolik enzimleri, histon modifiye eden proteinleri, peptit hormon öncüllerini ve hücre içi sinyal proteinlerini kapsayan geniş ve tam olarak karakterize edilmemiş bir moleküler hedef repertuvarı aracılığıyla konak hücrelerle iletişim kurar⁹. İrritabl bağırsak sendromu (İBS) olan hastalarda değişmiş bağırsak mikrobiyal topluluk kompozisyonu ve metabolit profilleri belgelenmiştir; bu durum, mikrobiyal metabolit yanıtlılığı ile ilişkili konak genlerin İBS-C rektal mukozasında transkripsiyonel olarak bozulup bozulmadığının araştırılması için biyolojik bir gerekçe sağlamaktadır¹⁰.

Dokuz metabolitten oluşan panel; kompakt, kimyasal olarak çeşitli ve biyolojik olarak yorumlanabilir, gut mikrobiyotası türevli veya mikrobiyota tarafından modifiye edilmiş küçük moleküllerden oluşan bir set sağlamak amacıyla önceden tanımlanmıştır. Seçim beş kritere dayandırılmıştır: konak-mikrobiyota sinyalizasyonunda yer alan temel mikrobiyal metabolit sınıflarının temsiliyeti; bilinen veya olası distal intestinal mukoza maruziyeti; kesin PubChem tanımlayıcılarının ve kanonik yapıların mevcut olması; ligand tabanlı hedef tahmini ve docking için moleküler boyut ve yapısal takip edilebilirlik; ve IBS-C'de epitel, nöroimmün, enteroendokrin, nükleer reseptör veya motilite ile ilgili sinyalizasyon için önceden belirlenmiş plausibilite. Seçilen panel; SCFA'lar olarak bütirat ve propiyonatı; safra asitleri olarak kenodeoksikolik asit, litokolik asit ve ursodeoksikolik asidi; triptofan türevli metabolitler olarak triptamin, indol-3-propiyonik asit ve indol-3-laktik asidi; ve gut mikrobiyotası türevli bir polifenol metabolit olarak urolithin A'yı içermektedir^5,6,7,8,9,10.

Önceki hesaplamalı ve deneysel araştırmaların çoğu, tekil metabolit-reseptör veya metabolit-enzim çiftlerini izole olarak incelemiştir; bu yaklaşım, mikrobiyal metabolit sinyalleşmesinin konakçı yolakları boyunca sergilediği dağıtılmış ve yakınsak doğayı kapsamamaktadır^9,11. Birden fazla analitik aşamanın entegrasyonu, tek bir aşamanın bağımsız olarak sağlayamayacağı, birbirini destekleyen bir filtreleme gücü sunar. Küratörlü veri tabanlarına karşı yapılan hesaplamalı hedef tahmini, her metabolit için geniş bir aday konakçı protein seti üretir. Hastalıkla ilişkili transkriptomik verilerle yapılan kesişim, bu seti önemli ölçüde filtreleyerek yalnızca transkriptleri hastalık bağlamında değişmiş olan adayları tutar. Yolak zenginleştirme ve protein-protein etkileşim ağı analizleri, ardından azaltılmış aday listesini bilinen biyolojik modüllere eşler. Moleküler kenetleme, her bir aday kompleks için bağlanma cebi tamamlayıcılığının ilk hesaplamalı değerlendirmesini sağlar ve MM-PBSA bağlanma serbest enerjisi ayrıştırması ile birlikte yapılan ek 200 ns moleküler dinamik (MD) simülasyonu, yalnızca kenetleme skorlarından elde edilemeyen, yapısal önceliklendirmeye zaman çözünürlüklü ve termodinamik bir boyut kazandırır. Her adımın sistematik entegrasyon ve ardışık filtreleme olmaksızın bağımsız olarak gerçekleştirilmesi, deneysel olarak yönetilemeyecek kadar geniş aday listeleriyle sonuçlanacak ve yakınsak yolak mimarisinin tespit edilmesini engelleyecektir.

Bu protokolün genel çerçevesinde, “metabolite-associated gene” (MAG - metabolit ilişkili gen) terimi ile; protein ürünü, en az bir küratörlü hesaplamalı tahmin veri tabanı tarafından bir veya daha fazla bağırsak mikrobiyota türevli metabolitin muhtemel moleküler hedefi olarak belirlenmiş olan ve transkripti, iş akışını kanıtlamak için kullanılan hastalığa özgü transkriptomik veri setinde farklı şekilde eksprese edilen bir insan geni kastedilmektedir. Bu operasyonel tanım; membran reseptörlerini, nükleer reseptörleri, sitozolik enzimleri, sinyal proteinlerini, peptit hormon öncüllerini ve diğer hücre içi proteinleri kasıtlı olarak kapsamaktadır. MAG belirlemesi, bir metabolitin bağlandığına, bir protein-ligand kompleksi oluşturduğuna, bir reseptörü aktive ettiğine, protein bolluğunu değiştirdiğine veya hastalığa neden olduğuna dair deneysel bir kanıt değil; deneysel doğrulama gerektiren, hesaplamalı olarak türetilmiş, hipotez üretici bir aday gösterimidir.

Bu protokol, bağımsız tekrarlanabilirliği, diğer metabolit panellerine veya hastalık veri setlerine uyarlanabilirliği ve diğer konakçı-mikrobiyota etkileşim bağlamlarına genişletilebilirliği sağlayacak yeterli operasyonel ayrıntıyla birlikte, sekiz aşamalı tam hesaplamalı iş akışını (Şekil 1) tanımlamaktadır. İş akışı, münhasiran olarak halka açık omik ve yapısal kaynaklar üzerinde çalışan bir hipotez oluşturma ve yapısal önceliklendirme çerçevesi olarak açıkça kapsamlandırılmıştır; yalnızca hesaplamalı çıktılardan yola çıkarak değişmiş metabolit konsantrasyonlarını, reseptör aktivasyon durumlarını, protein ekspresyon değişikliklerini, aşağı akış sinyalizasyon aktivitelerini veya klinik anlamlılığı çıkarım yapmaz. Burada, MAG'ları belirlemek ve sonraki deneysel takipler için metabolit-protein komplekslerini önceliklendirmek amacıyla, dokuz gut mikrobiyota kaynaklı veya mikrobiyota tarafından modifiye edilmiş metabolit ve halka açık IBS-C rektal mukozal transkriptomik veri seti GSE36701 kullanılarak protokol, uygulanmış bir örnek olarak gösterilmektedir.

Protokol

Analizde yalnızca GSE36701'den alınan, halka açık ve kimlikten arındırılmış transkriptomik veriler ile halka açık kimyasal, protein ve yapısal veri tabanları kullanılmıştır. Veri tabanlarına Ocak ve Mayıs 2026 tarihleri arasında erişilmiştir. Daha sonraki erişim tarihleri ayrı Materyal Tablosunda belgelenmiştir.

1. Çalışma tasarımı, donanım ve yazılım gereksinimleri

1. Analize başlamadan önce iş akışını tanımlayın. Sekiz aşama kullanın: metabolit seçimi, hedef tahmini, diferansiyel ekspresyon analizi, hedef ve diferansiyel eksprese olmuş gen (DEG) örtüşmesi, protein-protein etkileşimi (PPI)/yolak zenginleştirme, moleküler docking, MD simülasyonu ve MM-PBSA tahmini.
2. Docking, MD ve MM-PBSA'nın yalnızca yapısal önceliklendirme araçları olduğunu kaydedin. Bu çıktıları bağlanmanın, reseptör aktivasyonunun, protein bolluğu değişiminin, terapötik etkinliğin veya hastalık nedenselliğinin deneysel kanıtları olarak yorumlamayın.
3. MD simülasyonlarını çalıştırmadan önce hesaplama donanımını onaylayın. 64 bit bir Linux işletim sistemi, 6 çekirdekli bir CPU veya daha iyisi, ≥8 GB VRAM'e sahip bir GPU hızlandırma platformu veya en az 8 GB VRAM'e sahip eşdeğer bir GPU hızlandırma platformu, minimum 32 GB RAM ve MD sistemi başına en az 200 GB boş depolama alanı kullanın.
4. Temel yazılımları kaydedin: bir moleküler dinamik motoru, metabolit ligandların hedef proteinlere moleküler docking yazılımı, kimyasal dosya formatı dönüştürücü¹², üç boyutlu ligand oluşturucu, ligand hazırlama aracı, bir docking giriş hazırlama kiti, metabolit ligandların hedef proteinlere moleküler docking yazılımı, genel amaçlı bir programlama ortamı, biyoinformatik yazılım çerçevesine sahip bir istatistiksel hesaplama ortamı ve bir diferansiyel gen ekspresyon analizi paketi.
5. Yapısal analiz araçlarını kaydedin: web tabanlı membran sistem inşa aracı, CHARMM uyumlu ligand parametreleştirme servisi, moleküler mekanik/sürekli çözücü bağlanma enerjisi hesaplama aracı, moleküler topoloji ve parametre dönüştürme kütüphanesi, üç boyutlu moleküler görselleştirme programı ile moleküler görselleştirme ve iki boyutlu etkileşim diyagramı aracı 2021 (indirme bağlantıları ve versiyon bilgileri için Materyal Tablosuna bakın).
6. Moleküler dinamik simülasyonları için kullanılan kesin protein kuvvet alanını, CGenFF, CHARMM-GUI, R/biyoinformatik yazılım çerçevesini ve moleküler mekanik/sürekli çözücü bağlanma enerjisi hesaplama aracı sürüm tanımlayıcılarını Materyal Tablosuna/ortam dosyasına kaydedin. Eksik tanımlayıcıları "geri getirilemez" olarak işaretleyin; bunları tahmin etmeyin.

2. Metabolit seçimi ve kemoinformatik karakterizasyon

1. Hedef tahmininden önce metabolit panelini tanımlayın. Bütirat (PubChem CID: 264), propionat (CID: 1032), kenodeoksikolik asit (CID: 10133), litokolik asit (CID: 9903), ursodeoksikolik asit (CID: 31401), triptamin (CID: 1150), indol-3-propionik asit (CID: 3744), indol-3-laktik asit (CID: 92904) ve urolitin A'yı (CID: 5488186) dahil edin.
2. Her bir metabolit için kanonik Basitleştirilmiş Moleküler Giriş Satır Sistemi (SMILES) ve PubChem CID bilgilerini alın. Hedef tahmininden önce eş anlamlıları ve mükerrer yapıları doğrulayın. Nihai tanımlayıcıları metabolit ana sayfasına kaydedin.
3. Kanonik SMILES dizilerini, fizikokimyasal özellik ve ADME tahmini web aracına¹³ gönderin (bkz. Malzemeler Tablosu). Moleküler ağırlığı, Topolojik polar yüzey alanını (TPSA), konsensüs logP'yi, hidrojen bağı donörlerini, hidrojen bağı akseptörlerini, dönebilir bağları, öngörülen gastrointestinal absorbsiyonu, P-glikoprotein tahminini ve Lipinski, Veber, Ghose, Egan, Muegge ve PAINS uyarılarını kaydedin.
4. Yapı tanıma işlemi başarılı olan, moleküler ağırlığı ≤500 Da olan ve PAINS uyarısı bulunmayan metabolitleri saklayın. Karşılanmayan her kriteri ve metabolitin saklanması veya hariç tutulması kararını kaydedin.
5. Aşağı akış hedef tahmini ve kenetlenmeden (docking) önce iyonizasyon durumlarını atayın. Bütirat ve propionat için deprotonasyona uğramış karboksilatları, safra asitleri için nötr karboksilik asit formlarını, triptamin için protonlanmış amonyumu ve kalan metabolitler için nötr formları kullanın.

3. Aday insan hedef tahmini

1. Bir kimyasal-protein etkileşimi hedef tahmini ¹⁴ (bkz. Materyaller Tablosu) açın. Her bir metabolit adını veya PubChem CID'sini girin, Homo sapiens'i (taksonomi ID: 9606) seçin ve minimum kombine etkileşim skorunu ≥0,700 olarak ayarlayın.
2. Kimyasal-protein etkileşimi hedef tahmininde deneysel ve küratörlü veri tabanı kanıt kanallarına öncelik verin. Her metabolit için protein-ilişkilendirme tablosunun tamamını indirin.
3. Bir moleküler kenetlenme programı¹⁵ (bkz. Materyaller Tablosu) açın. Homo sapiens seçiliyken her bir kanonik SMILES dizisini gönderin ve olasılığı ≥0,70 olan hedefleri tutun.
4. Kimyasal-protein etkileşimi hedef tahmini ve moleküler kenetlenme programı çıktılarını, her metabolit için bir birleşim kümesi olarak birleştirin. Herhangi bir veri tabanı eşiğini karşılayan tüm hedefleri tutun ve birebir aynı olan gen sembolü girişlerini kaldırın.
5. Protein girişlerini, protein tanımlayıcılarını standartlaştırılmış HGNC onaylı gen sembollerine eşleyerek veya entegre insan gen bilgi veri tabanını kullanarak (bkz. Materyaller Tablosu) HUGO Gen Nomenklatürü Komitesi (HGNC) onaylı gen sembollerine göre standartlaştırın. Takma adları, güncelliğini yitirmiş sembolleri ve izoform açıklamalarını protein başına tek bir gen sembolü olacak şekilde çözün.
6. Her bir hedefi membran reseptörü, nükleer reseptör, enzim, hücre içi sinyal protein, peptit hormon, hormonla ilişkili protein veya diğer hücre içi protein olarak sınıflandırın. Sınıfı hedef tablosuna kaydedin.

