Zebra balığı Embriyolar mRNA ve morfolino Antisens Oligonükleotidler Mikroenjeksiyon.

Bu prosedür, morpho ve in vitro transkribe edilmiş cap mRNA'nın hazırlanmasıyla başlar. Morpho içeren çözelti sifonlanarak bir mikro pipete doldurulur ve ardından enjeksiyon hacmi, mikrometreli tek hücreli bir sahne kullanılarak kalibre edilir. Daha sonra Zebrafish embriyoları toplanır ve vitellus mikro enjeksiyonları için bir mikroenjeksiyon haznesine yerleştirilir.

Çalışma çözeltisi, hücrenin hemen altındaki yumurta sarısına enjekte edilir ve çözeltiyi hücre mikroenjeksiyonları için taşımak amacıyla sitoplazmik hareketlerden yararlanılır. Enjeksiyonları takiben çözeltiyi hücre sitoplazmasına enjekte edin. Embriyoları E3 ortamında 28,5 °C'de inkübe edin ve sonraki evrelerde ilgilenilen fenotipler açısından değerlendirin.

Merhaba, ben laboratuvardan Shiloh Yuen; Dr. Sasha'nın oğlu ve Yale Üniversitesi Tıp Fakültesi Genetik Bölümü'ndenim. Bugün, zebrafishlerde mRNA aşırı ekspresyonu ve morfo oligonükleotid gen susturma çalışmaları yürütmek için kullanılan güçlü bir mikroenjeksiyon tekniğini göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, kistik böbrek hastalıklarında primer siliumun rolünü incelemek için kullanmaktayız.

Hadi başlayalım. Gen fonksiyonu çalışmaları için güçlü bir yaklaşım, in vitro transkribe edilmiş kaplı RNA'nın zebra balığı embriyolarına mikroenjeksiyonla verilmesidir. Bu gösterimde, EGFP etiketli bir transkripti mikroenjekte edeceğiz ve başarılı bir enjeksiyonun görünür çıktısı olarak canlı tüm embriyo GFP ekspresyonunu kullanacağız.

İlk olarak, ilgilendiğiniz transkript üzerinde bir in vitro cap RNA transkripsiyon reaksiyonu gerçekleştireceğiz. Laboratuvarımızda, rutin olarak ilgilenilen cDNA'yı pCS2+ vektörüne insert ediyoruz ve M message mMachine SP6 kiti kullanarak yüksek miktarlarda capped RNA'nın in vitro sentez reaksiyonunu gerçekleştiriyoruz. Ardından, RNA örneğini RNeasy Mini Kit ile veya fenol kloroform ekstraksiyonu ve izopropanol çöktürme yoluyla saflaştıracağız.

RNA preparatının konsantrasyonunu dikkatle belirleyin ve enjeksiyon gününde kullanıma hazır olana kadar -80 °C'de saklayın. RNA örneğini çözdürün, hafifçe vorteksleyin ve kısaca santrifüjle çöktürün. Şimdi, steril su ile 0,025 ila 0,05% fenol kırmızısı son konsantrasyonuna sahip bir çalışma çözeltisi hazırlayın; fenol kırmızısı, çözeltinin embriyoya enjeksiyonu için görünür bir belirteç görevi görür.

Burada, 0,05% fenol kırmızısı içeren, mikrolitre başına 100 nanogram EGFP mRNA'dan oluşan bir çalışma çözeltisi hazırlayacağız. Son olarak, çalışma örneğini buz üzerinde tutun ve RNA stokunu -80 °C'ye geri koyun. Bu örneği enjekte etmeye hazır olduğunuzda morfo hazırlama aşamasına geçin.

Morino antisense oligonükleotidleri, hedef bir proteinin translasyonunu engelleyerek veya pre-mRNA splicing'ini değiştirerek gen ekspresyonunu modifiye etmek için yaygın olarak kullanılır. Zebra balığında morpholunolar, gen fonksiyonunu baskılayarak güçlü bir ters genetik araç görevi görür. Burada, pkd2'nin translasyonel başlama bölgesini hedefleyen bir morph oligo mikroenjeksiyonu gerçekleştireceğiz. Gene Tools LLC'den temin edilen ve ilgilenilen bir gen için özel olarak tasarlanmış 300 µM morph oligo'yu rutin olarak kullanmaktayız.

