Ölçme Caenorhabditis elegans Katı Medya Ömrü

C. elegans'ta yaşam süresini ölçmek için, zamanlanmış yumurta döşeme yöntemi kullanılarak yaşları senkronize edilmiş bir popülasyon oluşturulur. Aktif yetişkin hermafrodit solucanlar, UV ile öldürülmüş E. coli ekilmiş nematod büyüme medyumu (NGM) plaklarına aktarılarak altı ila sekiz saat boyunca yumurta bırakmalarına izin verilir ve ardından sonraki iki gün içinde uzaklaştırılır; solucanlar bu yumurtalardan çıkarak L4 larva evresine kadar büyür. L4 solucanları, canlı bakteri kontaminasyonunu önlemek için ampisilin ve üremeyi önlemek için FUDR içeren yeni NGM plaklarına aktarılır ve yetişkinliğe ulaşmaları sağlanır.

Bu noktadan itibaren, tüm solucanlar ölene kadar yetişkin solucanlar her iki ila üç günde bir gözlemlenir. Her zaman noktasında, ölü solucanlar plakadan uzaklaştırılır ve canlı ile ölü solucan sayıları kaydedilir. Ben George Seton, Washington Üniversitesi Patoloji Bölümü'ndeki Matt Capline laboratuvarındanım.

Bugün size yaşam süresinin nasıl ölçüleceğini göstereceğiz ve hepatitis elegance modelimizi inceleyeceğiz. Yaşlanmanın genetiğini araştırmak için laboratuvarımızda bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Temel bir yaşam süresi deneyi iki tip plak gerektirir: herhangi bir katkı maddesi içermeyen standart NGM plakları ve NGM'ye hem ampicillin hem de fluoro deoxy uridine eklenmiş olan AMP FUDR plakları. Her iki plak tipi de, daha sonra uv maruziyeti ile öldürülen e coli OP 50 bakterileri ile ekilmiştir. 10 milliliters NGM çözeltisi hazırlayarak başlayın.

60 milimetrelik Petri kabı başına, katı NGM'yi mikrodalga fırında yüksek ayarda 32 saniyelik darbelerle tamamen eritin. Basınçlı gaz kabarcıklarının birikmesini önlemek için darbeler arasında medyayı çalkalayın; ardından sıvı NGM'yi 55 derece Celsius'luk bir su banyosuna veya tezgah üzerine yerleştirerek medyanın soğumasını sağlayın. Medya, cam kabı çıplak ellerle rahatça tutabileceğiniz 55 derece Celsius'ya soğuduğunda, ilaç ekleme işlemi için hazır hale gelmiş olacaktır.

İlaç içeren plakları dökmek için, 100 mL NGM başına 33 µL 150 mM FUDR ve 100 µL 100 mg/mL ampicillin ekleyin ve karıştırmak için dairesel hareketlerle sallayın; ampicillin yabancı bakteri kontaminasyonunu önlemek, FUDR ise yumurtaların açılmasını engellemek için kullanılır. Böylece solucanların, büyüyen larvalardan ayrılmaları için birkaç günde bir transfer edilmelerine gerek kalmayacaktır.

Şimdi besiyerini dökün ve plakaların tezgah üzerinde iki gün boyunca kurumasına izin verin; plakaların kuruması tamamlanmadan bir gün önce, LB agar üzerindeki taze bir ekimden tek bir E. coli OP50 bakteri kolonisi ile sıvı LB kültürünü ekimleyin. 60 mm'lik plaka başına en az 0.5 mL kültür hazırlayın.

OP 50 kültürünü 37 °C'lik bir çalkalayıcıya yerleştirin ve bakterilerin gece boyunca büyümesini sağlayın. Ertesi gün OP 50 bakterilerini 3,500 g santrifüj kuvvetinde 10 dakika boyunca çöktürün. Bakterileri 10 x konsantrasyonda yeniden süspande etmek için süpernatantın yeterli bir kısmını dökün.