4. Transkriptomik veri seti ve diferansiyel gen ekspresyon analizi

1. NCBI tabanlı diferansiyel gen ekspresyon analiz aracını kullanarak^16,17 GSE36701'e erişin (bkz. Materyaller Tablosu). Veri setinin; IBS-C, diyare baskın irritabl bağırsak sendromu (IBS-D), post-enfeksiyöz IBS ve sağlıklı gönüllü gruplarına ait rektal mukozal biyopsi ekspresyon verilerini içerdiğini kaydedin¹⁸.
2. Bağımsız bir doğrulama kohortu için GEO ve ArrayExpress'te arama yapın. IBS-C, konstipasyon baskın irritabl bağırsak sendromu, rektal mukoza, kolonik mukoza, biyopsi, transkriptom, mikroarray ve RNA-seq terim kombinasyonlarını kullanın. Depoları, arama terimlerini, arama tarihini ve karşılaştırılabilir bir doğrulama veri setinin tanımlanıp tanımlanmadığını kaydedin.
3. GSE36701 kaydındaki web tabanlı diferansiyel gen ekspresyon analiz aracını başlatın (bkz. Materyaller Tablosu). 18 IBS-C örneğini IBS-C grubuna, 40 sağlıklı gönüllüyü kontrol grubuna atayın; IBS-D ve post-enfeksiyöz IBS örneklerini ise atanmamış olarak bırakın.
4. Benjamini-Hochberg yanlış keşif oranı (FDR) düzeltmesi içeren¹⁹ diferansiyel gen ekspresyon analiz paketi çerçevesini kullanarak diferansiyel ekspresyon analizini gerçekleştirin. Prob ID'si, gen sembolü, gen başlığı, logFC, AveExpr, modere edilmiş t-statistiği, ham P-değeri ve düzeltilmiş P-değerini içeren sonuç tablosunun tamamını indirin.
5. Probları gen düzeyindeki girdilere indirgeyin. Gen sembolü eksik olan probları çıkarın; yinelenen semboller için en düşük FDR'ye sahip probu tutun ve eşitlik durumunda mutlak değeri daha büyük olan logFC'yi belirleyici olarak kullanın.

5. Hedef-DEG örtüşme analizi ve istatistiksel değerlendirme

1. Her bir metabolite özgü tahmin edilen hedef listesini, FDR < 0,05 olan gen düzeyindeki DEG listesi ile kesiştirin. Kesişen genleri, kaynak metaboliti, logFC değerini, düzeltilmiş P değerini ve ekspresyon yönünü kaydedin.
2. Metabolite özgü kesişim listelerini, tekrarsız bir MAG listesinde birleştirin. Toplam tahmin edilen hedefleri, metabolite özgü kesişimleri ve toplam benzersiz MAG sayılarını belirleyin.
3. Birden fazla proba sahip genler için prob düzeyinde yönsel tutarlılığı değerlendirin. Probların ekspresyon yönü konusunda uyuşmadığı herhangi bir geni işaretleyin.
4. Toplam gen-çöktürülmüş girdileri, toplam DEG'leri, toplam benzersiz tahmin edilen hedefleri ve gözlemlenen MAG'ları kullanarak Fisher'ın kesin testi için kontingans tablosunu oluşturun. Fisher'ın kesin testi uygulaması ile tek kuyruklu P değerini, odds oranını ve %95 güven aralığını hesaplayın.
5. Arka plan DEG oranı %50'yi aşarsa, kesişimi bağımsız olarak doğrulanmış bir zenginleştirme yerine tanımlayıcı olarak raporlayın. Ayrı bir yönsel test yapılmadıkça, tekdüze aşağı düzenlemeyi (downregulation) tanımlayıcı bir yönsel kalıp olarak değerlendirin.

6. Protein-Protein Etkileşim Ağı Analizi ve Yolak Zenginleştirme

1. Tam ve benzersiz MAG listesini protein-protein etkileşim ağı oluşturma ve yolculuk zenginleştirme analizine²⁰ gönderin (bkz. Materyal Tablosu). Homo sapiens'i seçin ve minimum etkileşim skorunu 0.700 olarak ayarlayın.
2. Birleştirilmiş protein-protein etkileşim ağı oluşturma ve yolculuk zenginleştirme ağını ve tam etkileşim tablosunu dışa aktarın. Metin madenciliği yapay olarak yoğun bir topoloji oluşturursa, metin madenciliğinin seçimini kaldırın ve deneysel, ko-ekspresyon ve veri tabanı kanallarını tutun.
3. SCFA ile ilişkili, safra asidi ile ilişkili ve triptamin/serotonerjik MAG'ler için metabolit sınıfı alt ağları oluşturun. Aynı protein-protein etkileşim ağı oluşturma ve yolculuk zenginleştirme organizma ve güvenilirlik ayarlarını kullanın.
4. Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG)²¹, Reactome²² ve Gen Ontolojisi (GO) Biyolojik Süreç^23,24 üzerinden protein-protein etkileşim ağı oluşturma ve yolculuk zenginleştirme analizini çalıştırın. Benjamini-Hochberg BH FDR <0.05 değerini uygulayın ve tüm zenginleştirme tablolarını dışa aktarın.

7. Moleküler kenetlenme

1. Deneysel olarak belirlenmiş reseptör yapılarını Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Bank RCSB PDB'den²⁵ alın (bkz. Malzeme Tablosu). Önceliklendirilen beş protein-ligand kompleksi için VDR/1DB1, NR1H4/FXR/3DCT, CASP3/2DKO ve HTR2A/6A93 yapılarını kullanın.
2. Her bir reseptörü, A zincirini tutup suyu, ko-kristalize ligandları, kofaktörleri, iyonları ve protein dışı HETATM kayıtlarını kaldırarak hazırlayın. 6A93 için reseptör hazırlığından önce T4 lizozim füzyon segmentini kaldırın.
3. Moleküler yapı araç takımıyla polar hidrojenleri ekleyin, Gasteiger yüklerini atayın ve her reseptörü PDBQT olarak kaydedin. PDBQT dönüştürmesinden önce bağlanma bölgesindeki histidin protonasyon durumlarını inceleyin ve seçilen durumları belgeleyin.
4. Kimyasal yapı dosya dönüştürme araç takımında her bir ligandın 3D yapısını oluşturun. Universal Force Field (UFF) ile 500 adım boyunca enerji minimizasyonu yapın, pH 7.4 iyonizasyon durumunu atayın, Gasteiger yüklerini atayın ve PDBQT olarak kaydedin.
5. Ko-kristalize ligand centroidü merkezli 25 Å x 25 Å x 25 Å boyutlarında bir docking kutusu tanımlayın. Merkez koordinatları olarak VDR için (10, 19, 33), FXR için (137, 31, 78), CASP3 için (37, 34, 32) ve HTR2A için (12, −1, 61) değerlerini kullanın.
6. Metabolit ligandların hedef proteinlere^26,27 moleküler docking işlemini exhaustiveness = 8, seed = 42, num_modes = 9 ve energy_range = 3 kcal/mol parametreleriyle gerçekleştirin. Tüm pozlar için en yüksek sıralamalı Vina skorunu ve Kök ortalama kare sapma (RMSD) değerlerini kaydedin.
7. Her öncelikli kompleks için mod 1'i seçin. Bir moleküler görselleştirme ve iki boyutlu etkileşim diyagramı aracıyla iki boyutlu ligand-kalıntı diyagramlarını; üç boyutlu bir moleküler görselleştirme programıyla üç boyutlu reseptör-ligand görünümlerini oluşturun.
8. VDR/1DB1 ve FXR/3DCT için redocking kontrollerini gerçekleştirin. Ağır atom RMSD değeri kristalografik poza göre <2.0 Å olduğunda reseptör docking kurulumunu kabul edin.
9. Litokolik asidi (LCA) CASP3'e ve triptamini VDR'ye dock ederek cross-docking kontrollerini gerçekleştirin. Kognat ve non-kognat skorları karşılaştırın ve skor farkının <1.0 kcal/mol olduğu durumları kaydedin.

8. Moleküler dinamik simülasyonu

1. CHARMM uyumlu ligand parametrelendirme servisiyle²⁸ (Materyaller Tablosuna bakınız) ligand parametrelerini oluşturun. Tüm ceza skorlarını inceleyin ve cezası 50'den büyük olan > her parametreyi işaretleyin.
2. Ligand stream dosyalarını, kuvvet alanı topoloji dönüştürme betiği ile moleküler dinamik motoruyla uyumlu .itp ve .prm dosyalarına dönüştürün. Her kompleks için ligand ve protein topoloji dosyalarını birleştirin.
3. Moleküler topoloji ve parametre dönüştürme kütüphanesi ile hidrojen kütle yeniden dağılımını (hydrogen mass repartitioning) uygulayın. Moleküler dinamik simülasyonları için kullanılan protein kuvvet alanı²⁹ ve açık üç bölgeli su modeli³⁰ ile sulu topolojiler oluşturun.
4. Sulu kompleksleri, çözücü kenar boşluğu en az 1,2 nm olan dodekahedral bir kutu içinde çözünürleştirin. Sistemleri nötrleyin ve 0,15 M olacak şekilde NaCl ekleyin.
5. Web tabanlı bir membran sistemi oluşturma aracıyla^31,32,33 (Materyaller Tablosuna bakınız) tryptamine-HTR2A membran sistemini kurun. Membran-protein oryantasyon veri tabanıyla hizalanmış reseptör koordinatlarını³⁴ (Materyaller Tablosuna bakınız), saf bir POPC çift katmanını, 22,5 Å su katmanlarını ve 0,15 M NaCl kullanın.
6. Tüm sistemlerin enerjisini en dik iniş (steepest descent) yöntemiyle 50.000 adıma kadar minimize edin. Dengeleme öncesinde Fmax <1000 kJmol^-1nm^-1 değerinde yakınsamayı doğrulayın.
7. Sulu sistemleri Sabit parçacık sayısı, hacim ve sıcaklık topluluğu (NVT) ve Sabit parçacık sayısı, basınç ve sıcaklık topluluğu (NPT) evreleri ile dengeleyin. Membran sistemini, kısıtlamaların kademeli olarak kaldırıldığı altı adımlı, web tabanlı, çok aşamalı moleküler sistem hazırlama ve dengeleme iş akışını kullanarak dengeleyin.
8. Beş kompleksin tamamı için 200 ns üretim MD simülasyonu gerçekleştirin. Hidrojen kütle yeniden dağılımı (HMR) ile 4 fs zaman adımı, 310 K'de V-rescale termostat, 1 bar'da Parrinello-Rahman barostat, Particle mesh Ewald (PME) elektrostatikleri³⁵ ve LINCS kısıtlamaları³⁶ kullanın.
9. Final trajektorilerini moleküler dinamik trajektori analiz araçlarıyla analiz edin. Son 150 ns'yi birincil analiz penceresi olarak kullanarak ana zincir RMSD, Cα Kök ortalama kare dalgalanma (RMSF), jirasyon yarıçapı, Çözücüye erişilebilir yüzey alanı (SASA) ve protein-ligand hidrojen bağlarını hesaplayın.

9. MM-PBSA bağlanma serbest enerjisi kestirimi

1. MM-PBSA analizi için yörünge anlık görüntülerini çıkarın. Her bir sulu kompleks için 2.001 kare ve membrana gömülü HTR2A alt sistemi için işlenmiş 201 kare kullanın.
2. Poisson-Boltzmann solvasyonu, iç dielektrik sabiti = 1, dış dielektrik sabiti = 80, SASA tabanlı apolar solvasyon ve entropi düzeltmesi olmaksızın moleküler mekanik/sürekli-çözücü bağlanma enerjisi hesaplama aracını³⁷ çalıştırın. Ortalama bağlanma serbest enerjisini ve standart sapmayı raporlayın.
3. Beş kompleksin tamamı için kalıntı başına ayrıştırma gerçekleştirin. Mutlak katkıları ≥0,5 kcalmol⁻¹ olan stabilize edici ve destabilize edici kalıntıları raporlayın.