Ardından, 3 mM stok çözelti hazırlamak için 100 µL steril su ekliyoruz; ardından çözeltiyi alikotlara ayırıp enjeksiyon gününe kadar -20 °C'de saklıyoruz. Morino çözeltisini 65 °C'de beş dakika boyunca ısıtıyoruz. Sonrasında çözeltiyi hemen buz üzerinde şok soğutma işlemine tabi tutup kısa süreli santrifüj ediyoruz; bu adım, oligodaki tüm sekonder yapıları denatüre eder ve çözeltinin tamamen çözünmesini sağlar.

Ardından, Morpho çözeltisini steril su ve 0.025 ile 0.05% arası nihai konsantrasyonunda fenol kırmızısı ile seyrelterek bir çalışma çözeltisi hazırlayacağız. Bu demonstrasyonda, 0.05% fenol kırmızısı içeren 0.5 millimolar PKD two morino çalışma çözeltisi hazırlayacağız. Çalışma çözeltisini oda sıcaklığında tutun ve bu örneği enjekte etmeye hazır olduğunuzda mikro pipet doldurma işlemine geçin.

Başlamak için, enjeksiyonlarda kullanılacak mikro pipetleri hazırlamamız gerekecek. Bu işlem, BOS silikat cam kapiler tüplerin bir mikro pipet çekici cihazda ısıtılarak çekilmesiyle gerçekleştirilir. İğneler çekildikten sonra, küçük bir miktar kil veya yapışkan bant üzerine yerleştirilmiş bir Petri kabında saklanırlar.

Ardından, kama şeklinde oluklarla kalıplanmış üç adet XE orta boy plakaya %1,5 agar dökerek mikroenjeksiyon hazne plakalarını hazırlayacağız. Bu, enjeksiyon sırasında embriyoları tutmak için kolay bir yöntem sağlayacaktır. Agar hazne plakalarının katılaşmasına izin verilir ve kullanılmaya hazır olana kadar 4 °C'de saklanır.

Mikropipet doldurma işlemine başlamak için distal ucu, bir diseksiyon mikroskobunun 50 x büyütmesinde sadece görünür olacak bir açıklık oluşturacak şekilde pens veya cerrahi jiletle kesin. Ardından, iki µL çalışma çözeltisi yerleştirin.

Bir lamel üzerine damlatılmış örneğe uygulamak için, bir mikropipetin arka kısmını, hipodermik iğne uçlu boru düzeneğine sahip beş mililitrelik bir şırıngaya bağlayın ve mikropipetin distal ucunu çalışma çözeltisi damgasının içine hafifçe daldırın. Mikropipetin ucunu kırmamaya dikkat edin. Şırınganın pistonunu geri çekerek çalışma çözeltisini mikropipetin distal ucundan sifonlayın.

Ardından, mikropipet enjeksiyon hacmini kalibre edeceğiz. Bir mikrometre lamı üzerine bir damla mineral yağ yerleştirin ve basınçlı darbe mikro enjektör düzeneğinin güç ve hava kaynağını açın. Sonrasında, mikropipeti mikro enjektör düzeneğinin mikropipet tutucusuna takın.

Mikro enjektör basınç düzenlemelidir ve boşaltma işlemi diseksiyon mikroskobunun altındaki ayak pedalına basılarak aktifleştirilir. Çalışma çözeltinizden bir damlayı mikrometre yağı üzerine yerleştirmek için mikro enjektörü kullanarak enjeksiyon hacmini test edin. Yağın üzerinde bir küre şeklinde yüzen damlanın çapını ölçün.

Enjeksiyon hacmini dikkatle kalibre etmek için enjeksiyon süresini ve basıncını ayarlayın. Bu adım, mikroenjeksiyon deneyinin tekrarlanabilirliğine yardımcı olur. Bu gösterimde, tüm mikroenjeksiyonlar 0.15 milimetre damla çapı ile gerçekleştirilecektir.