Şimdi her plakaya 100 µL konsantre kültür inoküle edin. Pipet ucunun NGM yüzeyine temas etmesinden kaçının; çünkü besiyeri yüzeyindeki kusurlar solucanların içeri girmesine neden olur. Bakteriler, plaka duvarlarına yaklaşmadan NGM'nin orta alanını kaplayana kadar plakaları dairesel hareketlerle sallayın ve plakaları kurumaları için tezgah üzerinde 24 saat bekletin. Kuruduktan sonra, plakaların yüzeyini bakteriyel büyümeyi durduracak kadar güçlü bir UV dozuna maruz bırakın; biz strata gene UV straddle linker 2, 400 kullanıyoruz.

Plakaları kapakları açık şekilde straddle linker'a yerleştirerek başlayın. Şimdi energy düğmesine basın. Tuş takımından 9 9 9 9 girin ve start düğmesine basın.

Plakalar yaklaşık beş dakika boyunca UV ışınlarına maruz bırakılacaktır. UV ile bakterileri öldürülmüş plakalar, dört santigrat derecede ters çevrilmiş halde bir aya kadar saklanabilir. Bu bölüm, ortak bir çıkış tarihine sahip solucan popülasyonunun nasıl oluşturulacağını açıklamaktadır.

Yaklaşık 20 genç yetişkin solucanı, ilaç içermeyen taze bir NGM plakasına aktararak başlayın. Solucanların çoğalması ve bir hafta içinde tüm bakteriyel besini tüketmesi için plağı yaklaşık bir hafta boyunca 25 °C'de bekletin. Büyümesi duraklamış dower evresinde yeni çıkmış solucanlar görüldüğünde, 20 ila 30 dower larvayı ilaç içermeyen taze bir NGM plakasına aktarın ve besin varlığında 25 °C'de inkübe edin.

Dower larvalar iki gün içinde reprodüktif olarak aktif yetişkinlere dönüşecek ve sonrasındaki birkaç gün boyunca reprodüktif olarak aktif kalacaktır. Şimdi, reprodüktif olarak aktif yetişkinlerden 10 ila 15 tanesini ilaç içermeyen taze bir NGM plakasına aktarın. Bu plaka, zamanlanmış yumurtlama veya TEL plakası olarak adlandırılır.

Solucanların yumurta bırakabilmesi için TEL plağını 25 °C'de bırakın. Bu yumurtalardan çıkan hayvanlar deney hayvanları olacak ve yaşam süreleri altı saat sonra değerlendirilecektir. TEL plağında yumurta olup olmadığını kontrol edin.

Henüz yeterli yumurta yoksa, TEL plağını toplam 24 saate kadar 25 °C'de bekletin. Yumurtaları periyodik olarak kontrol edin. Yeterli sayıda yumurta bırakıldığında, yetişkinleri TEL plağından çıkarın.

Tipik bir yaşam süresi deneyi, deneysel grup başına 30 ila 90 yumurta gerektirecektir, ancak tek bir TEL plakasında birkaç yüz yumurta üretilebilir. Üreme açısından aktif 10 ila 15 yetişkin tarafından altı ila sekiz saat içinde yaklaşık 150 yumurta bırakılacaktır. Deneysel gruplar karşılaştırılırken, büyük yaşam süresi farklılıkları için 30 hayvan kadar az bir sayı ile istatistiksel anlamlılığa ulaşılabilir.

Daha mütevazı farkları ayırt edebilmek için daha fazla hayvan kullanılmalıdır. Şimdi, yumurtalar çatlayana ve solucanlar L4 larva evresine gelene kadar, yetişkinlerin olmadığı TEL plağını 20 °C'de bekletin. Bu süreç vahşi tip C. elegans için genellikle iki gün sürer, ancak yavaş gelişme fenotipli suşlar için daha uzun sürebilir.