    

Sonuçlar

Aday metabolit ilişkili hedefler

Dokuz metabolit, bir kimyasal-protein etkileşim hedefi tahmin programı ve bir moleküler kenetlenme programı genelinde heterojen öngörülen hedef setleri üretmiştir. Propionat, triptamin, safra asitleri ve urolithin A, gastrointestinal sinyallezme ile bilinen ilişkisi olan çeşitli hedefler ortaya çıkarmıştır. Öngörülen hedef görünümü; kanonik membran reseptörlerini, nükleer reseptörleri, hücre içi enzimleri, sinyal proteinlerini ve peptid hormonla ilişkili proteinleri içermekteydi. Bu nedenle, alt akış sonuçları yalnızca reseptör bulguları yerine metabolitle ilişkili genler (MAG'lar) olarak tanımlanmıştır (Tablo 1).

Rapor edilen metabolit-protein etkileşimlerine karşı kıyaslama

Hedef tahmin çıktısının mevcut deneysel bilgilerle karşılaştırılması için, tahmin edilen metabolit ilişkili hedef ilişkileri üç kanıt düzeyine ayrılmıştır: (i) metabolitin veya yakından ilişkili bir endojen metabolitin, kodlanan proteini bağladığı, aktive ettiği, inhibe ettiği veya fonksiyonel olarak düzenlediğinin rapor edildiği, deneysel olarak desteklenen doğrudan veya yakın sınıf düzeyindeki metabolit-protein etkileşimleri; (ii) tahmin edilen hedefin yerleşik bir metabolite duyarlı yolaka veya reseptör ailesine ait olduğu, ancak kesin metabolit-protein çifti için doğrudan kanıtların sınırlı olduğu yolak veya hedef sınıfı destekli etkileşimler ve (iii) incelenen literatürde herhangi bir doğrudan deneysel etkileşimin tanımlanmadığı, yalnızca hesaplamalı ilişkilendirmeler. Bu kıyaslama, tahmin edilen MAG'ları doğrulamak için değil, bağlamsallaştırmak için kullanılmıştır.

Bazı tahminler daha önce bildirilmiş biyolojik bulguları tekrarlamıştır. FFAR2/GPR43 kanonik bir kısa zincirli yağ asidi reseptörü olduğu için Propionat-FFAR2 etkileşimi deneysel olarak desteklenmiş olarak kabul edilmiştir. Bütirat tanınmış bir histon deasetilaz inhibitörü olduğu ve öngörülen örtüşme bir HDAC ailesi üyesini içerdiği için Bütirat-HDAC3 deneysel veya sınıf destekli olarak sınıflandırılmıştır. NR1H4/FXR ve VDR'yi içeren safra asidi ile ilişkili tahminler, özellikle LCA gibi hidrofobik safra asitleri için yerleşik safra asidi nükleer reseptör biyolojisi tarafından desteklenmiş kabul edilmiştir; Ursodeoksikolik asit (UDCA) ile ilişkili FXR tahminleri, UDCA'nın genellikle daha zayıf veya bağlama bağımlı bir FXR ligandı olması nedeniyle ihtiyatla yorumlanmıştır. Triptamin ile ilişkili HTR1B, HTR2A, HTR2B ve HTR6 tahminleri, triptaminin mikrobiyal triptofan türevli bir monoamin olması ve serotonin reseptörlerinin gastrointestinal motilite ve sekresyonun yerleşik düzenleyicileri olması nedeniyle, doğrulanmış doğrudan reseptöre özgü etkileşimlerden ziyade serotonerjik yolak destekli olarak sınıflandırılmıştır. Urolithin A-CASP3 etkileşimi, urolithin A ile apoptotik/kaspazla ilişkili yanıtlar arasında yayınlanmış bağlantılar nedeniyle yolak destekli olarak değerlendirilmiş, ancak CASP3 bağlanmasına dair doğrudan kanıtlarla desteklenmemiştir. İndol-3-laktik asit-KYAT1 ve indol-3-propiyonik asit-KYAT1 etkileşimleri, geniş literatür mikrobiyal indol türevleri tarafından konakçı sinyallendirmesini desteklese de bu spesifik metabolitlerin doğrudan KYAT1 bağlanmasını desteklemediği için yalnızca hesaplamalı hipotezler olarak tutulmuştur^7,8,38,39,40.

Buna göre, Tablo 1, hesaplamalı hedef aday belirlemeyi, önceden mevcut olan deneysel veya yolak desteği düzeyinden ayırmaktadır. Ayrıca her bir hedef için tahmin kaynağını (bir kimyasal-protein etkileşimi hedef tahmini, bir moleküler kenetlenme programı veya her ikisi), kimyasal-protein etkileşimi hedef tahmini için birleştirilmiş etkileşim skorunu ve hedef bir moleküler kenetlenme programı tarafından belirlendiyse moleküler kenetlenme programı olasılığını sunmaktadır. Doğrudan ön deneysel kanıtı olmayan tahmin edilen hedefler, bağımsız protein düzeyi ve ligand yanıt doğrulaması gerektiren aday metabolit ilişkili genler olarak tanımlanmıştır.

Öngörülen hedefler ile IBS-C diferansiyel ekspresyon gösteren genleri arasındaki örtüşme

Birlik-birleştirilmiş tahmin edilen hedef listelerinin kesişimi ve gen düzeyindeki diferansiyel ekspresyon sonuçları, IBS-C ile sağlıklı gönüllü karşılaştırmasında anlamlı derecede diferansiyel eksprese edilen 17 benzersiz tahmin edilen metabolit ilişkili geni tanımlamıştır. 17 genin tamamı downregüle olmuştur. Bu set; membran ve nükleer reseptörleri (CASR, FFAR2, GPR68, HTR1B, HTR2A, HTR2B, HTR6, NR1H4, TBXA2R, VDR) ve reseptör olmayan proteinleri (CASP3, GCG, GNAQ, GPHN, HDAC3, KYAT1, MLN) içermekteydi (Tablo 1, Şekil 2A,B).

17 MAG'nin tamamı 0,05'in altındaki bir yanlış keşif oranı (FDR) eşiğini karşılamıştır; bunlardan 16'sı daha katı olan FDR < 0,001 kriterini karşılamış, kalan gen (HTR1B) ise FDR < 0,05 düzeyinde anlamlı bulunmuştur. 17 hedefin yedisi (CASP3, GCG, GNAQ, GPHN, GPR68, HDAC3, TBXA2R), hem FDR < 0,001 kriterini hem de 1,0'ı aşan mutlak bir log₂ kat değişimi (logFC aralığı −1,34 ile −1,10 arası) sağlamıştır; bu durum, bu alt küme için güçlü ve tutarlı bir downregülasyona işaret etmektedir. Kalan hedefler, orta düzeyde ancak istatistiksel olarak anlamlı downregülasyon (|logFC| aralığı 0,45 ile 0,97 arası) göstermiştir. Bu tekdüze tanımlayıcı patern, veri setinin genom çapındaki ekspresyon özellikleri göz önünde bulundurularak ihtiyatla yorumlanmıştır (aşağıdaki istatistiksel değerlendirmeye bakınız).

Hedef DEG örtüşmesinin istatistiksel değerlendirmesi

17 genlik örtüşmenin istatistiksel anlamlılığını resmi olarak değerlendirmek için, 17 öngörülen hedef gen sorgu seti ve GSE36701'de tespit edilen toplam 18.296 benzersiz gen-çökertilmiş kayıt genomik arka plan olarak kullanılarak tek kuyruklu Fisher'ın kesin testi uygulanmıştır. Bu arka planın 17.296 geni (%94,5), FDR < 0,05 düzeyinde diferansiyel olarak eksprese edilmiş olup, bu durum IBS-C rektal mukoza karşılaştırmasındaki neredeyse evrensel transkripsiyonel baskılanmayı yansıtmaktadır. Öngörülen 17 hedef genin tamamı diferansiyel eksprese edilen genler arasındaydı (gözlemlenen örtüşme 17/17, %100). %94,5'lik arka plan diferansiyel ekspresyon oranı göz önüne alındığında, rastgele seçilen herhangi bir 17 gen seti için beklenen örtüşme 16,1 gendir. Fisher'ın kesin testi, α = 0,05 düzeyinde istatistiksel olarak anlamlı olmayan 2,03'lük süreklilik düzeltmeli bir odds oranı (%95 güven aralığı 0,12–33,73) ile p = 0,384 sonucunu vermiştir (Şekil 3A–C).

Bu sonuç, gözlemlenen 17/17 örtüşmesinin, bu veri setinin genom genelindeki ekspresyon profili altında şans eseri beklenen örtüşmeyi aşmadığını göstermektedir. Buna göre, bu bulgular, genomik bir arka plan üzerinde istatistiksel zenginleştirme veya bağımsız doğrulama kanıtı olarak değil; tahmin edilen 17 hedefin tamamının IBS-C rektal mukoza dokusunda tutarlı ve anlamlı şekilde downregüle olduğu tanımlayıcı bir yönlü patern olarak yorumlanmaktadır. Resmi zenginleştirme testleri, tüm genlerin yarısından çok daha azının anlamlılık düzeyine ulaştığı, daha seçici diferansiyel ekspresyon profillerine sahip transkriptomik veri setlerinde tekrarlanmayı gerektirecektir. Örtüşen 17 genin tamamının tekdüze şekilde downregüle olması, ayrı olarak doğrulanmış istatistiksel bir sonuçtan ziyade tanımlayıcı bir gözlem olarak vurgulanmalıdır; çünkü bu veri setinin diferansiyel ekspresyon arka planının kendisi ağırlıklı olarak downregüle olduğundan, örtüşen genler arasında paylaşılan aşağı yönlü bir seyir bekleniyordu ve resmi bir yönlülük testine tabi tutulmadı. Bu nedenle, bu tekdüze yön, koordineli ve metabolit-spesifik regülasyonun bağımsız istatistiksel kanıtı olarak yorumlanmamalıdır.

Metabolite özgü kalıplar

Propiyonat; CASR, FFAR2, GCG, GNAQ, GPHN, GPR68, MLN ve TBXA2R dahil olmak üzere en fazla sayıda örtüşen gene sahipti; bu durum, kısa zincirli yağ asidi-yanıtlı ve Gq-ilişkili sinyal yolaklarının olası katılımına işaret etmektedir. Bütirat, bütiratla ilişkili histon deasetilaz biyolojisiyle uyumlu olarak HDAC3 ile örtüşmekteydi, ancak yalnızca mRNA aşağı regülasyonu, değişmiş bir bütirat yanıtlılığının olduğunu kanıtlamaz. Safra asidi ile ilişkili örtüşmeler, her ikisi de bağırsakta safra asidi sinyalizasyonunun tanınmış efektörleri olan nükleer reseptörler VDR ve NR1H4'ü içeriyordu^38,39. Triptamin; HTR1B, HTR2A, HTR2B ve HTR6 ile örtüşerek, gastrointestinal motilite ve sekresyonda rolleri iyi tanımlanmış bir sistem olan serotonerjik sinyalizasyonu aday bir modül olarak işaret etti⁴⁰. İndol-3-laktik asit ve indol-3-propiyonik asit KYAT1 ile, urolithin A ise CASP3 ile örtüştü.

Yolak zenginleştirme

Saptanan 17 ortak genin fonksiyonel zenginleştirme analizi; G proteini kenetli reseptör (GPCR) aşağı akış sinyalleşmesi, Gαq sinyalleşmesi, GPCR ligand bağlanması, serotonerjik sinaps, nöroaktif ligand-reseptör etkileşimi, kalsiyum sinyal iletimi, cAMP sinyalleşmesi ve peptid hormon salgılanması ile ilişkili yolakları tanımlamıştır. Bu sonuçlar, gen setinin kompozisyonu ile tutarlıdır ve biyolojik uyumunu desteklemektedir; ancak bunlar yolak düzeyindeki aktivitenin bağımsız kanıtlarından ziyade, sunulan genlerin fonksiyonel anotasyonlarını yansıtmaktadır.