Son olarak, enjeksiyon hacminiz kalibre edildikten sonra, mikro pipetin geri dolmasını ve sızdırmasını önlemek için mikro enjektördeki tutma düğmesini (hold knob) kullanın. Şimdi zebrafish embriyolarını hazırlama zamanı. Zebrafishler rastgele çiftleşirler; hazırlığa başlamak için her sabahın ilk birkaç saatinde, tek hücre aşamasındaki embriyoları toplayın ve onları XE three ortamına yerleştirin.

Üç mililitrelik bir transfer pipeti kullanarak embriyoları mikroenjeksiyon odası plakalarındaki kama şeklindeki oluklar boyunca yerleştirin. Embriyoların tamamen gömülmeden, sığ bir şekilde su altında kalması için ortamı uzaklaştırın. Bu adım, embriyoların olukların dibine çökmesine ve mikro pipetin koriyona nüfuz etmesine yardımcı olur.

Şimdi enjeksiyonlara başlayacağız. Öncelikle, tek hücreli evredeki embriyonun sitoplazması diseksiyon mikroskobu altında görünür hale gelene kadar embriyoları mikro pipet ile manipüle edeceğiz. Mikro pipetin ucunu kırmamaya dikkat ederek, embriyoya enjeksiyon yapabilmek için mikro pipetle önce koriyona, ardından vitellusa nüfuz edin.

Bu gösterimde, önce hücrenin hemen altındaki vitelluse mikroenjeksiyon yapacak ve sitoplazmik difüzyonun çalışma çözeltisini hücre içine taşımasına izin vereceğiz. Bu akış, çalışma çözeltisine eklenen fenol kırmızısı sayesinde görünür hale gelir. Bu tek hücreli bir embriyo olduğu için, enjeksiyon serbest elle veya bir manipülatör yardımıyla yapılabilir.

Hücre sitoplazmasına yapılan doğrudan enjeksiyonu da göstereceğiz. Hücreye doğrudan mikroenjeksiyon daha sağlam bir yöntemdir, ancak embriyonun doğru yönlendirilmesi ve mikroenjeksiyon tekniği gerektiğinden zaman alıcıdır. Hücre membranı, vitellus membranından daha dirençli olduğu için, hücreye ulaşmak amacıyla mikropipeti vitellus üzerinden geçirmek genellikle daha hızlıdır.

Sitoplazmanın hayvan kutbunu oluğun altına doğru yönlendirmesi ve ellerin sabit tutulması, bu enjeksiyon yöntemine yardımcı olabilir. Mikroenjeksiyondan sonra embriyoları E three ortamı içeren bir Petri kabına yerleştirin ve normal gelişim için 28,5 °C'de inkübe edin. Embriyo gelişiminin sonraki birkaç saati ve günü boyunca, embriyoları ilgilendiğiniz fenotipler açısından gözlemleyin.

Mikroenjeksiyonun başarısını doğrulamak için, kalkan evresinden itibaren gelişmekte olan embriyolardaki GFP ekspresyonunu in vivo tüm embriyo floresan mikroskopisi ile takip edeceğiz; konstrüktün ekspresyonu embriyonik gelişimin erken evrelerinde en güçlüdür ve gelişme sırasında genellikle azalır. Bu durum, enjekte edilen kapaklı RNA'nın kademeli olarak degrade olmasına ve eksprese edilen proteinin stabilitesine bağlıdır. Daha önce yayınlanmış sonuçlara dayanarak, PKD2 morfantlarının, PKD2 mutant zebra balıklarında görülen dorsal vücut ekseni eğriliğini taklit etmesini ve döllenmeden yaklaşık iki ila üç gün sonra böbrek kistleri sergilemesini bekliyoruz.

Zebrafish modellerinde mRNA aşırı ifadesi ve morfo oligonükleotid gen susturma çalışmaları gerçekleştirmek için kullanılan güçlü bir mikroenjeksiyon tekniğini sizlere göstermiş olduk; bu prosedürü uygularken sabit bir elle enjeksiyon yapmanın önemli olduğunu unutmayın. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.