Bu bölüm, yaş senkronizasyonu yapılmış bir popülasyonun yaşam döngüsünün nasıl takip edileceğini açıklamaktadır. İlk olarak, L4 larvalarını TEL plakadan, önceden hazırlanmış AMP FUDR plakalara aktarın. Test edilen her suş veya koşul için, plaka başına 25 ila 30 solucan olacak şekilde iki ila üç plaka hazırlamak genel uygulamadır.

AMP FUDR plaklarını 20 °C'de 24 saat boyunca inkübe edin. Ardından solucanları, medyumu ve bakterileri görsel olarak değerlendirip solucanları taze AMP FUDR plaklarına aktarın. Solucanlar bakteriyel besinin çoğunu tüketmişse, bu işlem genellikle haftada bir veya iki kez gerçekleştirilir.

Deneyin erken aşamalarında, önemli sayıda larva görülmesi genellikle solucanların L4 evresi yerine genç yetişkinler olarak AMP FUDR plakalarına aktarıldığını gösterir. Genç yetişkinler, FUDR etki göstermeden önce yumurta bırakabilir ve zaman zaman larvalar FUDR'nin etkilerinden kurtularak yetişkinlere dönüşebilir. Bu larvalar deneyi yanıltacaktır; böyle bir durumda, yetişkin solucanları taze plakalara aktarın ve larva içeren eski plakaları atın.

Canlı ve büyüyen bakteriler gözlemlenirse, solucanlar taze plakalara aktarılmalıdır. Genellikle AMP ve UV öldürme kombinasyonu, deneye canlı bakteri bulaşmamasını sağlar, ancak bu durum nadiren gerçekleşebilir. Ayrıca, solucanları aktarın.

Besiyerinde mantar büyümesi gözlemlenirse; yeterince erken fark edildiğinde, mantar bir pipet ucu veya spatula kullanılarak kesilip alınabilir. Çapı birkaç milimetreden daha büyük hale geldiğinde, solucanları yeni bir plakaya aktarmak genellikle daha kolaydır.

Her iki ila üç günde bir tüm solucanların yaşam süresini puanlayın. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak her bir solucanın canlı mı yoksa ölü mü olduğunu belirleyin.

Plakaya hafifçe vurun. Solucan, vurma işlemine yanıt olarak hareket ediyorsa canlıdır. Solucan plakaya vurulmasına yanıt vermezse, baş bölgesine yakınlaşın ve platin transfer iğnesi ile solucanın başına hafifçe vurun.

Solucanı ölü olarak işaretleyin. Kafasını hareket ettirerek yanıt vermiyorsa, ölü solucanı plakadan çıkarın. Tüm solucanlar kontrol edildikten sonra, tarihi ve canlı ile ölü solucan sayılarını kaydedin.

Katı besiyerinde tutulan solucanlar, ara ara kazarak veya duvarlara tırmanarak plak yüzeyinden kaçabilirler. Kaçan solucanlar çalışmadan tamamen hariç tutulur. İşlem tamamlandığında, plakları 20 degrees Celsius inkübatöre geri yerleştirin.

İki ila üç gün daha bekleyin ve ardından plakaları tekrar kontrol edin. Tüm solucanlar ölene kadar bu rejime devam edin. Her gün ölen solucan sayısı, genellikle her gün hayatta kalan solucanların oranını hesaplamak için tersine çevrilir; bu veriler, zamanlanmış yumurta bırakma günü dikkate alınarak bir sağkalım eğrisi olarak grafiksel olarak çizilir.

Sıfırıncı gün. 20 santigrat derecede UV ile bakterilerin öldürüldüğü ortamda tutulan *C. elegans* vahşi tip suşu için yumurtadan itibaren ölçülen tipik medyan yaşam süresi yaklaşık 25 gündür.

Size yaşam süresinin nasıl ölçüleceğini ve zarafetin nasıl gözlemleneceğini göstermiş olduk. Bu temel prosedürü, destekleyici metinde tartışılan diyet kısıtlaması ve RNA interferansı dahil olmak üzere çeşitli çevresel koşulları test etmek için modifiye edebilirsiniz. Şimdilik bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkür eder, deneyinizde başarılar dileriz.