Protein-protein etkileşim ağı yapısı

Protein-protein etkileşim ağı oluşturma ve yol zenginleştirme analizi, üç tamamlayıcı ağ üzerinden yorumlanmıştır. 17 genli birleşik meta-ağda (Ağ 1), anotasyonla desteklenen en belirgin yapı, GNAQ'u TBXA2R, CASR, HTR2A ve HTR2B dahil olmak üzere reseptörle ilişkili genlere bağlayan GNAQ merkezli bir GPCR/Gαq sinyalizasyon bileşeniydi. Sınırlı serotonin reseptörü bağlantısallığı, en belirgin şekilde HTR2A ve HTR2B arasında korunurken, diğer birçok gen seçilen güven eşiğinde izole kalmış veya zayıf bir şekilde bağlanmıştır. Propiyonat-spesifik ağ (Ağ 2), GNAQ'un CASR ve TBXA2R ile anotasyon destekli bağlantılarını koruduğu, buna karşılık FFAR2, GPR68, GCG, GPHN ve MLN'nin izole veya zayıf bağlantılı olduğu daha kısıtlı bir topoloji göstermiştir. Triptamin/serotonin ağı (Ağ 3); HTR1B, HTR2A, HTR2B ve HTR6'yı içermekteydi; bu alt küme içerisinde HTR2A ve HTR2B temel anotasyon destekli bağlantıyı gösterirken, HTR1B ve HTR6 seçilen eşikte doğrudan bağlanmamıştır (Şekil 4A–C).

Moleküler kenetleme

Seçilen beş metabolit-protein kompleksi üzerinde moleküler kenetlenme gerçekleştirilmiştir. Safra asidi-nükleer reseptör çiftleri, urolithin A-CASP3 ve tryptamine-HTR2A'ya kıyasla daha uygun Vina skorları göstermiştir. En iyi skoru −10.0 kcal/mol ile LCA-VDR almış, bunu LCA-NR1H4/FXR (−9.9 kcal/mol) ve UDCA-NR1H4/FXR (−9.4 kcal/mol) izlemiştir. Urolithin A-CASP3 ve tryptamine-HTR2A ise daha düşük ancak yine de makul olan −7.1 kcal/mol skorlara sahip olmuştur (Tablo 2).

LCA-VDR kompleksi (PDB ID: 1DB1) için öngörülen poz, LCA karboksilat oksijeni ile Ser278 arasındaki konvansiyonel bir hidrojen bağının (4,29 Å) yanı sıra Leu230, Val234, Trp286, Val300, His305, Tyr295, Leu233 ve His397'yi içeren kapsamlı hidrofobik etkileşimler ve Met272, Leu313, Ile271, Ile268, Leu309, Phe422, Val418, Ala231, Ala303, Cys288, Ser275 ve Phe150 ile ek van der Waals etkileşimleri ile desteklenmiştir. En üst sırada yer alan poz; −10,0 kcal/mol Vina skoruna, 2055 ų boşluk boyutuna ve (10, 19, 33) ızgara merkezine sahipti (Tablo 3, Şekil 5A,B).

LCA-NR1H4/FXR kompleksi (PDB ID: 3DCT) için −9.9 kcal/mol'lik docking skoru; His294 ve Ile335'i içeren öngörülen hidrojen bağları, His294 ile bir π-Sigma etkileşimi ve Met290, Met328, Ala291, Leu287, Ile352 ve His447'yi içeren hidrofobik Alkyl veya π-Alkyl temasları ile birlikte görülmüştür; ayrıca van der Waals temasları, steroidal iskeletin FXR cebine yerleşimini desteklemektedir (Tablo 4, Şekil 6A,B).

UDCA-NR1H4/FXR kompleksinin (PDB ID: 3DCT) öngörülen pozu, His447 (3,66 Å) ile konvansiyonel bir hidrojen bağı, Gly322 (3,46 Å) ile başka bir hidrojen bağı, Val325 (4,96 Å) ile bir π-Anyon etkileşimi ve Trp469 (4,51 Å) ile bir karbon-hidrojen bağı göstermiştir. Etkileşim haritası ayrıca Arg395 (3,89 Å) ve Gln396 (3,40 Å) ile elverişsiz donör-donör temaslarını belirlemiş olup, bu durum aynı reseptör cebinde UDCA'nın LCA'ya kıyasla daha düşük Vina skorunun, daha az elverişli lokal geometri veya elektrostatiklerden kaynaklanabileceğini düşündürmektedir (Tablo 5, Şekil 7A,B).

Urolithin A-CASP3 kompleksinde (PDB ID: 2DKO), öngörülen bağlanma modu; Gln161 (3.78 ve 4.19 Å), Ser120 (3.95 Å) ve Arg207 (3.05 ve 3.77 Å) ile konvansiyonel hidrojen bağlarını içeriyordu ve ayrıca Arg207 ile π-Katyon etkileşimleri, Cys163 ile bir π-Donör hidrojen bağı ve Arg64, Ala162, His121, Ser205 ve Trp206'yı içeren ek π-Alkil ve van der Waals temasları ile stabilize edilmişti (Tablo 6, Şekil 8A,B).

Triptamin-HTR2A kompleksi (PDB ID: 6A93) için öngörülen poz; triptaminin protonlanmış amini ile serotonin ve ilgili reseptörlerde aminerjik ligandların protonlanmış aminini sabitleyen korunmuş transmembran heliks 3 aspartatı (Ballesteros-Weinstein numaralandırmasında D3.32) olan Asp155 arasındaki elektrostatik tuz köprüsüyle^41,42,43, Thr160 ve Ser159 ile kurulan hidrojen bağları, Phe340 ve Trp336 ile aromatik temaslar ve Val156 ile Ile163 ile π-Alkil etkileşimleri aracılığıyla stabilize edilmiştir. Tyr370, Phe339, Ser242, Phe243, Phe332 ve Leu123 ile olan ek van der Waals temasları, ortosterik cep bağlanma paternini desteklemiştir (Tablo 7, Şekil 9A,B).

Kenetlenme protokolü doğrulaması

Docking protokolünün güvenilirliğini değerlendirmek için iki tamamlayıcı kontrol deneyi gerçekleştirilmiştir. Yeniden docking (pozitif) kontrolleri için, ko-kristalize ligandlar referans X-ışını kristal yapılarıyla çıkarılmış ve kendi doğal bağlanma bölgelerine yeniden dock edilmiştir. VDR/1DB1 yapısındaki vitamin D analoğu VDX için en yüksek sıralamaya sahip öngörülen poz, kristalografik konumdan 0.87 Å sapmış; FXR/3DCT'deki ko-kristal ligand WAY-362450 ise 1.79 Å sapmıştır; her iki değer de geleneksel 2.0 Å kabul eşiğinin altında kalmış, bu da docking protokolünün bu reseptör sistemleri için geometrik geçerliliğini desteklemiştir (Şekil 10A,B). Çapraz docking (negatif) kontrolleri için, litokolik asit, kendisi için bilinen bir ligand olmadığı bir sisteini proteaz olan caspase-3'e (2DKO) dock edilmiş ve sonuçta elde edilen öngörülen skor (−8.3 kcal/mol), kendi bilişsel hedefi olan VDR'deki skorundan (−10.0 kcal/mol) 1.7 kcal/mol daha zayıf çıkmıştır; bu durum öngörülen bağlanma bölgesi seçiciliği ile tutarlıdır. Triptaminin VDR'ye dock edilmesi sonucunda, bilişsel HTR2A hedefindeki −7.1 kcal/mol değere kıyasla −6.4 kcal/mol öngörülen skor elde edilmiştir; 0.7 kcal/mol'lik bu fark, metabolit ligandların hedef protein skorlarına yönelik moleküler docking çalışmalarında bildirilen belirsizlik sınırı dahilindedir ve bu nedenle bu daha küçük ligand için yalnızca düşük düzeyde bir öngörülen seçiciliğe işaret etmektedir (Şekil 10C). Toplu olarak değerlendirildiğinde, bu kontroller, docking protokolünün test edilen koşullar altında bilinen bağlanma geometrilerini yeniden ürettiğini ve bilişsel çiftleri bilişsel olmayan çiftlardan ayırt ettiğini göstermektedir; ancak bunlar deneysel afinite ölçümlerinin yerini tutmayan hesaplamalı öngörüler olarak kalmaktadır (Tablo 8).

Moleküler dinamik simülasyonu

Önceliklendirilmiş beş kompleks için 200 ns üretim yörüngeleri üzerinden moleküler dinamik simülasyonları tamamlanmıştır. Dört çözünür ve nükleer reseptör kompleksi açık sulu çözücüde simüle edilirken, tryptamine-HTR2A kompleksi, bu G proteinli reseptör için fizyolojik olarak uygun bir membran ortamı sağlamak amacıyla açık bir POPC lipid çift katmanında simüle edilmiştir. Analizler, kenetlenmiş pozların zamana bağlı koşullar altındaki dinamik stabilitesini test etmiş ve kompleksler arasındaki göreceli yapısal davranışın karşılaştırılmasına olanak sağlamıştır (Tablo 9).

LCA-VDR/1DB1 kompleksinin RMSD profili, ilk 10 ns boyunca kısa bir dengeleme süreci göstermiş, ardından dalgalanmaların temel olarak 0,20–0,28 nm aralığında olduğu kararlı bir platoya ulaşmıştır (Şekil 11A). RMSF değerleri düşük çıkmış ve çoğu kalıntı için ana zincir dalgalanmaları < 0,15 nm olarak kaydedilmiştir (Şekil 11B). Hidrojen bağı analizi, zaman zaman 7'ye yükselen, ancak genel olarak 2–5 hidrojen bağından oluşan kalıcı bir ağ olduğunu göstermiştir (Şekil 11C). Jiro yarıçapı (Rg) 1,25–1,75 nm aralığında tutulmuş ve çözücüye erişilebilir yüzey alanı (SASA) 130 nm² civarında seyretmiştir (Şekil 11D,E).

urolithin A-CASP3/2DKO kompleksi daha yüksek dinamik aktivite sergilemiştir. RMSD başlangıçta artmış ve ardından 165 ns civarında kısa süreli bir yüksek sapma olayı ile birlikte 0,4 ve 0,7 nm arasında dalgalanmıştır (Şekil 12A). RMSF analizi, kalıntı düzeyinde yüksek mobilite göstermiş olup en büyük dalgalanmalar 175. kalıntı civarındaki esnek loop bölgesinde görülmüştür (Şekil 12B). Hidrojen bağı analizi, ilk 30–40 ns boyunca yaklaşık 2–5 bağdan oluşan geniş bir başlangıç ağı, ardından çoğunlukla 0 ila 2 arasında kesikli bağlar olduğunu ortaya koymuştur (Şekil 12C). Buna karşılık gelen jiro yarıçapı ve SASA profilleri Şekil 12D,E'de gösterilmiştir.

NR1H4/FXR (3DCT) safra asidi sistemleri için, ana zincir RMSD profili yörüngenin büyük bir kısmında nispeten dar bir aralıkta kalırken (Şekil 13A), RMSF profili çekirdek bölgelerde daha düşük mobilite ve esnek bölgelerde daha yüksek dalgalanmalar göstermiştir (Şekil 13B). LCA-3DCT kompleksi yörünge boyunca yaklaşık üç ila dört kalıcı hidrojen bağıyı korurken, UDCA-3DCT kompleksi daha fazla hidrojen bağı dalgalanması ve yaklaşık 125 ns sonra hidrojen bağlarında bir azalma sergilemiştir. LCA ve UDCA bağlı sistemler içinna yarıçap profilleri sırasıyla Şekil 13C,D'de ve karşılık gelen SASA profilleri Şekil 13E,F'de gösterilmiştir.

Triptamin-HTR2A kompleksinin membran moleküler dinamiği

Triptamin-HTR2A/6A93 kompleksi; 258 lipid molekülünden oluşan açık bir POPC lipid çift katmanı, açık bir üç bölgeli su modeli ve 0.15 M NaCl içeren, toplam sistem boyutu yaklaşık 100.925 atom olan bir ortamda 200 ns boyunca simüle edilmiştir^33,44,45. Reseptör, trajektör boyunca çift katman içinde kararlı bir şekilde gömülü kalmıştır (Şekil 14). Ana zincir RMSD değeri, ilk 100 ns içinde yaklaşık 0.10 nm'den 0.15–0.20 nm civarındaki kararlı bir platoya yükselmiş ve ardından tüm değerler 0.25 nm'nin altında kalarak sabitlenmiştir; bu durum, reseptörün membran ortamında global bir açılım olmaksızın kararlı bir konformasyon koruduğunu göstermektedir (Şekil 15A). Kalıntı başına RMSF, transmembran helikal çekirdekte düşük dalgalanmalar, loop ve terminal bölgelerde ise tipik GPCR esnekliği ile uyumlu olarak beklenen daha yüksek bir mobilite göstermiştir (Şekil 15B). Jirasyon yarıçapı yaklaşık 2.06 ile 2.12 nm arasında sıkı bir şekilde sınırlanmış ve SASA, progresif bir sapma olmaksızın dar bir bant içinde dalgalanmıştır; her iki veri de kompakt transmembran demetinin korunduğunu doğrulamaktadır (Şekil 15C,D).

Protein ve ligand arasındaki hidrojen bağları, hidrojen bağlarının sayısında 1 ile 3 arasında önemli dalgalanmalar olmakla birlikte, tüm trajektör boyunca korundu (Şekil 15E). Temel iyonik etkileşimin kalıcılığını spesifik olarak değerlendirmek için, tryptamine'in protonlanmış amonyum azotu ile Asp155'in (D3.32) karboksilat oksijen atomları arasındaki minimum mesafe tüm trajektör boyunca izlendi. Bu mesafe, 0,270 nm ortalamanın çevresinde dar bir dağılım sergiledi (minimum 0,247 nm, maksimum 0,424 nm) ve tuz köprüsü teması (< 0,4 nm), yalnızca iki kısa süreli geçişsel sapma ile simülasyonun %99,9'u boyunca korundu ve herhangi bir sürekli ayrılma olayı gözlenmedi (Şekil 16). Bu sonuçlar, korunmuş Asp155 iyonik etkileşiminin, membran simülasyonu boyunca tryptamine'i HTR2A ortosterik cebi içerisinde stabilize etmek için yeterli olduğunu göstermektedir.

MM-PBSA bağlanma serbest enerjisi ve kalıntı başına ayrıştırma

Beş komplekse ek bir enerjik önceliklendirme katmanı eklemek amacıyla MM-PBSA analizi gerçekleştirilmiştir (Tablo 10). Dört sulu kompleks için kalıntı bazlı ayrıştırma, öngörülen her bir bağlanma modu için ana enerjik katkıları belirlemiştir. LCA-VDR/1DB1 kompleksinde, ligand ve Gln317 uygun bir katkı sağlarken, Trp286 uygun olmayan bir katkı göstermiştir. Urolithin A-CASP3/2DKO kompleksinde, Arg64 ve Arg207 güçlü negatif kalıntı bazlı katkılar sergileyerek önemli polar veya elektrostatik stabilizasyona işaret etmiştir; buna rağmen, ilgili trajektori oldukça dinamik kalmaya devam ederek, tek başına uygun kalıntı seviyesi enerjisinin sürekli kompleks stabilitesini garanti etmediğini göstermiştir. 3DCT sistemleri için LCA bağlanması öncelikle Arg331 tarafından yönlendirilirken, UDCA bağlanması Glu326, Asp394, Arg395, Arg441 ve Asp470'tan oluşan daha dağılımlı bir enerjik ağ içermiştir. Dört sulu sistem genelinde, MM-PBSA ayrıştırması LCA tabanlı komplekslerin göreceli önceliklendirmesini desteklemiştir.

Membrana gömülü tryptamine-HTR2A/6A93 kompleksi için, çift katmanlı lipid yatağı yörüngesinden çıkarılan protein-ligand alt sistemine MM-PBSA analizi uygulanmıştır^46,47. Ligand ve, hem kenetleme hem de yörünge mesafe analizlerinde tanımlanan tuz köprüsü etkileşimi ile tutarlı olarak, uzak ara kalıntı düzeyindeki baskın stabilize edici katkıyı sağlayan Asp155 (D3.32) için olumlu katkılar gözlemlenmiştir. Bağlanma cebini çevreleyen aromatik ve polar temas ağını birlikte oluşturan ortosterik cep kalıntıları (Ser86, Phe87, Phe133, Phe140, Phe141, Val156, Ser159, Thr160, Ile163, Val167, Tyr171) arasında Trp137, kalıntı başına en yüksek olumsuz katkıyı göstermiştir. Bu değerler, yapısal önceliklendirme için göreceli hesaplamalı tahminleri temsil etmekte olup deneysel bağlanma afiniteleri değildir.

Şekil 1: IBS-C'de metabolitlerle ilişkili konak gen önceliklendirmesi için hesaplamalı iş akışı. Metabolit seçimi, hedef tahmini, transkriptomik diferansiyel ekspresyon, örtüşme analizi, ağ ve yolak zenginleştirme, moleküler kenetlenme, moleküler dinamik simülasyonu ve MM-PBSA bağlanma serbest enerjisi analizini entegre eden sekiz aşamalı iş akışının şematik gösterimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: IBS-C mukozasında diferansiyel ekspresyon ve metabolit-hedef örtüşme analizi. (A) GSE36701'deki gen düzeyindeki diferansiyel ekspresyonun volkan grafiği. Mavi noktalar, anlamlı şekilde downregüle olmuş genler; kırmızı noktalar, anlamlı şekilde upregüle olmuş genler; gri noktalar, anlamlı olmayan genler. Seçilen örtüşen metabolitle ilişkili genler etiketlenmiştir. (B) 330 benzersiz öngörülen metabolit hedefi ile GSE36701'deki downregüle olmuş genler arasındaki örtüşmeyi gösteren Venn diyagramı; 17 gen ortaktır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: GSE36701'e karşı öngörülen 17 metabolit hedef geninin istatistiksel değerlendirmesi. (A) Anlamlılık düzeyine göre renklendirilmiş, tüm 17 gen için gen başına log2 kat değişimi. (B) Fisher'in kesin testi ile arka plan genlerine karşı öngörülen hedeflerin diferansiyel ekspresyon oranı. (C) Fisher'in kesin testi için iki kere iki'lik bir kontingans tablosu kullanılmıştır. 17 hedefin tamamı anlamlı şekilde downregüle olmuştur; örtüşme, istatistiksel bir zenginleştirmeden ziyade tanımlayıcı bir yönelimsel patern olarak yorumlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Kompozit protein-protein etkileşim ağı kurulumu ve örtüşen metabolit ilişkili genlerin yol zenginleştirme protein-protein etkileşim ağları. (A) Ağ 1: Tüm 17 genin birleştirilmiş meta-ağı. (B) Ağ 2: Sekiz gene (CASR, FFAR2, GCG, GNAQ, GPHN, GPR68, MLN, TBXA2R) özgü propiyonat ağı. (C) Ağ 3: Dört genli (HTR1B, HTR2A, HTR2B, HTR6) triptamin/serotonin ağı. Ağlar, protein-protein etkileşim ağı kurulumu ve yol zenginleştirme güven düzeyi ≥ 0,700 kullanılarak en az Homo sapiens için oluşturulmuştur. Kenarlar, açıklama destekli fonksiyonel ilişkiyi temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Litokolik asidin VDR ile kompleks halindeki (PDB ID: 1DB1) üç boyutlu ve iki boyutlu yapısal gösterimi. (A) Litokolik asidin küreler şeklinde gösterildiği üç boyutlu yüzey ve karton gösterimi. (B) Ser278 hidrojen bağını ve çevredeki hidrofobik ve van der Waals temaslarını gösteren iki boyutlu etkileşim haritası. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6. Litokolik asidin NR1H4/FXR (PDB ID: 3DCT) ile kompleks halindeki üç boyutlu ve iki boyutlu yapısal temsili. (A) Üç boyutlu yüzey ve karton temsili. (B) His294 ve Ile335 ile hidrojen bağlarını, bir π-Sigma etkileşimini ve çevreleyen temasları gösteren iki boyutlu etkileşim haritası. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Ursodeoksikolik asidin NR1H4/FXR (PDB ID: 3DCT) ile kompleks halindeki üç boyutlu ve iki boyutlu yapısal gösterimi. (A) Üç boyutlu yüzey ve karton gösterimi. (B) His447 ve Gly322 ile hidrojen bağlarını, Val325 ile bir π-Anyon etkileşimini, Trp469 ile bir karbon-hidrojen bağını ve Arg395 ile Gln396 ile elverişsiz donör-donör temaslarını gösteren iki boyutlu etkileşim haritası. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: urolithin A'nın CASP3 (PDB ID: 2DKO) ile kompleks halindeki üç boyutlu ve iki boyutlu yapısal gösterimi. (A) Üç boyutlu yüzey ve karton gösterimi. (B) Gln161, Ser120 ve Arg207 ile hidrojen bağlarını, Arg207 ile π-Kation etkileşimlerini, Cys163 ile bir π-Donör hidrojen bağını ve çevre kontaklarını gösteren iki boyutlu etkileşim haritası. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 9: HTR2A (PDB ID: 6A93) ile kompleks halindeki tryptamine'in üç boyutlu ve iki boyutlu yapısal gösterimi. (A) Üç boyutlu bir moleküler görselleştirme programında oluşturulmuş üç boyutlu yüzey ve karikatür temsili. (B) Moleküler görselleştirme ve iki boyutlu etkileşim diyagramı aracıyla oluşturulmuş, Asp155 tuz köprüsünü ve ek bağlanma bölgesi etkileşimlerini gösteren iki boyutlu etkileşim haritası. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 10: Docking protokolü doğrulaması. (A,B) Co-kristalize ligandların VDR/1DB1 (RMSD 0.87 Å) ve FXR/3DCT (RMSD 1.79 Å) yapılarına yeniden docking edilmesi; kristalografik ve yeniden dock edilen pozlar üst üste bindirilmiştir ve her ikisi de 2.0 Å kabul eşiğinin altındadır. (C) Çapraz docking seçiciliği: litokolik asit ve triptamin için kognat ve non-kognat Vina skorları. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 11. LCA-VDR/1DB1 kompleksinin 200 ns boyunca moleküler dinamik yörünge analizi. (A) RMSD profili. (B) RMSF profili. (C) Hidrojen bağ sayısı. (D) Jirasyon yarıçapı profili. (E) SASA profili. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 12: urolithin A-CASP3/2DKO kompleksinin 200 ns boyunca moleküler dinamik yörünge analizi. (A) Geniş konformasyonel dalgalanmaları ve 165 ns civarında geçici bir yüksek sapma olayını gösteren RMSD profili. (B) 175. kalıntı civarında belirgin kalıntı düzeyinde esnekliği gösteren RMSF profili. (C) Hidrojen bağı sayısı. (D) Jirasyon yarıçapı profili. (E) SASA profili. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 13: NR1H4/FXR (3DCT) safra asidi sistemlerinin 200 ns boyunca moleküler dinamik trajektör analizi. (A) 3DCT kompleksi için ana zincir RMSD profili. (B) Ana zincir RMSF profili. (C) 3DCT-LCA için çevirme yarıçapı (Rg) profili. (D) 3DCT-UDCA için çevirme yarıçapı (Rg) profili. (E) 3DCT-LCA için SASA profili. (F) 3DCT-UDCA için SASA profili. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 14: Açık bir POPC lipid çift katmanına gömülmüş triptamin-HTR2A kompleksi. Reseptör, çift katmanı kapsayan bir çizim şeklinde; POPC lipidleri, fosfat baş grupları vurgulanmış çizgiler olarak ve triptamin ortosterik cep içerisinde gösterilmiştir. Suyun membran üzerinde ve altında olduğu görülmektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 15: Açık POPC lipid çift katmanında 200 ns boyunca tryptamine-HTR2A/6A93 kompleksinin moleküler dinamik yörünge analizi. (A) Omurga RMSD profili. (B) Kalıntı başına RMSF profili. (C) Jirasyon yarıçapı profili. (D) SASA profili. (E) Protein-ligand hidrojen bağı sayısı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 16: 200 ns'lik membran trajektörü boyunca triptamin-Asp155 (D3.32) iyonik etkileşiminin sürekliliği. Triptamin amonyum azotu ile Asp155 karboksilat oksijen atomları arasındaki minimum mesafe zamana karşı grafiğe dökülmüştür; kesikli çizgi 0.4 nm tuz köprüsü temas eşiğini belirtmektedir. Temas, simülasyonun %99.9'unda korunmuştur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Gen Sembolü	Köken Metabolit(ler)i	Fonksiyonel Kategori	log2FC	FDR (düz. P-değeri)	Anlamlılık Kademesi
GCG	Propionat	Peptit hormonla ilişkili protein	−1.342	1.97e−7	FDR <0.001 & |logFC > 1
HDAC3	Bütirat	Enzim	−1.234	2.44e−6	FDR <0.001 & |logFC| > 1
CASP3	Urolithin A	Enzim	−1.198	6.66e−7	FDR <0.001 & |logFC| > 1
GPR68	Propionat	Membran reseptörü	−1.137	4.35e−6	FDR <0.001 & |logFC| > 1
GNAQ	Propionat	Hücre içi sinyalizasyon proteini	−1.122	1.05e−6	FDR <0.001 & |logFC| > 1
GPHN	Propionat	Diğer hücre içi protein	−1.109	1.13e−6	FDR <0.001 & |logFC| > 1
TBXA2R	Propionat	Membran reseptörü	−1.104	4.04e−7	FDR <0.001 & |logFC| > 1
HTR6	Triptamin	Membran reseptörü	−0.967	2.17e−5	FDR <0.001
VDR	Litokolik asit	Nükleer reseptör	−0.942	5.73e−7	FDR <0.001
HTR2A	Triptamin	Membran reseptörü	−0.937	4.99e−6	FDR <0.001
FFAR2	Propionat	Membran reseptörü	−0.889	1.44e−4	FDR <0.001
NR1H4	Litokolik asit / Ursodeoksikolik asit	Nükleer reseptör	−0.861	3.68e−6	FDR <0.001
HTR2B	Triptamin	Membran reseptörü	−0.702	1.29e−4	FDR <0.001
MLN	Propionat	Peptit hormonla ilişkili protein	−0.605	7.39e−5	FDR <0.001
KYAT1	Indol-3-laktik asit / Indol-3-propiyonik asit	Enzim	−0.530	3.61e−4	FDR <0.001
CASR	Propionat	Membran reseptörü	−0.483	4.05e−4	FDR <0.001
HTR1B	Triptamin	Membran reseptörü	−0.455	3.18e−2	FDR <0.05

Tablo 1: IBS-C rektal mukoza veri setindeki diferansiyel olarak eksprese edilen genlerle örtüşen, öngörülen metabolit ilişkili hedef genler. Listelenen tüm örtüşen genler aşağı düzenlenmiştir (downregulated). Tablo 1, bir hesap çizelgesi tablosu olarak ayrı ayrı sunulmuştur ve her bir hedef için; kaynak metabolit(ler)i, fonksiyonel kategori, hedef öngörü kaynağını (kimyasal-protein etkileşim hedef öngörüsü, bir moleküler kenetlenme programı veya her ikisi), mevcut olduğunda kimyasal-protein etkileşim hedef öngörüsü birleşik etkileşim skorunu ve moleküler kenetlenme programı olasılığını, öngörü aşamasını, log2 kat değişimi (fold change) ve ekspresyon-anlamlılık aşaması ile birlikte FDR değerini listeler. Kaynak: Gen ekspresyon değerleri, gen bazında birleştirilmiş GSE36701 diferansiyel-ekspresyon tablosundan (gen başına en düşük FDR'ye sahip prob) elde edilmiştir. Hedef öngörü kaynağı ve güven değerleri, kimyasal-protein etkileşim hedef öngörüsü birleşik etkileşim skoru ≥ 0,700 ve moleküler kenetlenme programı olasılığı ≥ 0,70 eşik değerleri kullanılarak, bir kimyasal-protein etkileşim hedef öngörüsü ve bir moleküler kenetlenme programının çıktılarından derlenmiştir. Kimyasal-protein etkileşim hedef öngörü skorları 0–1 ölçeğinde birleşik skorlardır; STP, bir moleküler kenetlenme programı olasılığını ifade eder. Aşama 1 = kimyasal-protein etkileşim hedef öngörüsü-kesin destek; Aşama 1+ = bir moleküler kenetlenme programı tarafından çapraz desteklenen kimyasal-protein etkileşim hedef öngörüsü-kesin destek.

Kompleks	Protein (PDB ID)	Ligand	Vina Skoru (kcal/mol)	Kavite Boyutu (A^3)	Izgara Merkezi X,Y,Z (A)	Arama Kutusu (A)
LCA-VDR	VDR (1DB1)	Litokolik asit	−10.0	2055	10, 19, 33	25 x 25 x 25
LCA-NR1H4/FXR	NR1H4/FXR (3DCT)	Litokolik asit	−9.9	3395	137, 31, 78	25 x 25 x 25
UDCA-NR1H4/FXR	NR1H4/FXR (3DCT)	Ursodeoksikolik asit	−9.4	3395	137, 31, 78	25 x 25 x 25
Urolithin A-CASP3	CASP3 (2DKO)	Urolitin A	−7.1	233	37, 34, 32	25 x 25 x 25
Triptamin-HTR2A	HTR2A (6A93)	Triptamin	−7.1	3238	12, −1, 61	25 x 25 x 25

Tablo 2: Moleküler kenetleme sonuçları: önceliklendirilen beş protein-ligand kompleksi için metabolit ligandların hedef proteinlere yönelik moleküler kenetleme sonuçlarının en yüksek sıralamalı skorları ve boşluk parametreleri. Boşluk boyutu ų cinsinden bildirilmiştir. Kaynak: Docking_Validation/Results/Docking_Validation_Results.xlsx, 'Original_Docking_Scores' sayfası. Metabolit ligandların hedef proteinlere moleküler kenetlenmesi; tüm kompleksler için exhaustiveness = 8, seed = 42 (sabit), num_modes = 9 olarak ayarlanmıştır; en yüksek sıralamalı (mod 1) poz bildirilmiştir.

Etkileşim Türü	Kalıntı(lar)	Mesafe (A)	Notlar
Konvansiyonel hidrojen bağı	Ser278	4.29	LCA karboksilat oksijeni
Hidrofobik / Pi-Alkil etkileşimi	Leu230, Val234, Trp286, Val300, His305, Tyr295, Leu233, His397	-
Van der Waals teması	Met272, Leu313, Ile271, Ile268, Leu309, Phe422, Val418, Ala231, Ala303, Cys288, Ser275, Phe150	-

Tablo 3: Litokolik asidin VDR (PDB ID: 1DB1) ile kenetlenmesi için oluşturulan bağlanma modları. Kaynak: moleküler görselleştirme ve iki boyutlu etkileşim diyagramı aracı 2D ligand-kalıntı etkileşim diyagramları, makale Sonuçlar (Moleküler kenetlenme) bölümünde bildirildiği gibidir. '-' işareti, söz konusu temas için ayrı bir mesafe değerinin bildirilmediğini gösterir.

Etkileşim Türü	Kalıntı(lar)	Mesafe (A)	Notlar
Hidrojen bağı	His294	-
Hidrojen bağı	Ile335	-
Pi-Sigma etkileşimi	His294	-
Alkil / Pi-Alkil (hidrofobik)	Met290, Met328, Ala291, Leu287, Ile352, His447	-
Van der Waals teması	Ek cep kalıntıları (kaynakta tek tek belirtilmemiştir)	-	Steroid iskelet yerleşimini destekler

Tablo 4: NR1H4/FXR (PDB ID: 3DCT) ile litokolik asit docking çalışması için oluşturulan bağlanma modları.

Kaynak: moleküler görselleştirme ve iki boyutlu etkileşim diyagramı aracı 2D ligand-kalıntı etkileşim diyagramları, makalenin Sonuçlar (Moleküler kenetlenme) bölümünde bildirildiği gibidir. '-' işareti, söz konusu temas için ayrı bir mesafe değerinin bildirilmediğini gösterir.

Etkileşim Türü	Kalıntı(lar)	Mesafe (A)	Notlar
Konvansiyonel hidrojen bağı	His447	3.66
Hidrojen bağı	Gly322	3.46
Pi-Anyon etkileşimi	Val325	4.96
Karbon-hidrojen bağı	Trp469	4.51
Elverişsiz donör-donör teması	Arg395	3.89
Elverişsiz donör-donör teması	Gln396	3.40

Tablo 5: Ursodeoksikolik asidin NR1H4/FXR (PDB ID: 3DCT) ile kenetlenmesi için oluşturulan bağlanma modları.Kaynak: moleküler görselleştirme ve iki boyutlu etkileşim diyagramı aracı 2D ligand-kalıntı etkileşim diyagramları, makale Sonuçlar (Moleküler kenetlenme) bölümünde bildirildiği gibidir. '-' işareti, söz konusu temas için ayrı bir mesafe değerinin bildirilmediğini gösterir.

Etkileşim Türü	Kalıntı(lar)	Mesafe (A)	Notlar
Konvansiyonel hidrojen bağı	Gln161	3.78
Konvansiyonel hidrojen bağı	Gln161	4.19	ikinci temas
Konvansiyonel hidrojen bağı	Ser120	3.95
Konvansiyonel hidrojen bağı	Arg207	3.05
Konvansiyonel hidrojen bağı	Arg207	3.77	ikinci temas
Pi-Kasyon etkileşimi	Arg207	-
Pi-Donör hidrojen bağı	Cys163	-
Pi-Alkil / van der Waals teması	Arg64, Ala162, His121, Ser205, Trp206	-

Tablo 6: urolithin A'nın CASP3 (PDB ID: 2DKO) ile kenetlenmesi için oluşturulan bağlanma modları.Kaynak: moleküler görselleştirme ve iki boyutlu etkileşim diyagramı aracı 2D ligand-kalıntı etkileşim diyagramları, makale Sonuçlar (Moleküler kenetlenme) bölümünde bildirildiği gibidir. '-' işareti, söz konusu temas için bireysel bir mesafe değerinin bildirilmediğini gösterir.

Etkileşim Türü	Kalıntı(lar)	Mesafe (A)	Notlar
Elektrostatik tuz köprüsü	Asp155 (D3.32)	-	triptaminin protonlanmış amini
Hidrojen bağı	Thr160	-
Hidrojen bağı	Ser159	-
Aromatik temas	Phe340, Trp336	-
Pi-alkil etkileşimi	Val156, Ile163	-
Van der Waals teması	Tyr370, Phe339, Ser242, Phe243, Phe332, Leu123	-

Tablo 7: Triptaminin HTR2A (PDB ID: 6A93) ile kenetlenmesi için oluşturulan bağlanma modları. Kaynak: moleküler görselleştirme ve iki boyutlu etkileşim diyagramı aracı olan 2D ligand-kalıntı etkileşim diyagramları, makalenin Sonuçlar (Moleküler kenetlenme) bölümünde rapor edildiği gibidir. '-' işareti, söz konusu temas için tekil bir mesafe değerinin rapor edilmediğini belirtir.

(A) Yeniden kenetlenme doğrulaması (pozitif kontroller)
PDB ID	Protein	Ko-kristal Ligand	Vina Skoru (kcal/mol)	RMSD (Å)	Eşik (A)	Sonuç
1DB1	VDR	VDX (vitamin D analoğu)	−13.0	0.87	2.0	GEÇTİ
3B-BT	FXR	WAY-362450 (064)	−11.9	1.79	2.0	PASS
(B) Çapraz yükleme doğrulaması (negatif kontroller)
Ligand	Kognat Hedef (PDB)	Kognat Skoru (kcal/mol)	Kognat Olmayan Hedef (PDB)	Kognat Olmayan Skor (kcal/mol)	Delta (kcal/mol)	Seçicilik
Litokolik asit	VDR (1DB1)	−10.0	CASP3 (2DKO)	−8.3	1.7	Onaylandı
Triptamin	HTR2A (6A93)	−7.1	VDR (1DB1)	−6.4	0.7	Kısıtlı (Vina belirsizliği dahilinde +/−0,5–1,0)

Tablo 8: Kenetleme protokolü doğrulama sonuçları: yeniden kenetleme RMSD değerleri (pozitif kontroller) ve çapraz kenetleme skorları (negatif kontroller). Kaynak: Docking_Validation/Results/Docking_Validation_Results.xlsx ve Docking_Validation/Logs/*.log (metabolit ligandların hedef proteinlere moleküler kenetlemesi, exhaustiveness = 8, seed = 42, 25 Å × 25 Å × 25 Å kutu). RMSD, ağır atom, atom adı eşleştirme ile hesaplanmıştır (süperpozisyon yok).

Kompleks	RMSD (nm), ortalama + / – SD (aralık)	Rg (nm), ortalama + / – SD (aralık)	SASA (nm^2), ortalama + / – SD (aralık)	H-bağları, ortalama + / – SD (aralık)	RMSF (nm), ortalama (maks)
LCA-VDR/1DB1	0.230 + / – 0.025 (0.167–0.296)	1.889 + / − 0.009 (1.863–1.919)	130.4 + / − 2.3 (122.3–137.4)	1.9 + / − 0.9 (0–7)	0.093 (maks 0.600, 120. kalıntı)
LCA-NR1H4/FXR/3DCT	0.190 + / – 0.020 (0.135–0.281)	1.824 + / − 0.008 (1.804–1.849)	129.7 + / − 2.3 (121.9–138.1)	3.8 + / − 0.7 (1–6)	0.113 (maks 0.298)
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT	0.190 + / – 0.020 (0.135–0.281)	1.834 + / − 0.013 (1.809–1.921)	131.0 + / −3.4 (121.6–143.5)	1.1 + / − 1.1 (0–5)	0.113 (maks 0.298)
Urolithin A-CASP3/2DKO	0.521 + / – 0.058 (0.244–0.755)	1.892 + / − 0.024 (1.839–1.984)	134.9 + / − 3.0 (126.4–146.4)	0.6 + / − 0.7 (0–3)	1.172 (maks 2.532, 175. kalıntı)
Tryptamine-HTR2A/6A93 (membran)	0.177 + / –0.017 (0.131–0.227)	2.089 + / − 0.007 (2.070–2.116)	165.1 + / − 2.7 (156.–172.7)	1.7 + / − 0.7 (0–4)	0.090 (maks 0.319)

Tablo 9: Membrana gömülü tryptamine-HTR2A sistemi dahil olmak üzere, önceliklendirilen beş protein-ligand kompleksinin 200 ns'lik moleküler dinamik simülasyon davranışlarının özeti. Kaynak: her bir 200 ns'lik üretim yürütmesinin, protokol adımı 8.8 uyarınca son 150 ns'lik (50–200 ns) kısmı üzerinden hesaplanan moleküler dinamik yörünge-analiz yardımcı (.xvg) dosyaları — gmx rms, gmx gyrate, gmx sasa, gmx hbond, gmx rmsf. RMSD/Rg ana zincire fitlenmiş; SASA prob yarıçapı 0.14 nm; H-bağı donör-akseptör kesme değeri 0.35 nm / 30 °. LCA-3DCT ve UDCA-3DCT, liganda özgü Rg/SASA/H-bağları ile birlikte tek bir protein ana zincir yörüngesini (RMSD, RMSF) paylaşmaktadır.

Triptamin-HTR2A/6A93 (membran) — kantitatif kalıntı bazlı ayrıştırma
Kalıntı	Toplam ddG katkısı (kcal/mol), ortalama + / − SD	Yön
Asp155 (D3.32)	−89.94 + / − 6.81	Stabilize edici (dominant)
Triptamin (ligand)	−13.01 + / − 6.22	Stabilize edici
Tyr171	13.62 + / − 4.54	Destabilize edici
Val167	23.32 + / − 3.96	Destabilize edici
Val156	20.03 + / − 3.81	Destabilize edici
Thr160	4.86 + / − 3.64	Destabilize edici
Ser159	24.16 + / − 3.48	Destabilize edici
Ser86	24.48 + / − 3.65	Destabilize edici
Phe87	35.18 + / − 4.04	Destabilize edici
Phe133	32.80 + / −3.70	Destabilize edici
Phe140	30.63 + / − 3.84	Destabilize edici
Phe141	35.25 + / − 3.55	Destabilize edici
Ile163	27.64 + / − 3.71	Destabilize edici
Trp137	53.77 + / − 4.32	Destabilize edici (en büyük elverişsiz)
Diğer dört kompleks — kalıntı bazlı ayrıştırmada tanımlanan kalıntılar (kalitatif)
Kompleks	Kalıntı	Yön
LCA-VDR/1DB1	Ligand (LCA)	Elverişli
LCA-VDR/1DB1	Gln317	Elverişli
LCA-VDR/1DB1	Trp286	Elverişsiz
LCA-NR1H4/FXR/3DCT	Arg331	Elverişli (dominant)
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT	Glu326	Karma/dağılmış ağ
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT	Asp394	Karma/dağılmış ağ
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT	Arg395	Karma/dağılmış ağ
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT	Arg441	Karma/dağılmış ağ
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT	Asp470	Karma/dağılmış ağ
Urolithin A-CASP3/2DKO	Arg64	Güçlü elverişli (polar/elektrostatik)
Urolithin A-CASP3/2DKO	Arg207	Güçlü elverişli (polar/elektrostatik)

Tablo 10: Kalıntı başına MM-PBSA ayrıştırması KISA ÖZET: membran gömülü triptamin-HTR2A sistemi dahil olmak üzere, önceliklendirilmiş beş protein-ligand kompleksinin her biri için stabilize edici ve destabilize edici kalıntılar (≥ 0.5 kcal mol⁻¹ mutlak katkı).Kaynak: Membrane Simulation/03_MMPBSA/results/FINAL_DECOMP_MMPBSA.dat (moleküler mekanik/sürekli çözücü bağlanma enerjisi hesaplama aracı Generalized Born (GB) kalıntı başına ayrıştırma, 'Complex: Total Energy Decomposition'). Kalıntı numaraları, CHARMM-GUI ile oluşturulan sistemin dahili numaralandırmasından (offset +68), bu makalenin diğer bölümlerinde kullanılan orijinal 6A93 PDB numaralandırmasına dönüştürülmüştür.

Kaynak: Previous_MD Simulation data/1DB1,2KD0, LCA & UDCA_3DCT}/mmpbsa_*/Decomposition_NORMAL_GB_Complex_TDC*.svg ve makale Sonuçları (MM-PBSA bağlanma serbest enerjisi ve kalıntı başına ayrıştırma). Bu dört kompleksin proje dizininde sayısal kalıntı başına .dat/.csv çıktısı bulunmamaktadır (yalnızca makine tarafından ayıklanamayan vektör-yol metnine sahip oluşturulmuş SVG grafikleri mevcuttur); makale metninde belirtildiği üzere yalnızca kalıntı kimliği ve uygun/uygun olmayan yön raporlanmıştır. Bu dört kompleks için kesin kcal/mol katkıları kaynak deposunda mevcut değildir.

Tartışma

Bu keşif amaçlı hesaplamalı çalışma, burada halka açık bir IBS-C rektal mukozal transkriptomik veri setine uygulanan, mikrobiyal metabolitlerle ilişkili konak genlerini ve protein-ligand komplekslerini önceliklendirmeye yönelik entegre ve tekrarlanabilir bir iş akışını ortaya koymaktadır. Bu iş akışı kullanılarak, tahmin edilen mikrobiyal metabolitlerle ilişkili genlerin bir alt kümesinin, veri setinde tutarlı bir şekilde aşağı regüle edilmiş genlerle örtüştüğü ve mikrobiyota-konak iletişimiyle giderek daha fazla ilişkilendirilen GPCR, serotonerjik, kalsiyum sinyalizasyonu, nöroaktif ligand-reseptör ve nükleer reseptörle ilişkili yolaklarda kümelendiği görülmüştür^48,49. Bu bulgular kesinlikle hipotez üretici olarak yorumlanmalıdır: analiz; mikrobiyal metabolit konsantrasyonlarını, reseptör protein bolluğunu, ligand bağlanmasını, reseptör aktivasyonunu, aşağı akış sinyalizasyonunu, motiliteyi, sekresyonu, ağrı yanıtlarını veya klinik sonuçları ölçmemektedir. Desteklenebilir en güçlü sonuç, tanımlanan genlerin ve yolakların onaylanmış hastalık mekanizmaları değil, deneysel doğrulama için adaylar olduğudur.

Tekil metabolit-reseptör çiftlerini izole olarak inceleyen önceki çalışmalara kıyasla bu protokolün kritik önemi; hedef tahmini, halka açık transkriptomik veriler, ağ analizi, doğrulama kontrolleriyle birlikte docking, moleküler dinamik ve MM-PBSA'nın tek bir ardışık önceliklendirme hattına entegre edilmesinde yatmaktadır. Her aşama, bir önceki aşamadan elde edilen aday setini daraltır ve bağlamsallaştırır; nihai aday listesini deneysel olarak yönetilebilir kılan da bu ardışık filtrelemedir. Burada tanımlanan GNAQ merkezli GPCR modülü ve serotonin reseptörü ilişkili modül; Gq sinyalizasyonunun fosfolipaz C aktivasyonu, inositol 1,4,5-trisfosfat üretimi, kalsiyum mobilizasyonu, salgı ve enteroendokrin fonksiyonundaki rolü ile kısa zincirli yağ asitlerinin ve triptofan türevli sinyalizasyonun mukozal homeostazdaki, serotonerjik sinyalizasyonun ise gastrointestinal motilite, salgı, visseral hassasiyet ve bağırsak-beyin iletişimindeki yerleşik rolleri göz önüne alındığında biyolojik olarak makuldür^10,18,50,51.

Bu çalışmanın temel metodolojik özelliği, membrana gömülü reseptör HTR2A'nın ele alınış biçimidir. Çözünür faz simülasyonu, bir G proteini kenetli reseptörün konformasyonel davranışını yöneten lipid ortamını yeniden oluşturamadığından, tryptamine-HTR2A kompleksi açık bir POPC çift katmanında simüle edilmiştir. Bu membran ortamında reseptör, 200 ns'lik tüm trajektori boyunca yapısal olarak stabil kalmış ve tryptamine amonyum-Asp155 (D3.32) tuz köprüsü simülasyonun neredeyse tamamı boyunca korunmuştur. Kenetleme pozisyonu, trajektori boyunca süregelen temas mesafesi ve kalıntı başına baskın MM-PBSA katkısı şeklindeki üç bağımsız kanıt hattının aynı korunumlu D3.32 etkileşiminde birleşmesi, serotonin reseptörlerindeki aminerjik ligandların kanonik bağlanma geometrisini yeniden canlandıran öngörülen tryptamine bağlanma modu için dahili tutarlılık sağlamaktadır.

Bu iş akışını yeniden üretirken dikkate alınması gereken belirli metodolojik hususlar vardır. Kanonik yapıdaki hatalar veya Pan-assay interference compounds ((PAINS) olarak işaretlenmiş bileşikler, hedef tahmini ve docking üzerinden yayılır; bu durum, doğru metabolit seçimini ve kemoinformatik kürasyonu gerektirir. Güven kriterlerini tutarlı bir şekilde uygulayarak gürültü kaynaklı hedef kümelerini minimize edin (kimyasal-protein etkileşimi hedef tahmini: ≥0.700; moleküler docking programı: ≥0.70; Protein-protein etkileşim ağı oluşturma ve yol zenginleştirme: ≥0.700). Tüm metabolit ilişkili genlerin reseptör olarak yanlış tanımlanmasını önlemek için tahmin edilen hedefler fonksiyonel kategoriye göre gruplandırılmalıdır. PDB yapılarının hassas ön işlemesi, ligand enerji minimizasyonu ve bilinen bağlanma kalıntıları çevresine ızgara yerleşimi, docking'in temel yönleridir; burada sunulan redocking ve cross-docking kontrolleri, docking metodolojisinin doğruluğuna dair objektif bir ölçüt sağlar. Moleküler dinamikteki tekrarlanabilirlik zarfı; kuvvet alanı parametrizasyonu, uygun solvatasyon veya membran oluşturma, aşamalı dengeleme ve yeterli üretim örneklemesinin bir kombinasyonu ile tanımlanır.

Tipik adaptasyonlar ve sorun giderme adımları arasında; hedef tahminlemesi herhangi bir sonuç döndürmediğinde eşik değerlerinin gevşetilmesi, birden fazla proba sahip genler için prob düzeyinde yönsel tutarlılığın kontrol edilmesi ve izole protein-protein etkileşim ağı kurgusu ile yol zenginleştirme düğümlerinin biyolojik olarak ilgisiz değil, eşik değerine bağımlı olarak yorumlanması yer alır. Membran reseptörleri için, burada açıklanan HTR2A yönteminde örneklendiği gibi, sulu simülasyon yerine açık lipid çift katman simülasyonu kullanılmalıdır. Kalıntı başına enerji ayrıştırmasının gerekli olduğu durumlarda, hesaplama ayrıştırma yeteneğine sahip bir motorla gerçekleştirilmeli ve raporlanan kalıntı numaralandırması, belirsizliği önlemek için doğal reseptör numaralandırmasıyla uyumlu hale getirilmelidir. Yol zenginleştirme sonuçlarının, yol düzeyinde bir doğrulamadan ziyade, aday listesi için bir organizasyonel bağlam olarak değerlendirilmesinin en uygun olduğu görüşündeyiz. Mekanik olarak, protein düzeyindeki ko-regülasyondan bağımsız olarak, gen listesi birden fazla serotonin reseptör geni içerdiğinde GPCR, serotonerjik veya kalsiyum sinyalleme terimlerinin zenginleşmesi gerçekleşecektir. Membrana gömülü HTR2A sistemi için RMSD, Rg ve RMSF değerleri, lipid çift katman göz önünde bulundurularak yorumlanmalıdır: sonraki trajektoride Rg'deki bir azalma, küresel açılmadan ziyade transmembran demetinin çift katman kaynaklı konformasyonel adaptasyonunu yansıtabilir ve kalıcı ligand-protein hidrojen bağları, genel RMSD stabilitesi ile birlikte değerlendirilmelidir.

Bu çalışmanın kısıtlamaları oldukça fazladır ve yorumlamayı sınırlandırmaktadır. Araştırma, nispeten küçük tek bir kamuya açık veri setine dayanmaktadır ve temel kamuya açık transkriptomik depolarında (web tabanlı diferansiyel gen ekspresyon analiz aracı ve ArrayExpress) yapılan aramalar, analiz sırasında replikasyon kohortu olarak hizmet edebilecek, benzer tasarım ve platforma sahip bağımsız bir IBS-C rektal mukoza transkriptom veri seti tespit edememiştir. Bağımsız transkriptomik replikasyonun eksikliği temel bir kısıtlamadır ve bu makaledeki hiçbir ifade, tek veri setinden elde edilen bulguların dış doğrulama olarak yorumlanmamalıdır. Veri seti, neredeyse evrensel bir diferansiyel ekspresyon (genlerin yaklaşık %94,5'i anlamlıdır ve bunların büyük çoğunluğu downregüle olmuştur) göstermektedir; bu özellik, geleneksel zenginleştirme istatistiklerini bilgisiz kılmakta ve genomik arka plana kıyasla hedef gen downregülasyonunun özgünlüğü hakkında sonuçlar çıkarılmasını engellemektedir; bu nedenle örtüşme, istatistiksel zenginleştirmeden ziyade tanımlayıcı bir yönelimsel model olarak rapor edilmiştir. Bulk mukoza transkriptomiği, gerçek gen regülasyonunu hücre kompozisyonundaki değişikliklerden ayıramaz. mRNA ekspresyonu, protein bolluğunu veya fonksiyonel yanıtı belirlemez. Hedef tahmin veritabanları anotasyon yanlılığından etkilenmekte; docking, MD ve MM-PBSA sonuçları ise kuvvet alanı seçimine, ligand parametrizasyonuna, başlangıç pozisyonuna, simülasyon süresine ve örneklemenin yeterliliğine bağlıdır. CHARMM uyumlu ligand parametrizasyon servisi, CHARMM-GUI ve istatistiksel hesaplama ortamı dahil olmak üzere bazı web sunucusu ve paket bileşenlerinin kesin minor/build tanımlayıcıları

paket yapıları ve moleküler mekanik/sürekli-çözücü bağlanma enerjisi hesaplama aracı alt versiyonları, arşivlenmiş proje kaydından tam olarak geri getirilemedi ve ayrı Malzemeler Tablosunda belirtildiği şekilde raporlanmalıdır. MM-PBSA değerleri göreceli tahminlerdir, açık bir konfigürasyonel entropi terimi içermezler ve deneysel afiniteler olarak yorumlanmamalıdırlar. Çalışma metabolomik verilerden yoksundur ve ligand mevcudiyetinin IBS-C'de değişip değişmediğini veya gözlenen ekspresyon değişikliklerinin nedenler, sonuçlar, kompanse edici yanıtlar veya ilgisiz korelasyonlar olup olmadığını belirleyemez.

Bu yöntemin gelecekteki uygulamaları; bağımsız transkriptomik replikasyon, Kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) ve protein düzeyinde doğrulama, tek hücre veya mekansal transkriptomik ile hücre tipi lokalizasyonu, ilgili metabolit sınıflarının metabolomik profillenmesi ve hastadan türetilmiş kolonoidler, mukoza eksplantları veya benzer modellerde fonksiyonel ligand-yanıt analizlerini içermelidir. Diyare baskın IBS, mikst IBS, inflamatuar bağırsak hastalığı ve IBS dışı konstipasyon kohortları ile yapılan karşılaştırmalar^1,2 hastalık spesifikliğinin belirlenmesine yardımcı olacaktır. Yapısal bileşen için ise; MD yörüngelerinin tekrarlanması, alternatif başlangıç pozlarıyla hassasiyet analizlerinin yürütülmesi ile topoloji, yörüngeler ve MM-PBSA girdi ve çıktı dosyalarının depolanmasının tam olarak belgelenmesi tekrarlanabilirliği daha da güçlendirecektir. Önceliklendirilen komplekslerin fonksiyonel olarak ilgili olup olmadığını belirlemek için deneysel ligand-yanıt analizleri gereklilik arz etmektedir; mevcut sonuçlar klinik veya terapötik iddiaları desteklememektedir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
AutoDock Vina	Scripps Research / açık kaynak	v1.2.7; https://vina.scripps.edu/	Metabolit ligandların hedef proteinlere moleküler kenetlenmesi.
CGenFF/ParamChem	SilcsBio / Maryland Üniversitesi	v4.6; https://cgenff.com/	Moleküler dinamikler için ligand kuvvet alanı parametreizasyonu.
CHARMM36m kuvvet alanı	CHARMM geliştiricileri / açık kaynak	CHARMM36m; https://www.charmm.org/charmm/resources/charmm-force-fields/	Moleküler dinamik simülasyonları için kullanılan protein kuvvet alanı.
CHARMM-GUI Membran Oluşturucu	CHARMM-GUI / Lehigh Üniversitesi	Web sunucusu; kesin sürüm belirlenemedi; https://www.charmm-gui.org/?doc=input/membrane	Açık POPC membran sisteminin kurulumu ve dengeleme ayarları.
Discovery Studio Visualizer	BIOVIA (Dassault Systèmes)	2021; https://discover.3ds.com/discovery-studio-visualizer-download	İki boyutlu ligand-kalıntı etkileşim analizi.
GEO2R	NCBI Gene Expression Omnibus	Web aracı; Ocak-Mayıs 2026 arası erişildi; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/	GSE36701'in diferansiyel ekspresyon analizi.
GeneCards	Weizmann Bilim Enstitüsü	Web veritabanı; Ocak-Mayıs 2026 arası erişildi; https://www.genecards.org/	Hedef standartlaştırması sırasında gen sembolü ve gen bilgisi doğrulaması.
gmx_MMPBSA	Açık kaynak (Valdés-Tresanco ve ark.)	1.5.x; https://valdes-tresanco-ms.github.io/gmx_MMPBSA/	MM-PBSA bağlanma serbest enerjisi tahmini ve kalıntı bazlı ayrıştırma.
GROMACS	GROMACS geliştirme ekibi / açık kaynak	2024.2; https://www.gromacs.org/	Moleküler dinamik simülasyon motoru.
GSE36701 transkriptomik veri seti	NCBI Gene Expression Omnibus	GSE36701; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE36701	Genel IBS-C rektal mukoza ekspresyon veri seti.
Open Babel	Açık kaynak	3.2.0; https://openbabel.org/	Kimyasal dosya formatı dönüştürme, üç boyutlu ligand oluşturma ve ligand hazırlama.
OPM veritabanı	Michigan Üniversitesi	Web veritabanı; Ocak-Mayıs 2026 arası erişildi; https://opm.phar.umich.edu/	HTR2A'yı hizalamak için kullanılan Membranlardaki Proteinlerin Oryantasyonu koordinatları.
ParmEd	ParmEd geliştiricileri / açık kaynak	4.x; https://parmed.github.io/ParmEd/html/index.html	Hidrojen kütle yeniden dağılımı ve moleküler simülasyon topolojisi işleme.
PyMOL	Schrödinger / açık kaynak	2.x; https://www.pymol.org/	Üç boyutlu yapısal görselleştirme ve reseptör-ligand şekilleri.
RCSB Protein Veri Bankası	RCSB PDB	Web veritabanı; Ocak-Mayıs 2026 arası erişildi; https://www.rcsb.org/	Deneysel protein yapılarının ve PDB koordinatlarının kaynağı.
STITCH	STITCH konsorsiyumu (EMBL)	v5.0; https://stitch.embl.de/	Kimyasal-protein etkileşim hedef tahmini.
STRING	STRING Konsorsiyumu / ELIXIR	v12.0; https://version-12-0.string-db.org/	Protein-protein etkileşim ağı oluşturma ve yol zenginleştirme.
SwissADME	SIB İsviçre Biyoenformatik Enstitüsü / Lozan Üniversitesi	Web aracı; Ocak-Mayıs 2026 arası erişildi; https://www.swissadme.ch/	Kemoinformatik tanımlayıcılar, farmakokinetik tahminler ve PAINS değerlendirmesi.
SwissTargetPrediction	SIB İsviçre Biyoenformatik Enstitüsü / Lozan Üniversitesi	Web aracı; Ocak-Mayıs 2026 arası erişildi; https://www.swisstargetprediction.ch/	İnsan protein hedeflerinin ligand tabanlı tahmini.
UniProt ID Eşleştirme	UniProt Konsorsiyumu	Web servisi; Ocak-Mayıs 2026 arası erişildi; https://www.uniprot.org/id-mapping	Protein tanımlayıcılarının standartlaştırılmış HGNC onaylı gen sembolleriyle eşleştirilmesi.
NVIDIA RTX 3080	NVIDIA Corporation	RTX 3080; ≥8 GB VRAM; CUDA/sürücü sürümü makalede belirtilmemiştir	Moleküler dinamik simülasyonları için kullanılan CUDA destekli grafik işlem birimi.
CUDA uyumlu GPU	NVIDIA Corporation	CUDA araç kiti sürümü makalede belirtilmemiştir; ≥8 GB VRAM	≥8 GB VRAM'e sahip CUDA destekli GPU; iş istasyonu ayrıca ≥32 GB RAM ve 6 çekirdekli bir CPU gerektirmiştir.
Ubuntu Linux	Canonical Ltd. / açık kaynak	22.04 LTS	64-bit Linux işletim sistemi.
Python 3.9	Python Yazılım Vakfı	3.9	İş akışı betikleme ve analizleri için kullanılan genel amaçlı programlama ortamı.
Gen Ekspresyon Omnibusu (GEO)	NCBI / ABD Ulusal Tıp Kütüphanesi	Genel web deposu; makalede yazılım sürümü belirtilmemiştir	Genel fonksiyonel genomik veri deposu.
AutoDockTools/MGLTools	Moleküler Grafik Laboratuvarı, Scripps Research	1.5.7	Moleküler yapı ve kenetlenme girdi hazırlama araç kiti.
GROMACS analiz araçları	GROMACS geliştirme ekibi / açık kaynak	2024.2	Moleküler dinamik yörünge analiz araçları.
CHARMM-GUI altı adımlı protokol	CHARMM-GUI / Lehigh Üniversitesi	Web protokolü; kesin sürüm belirlenemedi	Web tabanlı çok aşamalı moleküler sistem hazırlama ve dengeleme iş akışı.
cgenff_charmm2gmx_py3.py	Açık kaynaklı dönüştürme betiği; kaynak makalede belirtilmemiştir	Sürüm makalede belirtilmemiştir	Kuvvet alanı topolojisi dönüştürme betiği.
Python	Python Yazılım Vakfı	3.9	Genel amaçlı programlama ortamı.
SciPy	SciPy topluluğu / açık kaynak	Sürüm makalede belirtilmemiştir	Bilimsel hesaplama kütüphanesi.
scipy.stats.fisher_exact	SciPy topluluğu / açık kaynak	SciPy sürümü makalede belirtilmemiştir	Fisher’s kesin test uygulaması.
R	R İstatistiksel Hesaplama Vakfı	4.3.x	İstatistiksel hesaplama ortamı.
Bioconductor	Bioconductor projesi / açık kaynak	3.18	Biyoenformatik yazılım çerçevesi.
limma	Bioconductor projesi / açık kaynak	Sürüm makalede belirtilmemiştir	Diferansiyel gen ekspresyon analizi paketi.
Benjamini–Hochberg prosedürü	İstatistiksel yöntem	Uygulanamaz (istatistiksel prosedür)	Yanlış keşif oranı düzeltme yöntemi.
NVIDIA RTX 3080	NVIDIA Corporation	RTX 3080; ≥8 GB VRAM; CUDA/sürücü sürümü makalede belirtilmemiştir	En az 8 GB video belleğine sahip grafik işlem birimi.
CUDA uyumlu GPU	NVIDIA Corporation	CUDA araç kiti sürümü makalede belirtilmemiştir; ≥8 GB VRAM	Genel amaçlı paralel hesaplamayı destekleyen grafik işlem birimi.
Ubuntu Linux 22.04 LTS	Canonical Ltd. / açık kaynak	22.04 LTS	64-bit Linux işletim sistemi.
TIP3P	CHARMM kuvvet alanı geliştiricileri / açık kaynak	TIP3P; uygulanabilir yazılım sürümü yoktur	Üç bölgeli açık su modeli.
MM/PBSA	gmx_MMPBSA geliştiricileri / açık kaynak	gmx_MMPBSA 1.5.x	Moleküler mekanik/Poisson–Boltzmann yüzey alanı bağlanma enerjisi yöntemi.