Odak Ca ^{2 + Geçici Algılama}

İlk olarak, bir kalsiyum yükleme solüsyonu hazırlanır, ısıtılır ve havalandırılır. İdrar kesesi diseke edilerek çıkarılır, açılır, düz bir şekilde iğnelenir ve detrusor kasından bir şerit alınır. Detrusor şeridi yükleme solüsyonuna eklenir, inkübe edilir, durulanır ve düz bir şekilde iğnelenir.

Doku içindeki kalsiyum tabanı dört, lazer ışığı ile uyarılır ve yayılan ışık yakalanarak sonuçlar kaydedilir. Tekil karelerden oluşan filmler, ardışık kareler karşılaştırılarak analiz edilir. Arka plan çıkarılır.

Hücre kenarı eşiği, olayların nerede bulunabileceğini belirler ve birbirini takip eden beyinler arasında bir oran alınır. Kalan olaylar önceden tanımlanmış kriterlerle eşleşirse, vurgulanır ve etiketlenir. Merhaba, ben Oxford Üniversitesi Farmakoloji Bölümü'ndeki Keith Brain ve Tom Kinane laboratuvarlarından John Young.

Ben Rob Amos, ben de Brain ve Canne laboratuvarlarındayım ve benim adım da Keith Brain. Bugün John ve Rob size düz kaslarda bir kalsiyum görüntüleme tekniğini gösterecekler. Biz bunu laboratuvarımızda, otonom sinirlerden nörotransmitter salınımını ve bunun düz kas üzerindeki etkisini incelemek için kullanıyoruz.

Haydi başlayalım. Kalsiyum indikatörü organ green 488 BAFTA 1:00 AM, 50 µg toz içeren 500 µL'lik flakonlar halinde sunulur. Kalsiyum indikatörünü hazırlamak için, toza 40 µL Onic F1 27 çözeltisi ekleyin ve 30 saniye boyunca nazikçe çalkalayın; ardından 460 µL fizyolojik tuzlu solüsyon (PSS) ekleyin ve 30 saniye daha nazikçe çalkalayın.

10 µM Organ Green 488 BAFTA içeren nihai çözelti, her biri 125 µL olan dört alikot sağlar. İlgili dokunun diseksiyonundan önce çözeltiyi ışığa maruz bırakmaktan kaçının ve -20 °C'de saklayın.

Kalsiyum indikatörünü dondurucudan çıkarın ve indikatör çözünene kadar oda sıcaklığında çözdürün. Bir deney tüpüne 1 mL PSS koyun ve tüpü 33 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin. Bir hava taşı aparatını tıpa yardımıyla deney tüpüne sabitleyin veya alternatif olarak parafilm kullanın; ardından saniyede yaklaşık bir kabarcık çıkacak hızda %95 oksijen ve %5 karbondioksit karışımı ile kabarcıklama yapın.

Düz kas organını hayvandan çıkarın. Bu örnekte, bu organ farenin idrar kesesidir. Organı, yıkamak için yaklaşık 50 milimetre PSS içerisine yerleştirin; doku yıkandıktan sonra çevredeki adipöz dokuyu ve bağ dokusunu dikkatlice uzaklaştırın.

İdrar kesesi için düz kas laureate tipine göre diseksiyonla açın. Mesane boynundan, kaudal uçtan kubbe tepesine kadar boylamsal olarak açın. Kraniyal uçta, baskın kas demetleri yönünde keserek, resserin dorsal yüzeyi boyunca altı ila sekiz milimetre uzunluğunda ve bir ila iki milimetre genişliğinde dört şerit hazırlayın.

Diseke edilmiş dokuyu ve önceden ısıtılmış, havalandırılmış PSS'yi, kalsiyum indikatörünü yüklemek için 125 µL 10 µM organ green 488 B ekleyerek test tüpündeki dokuya aktarın ve karıştırmak için elle hafifçe çalkalayın. Tüpü su banyosuna geri yerleştirin. Havalandırma işlemine devam edin ve su banyosunu bir folyo tabakasıyla kapatın.

Yeterli dokunun kalsiyum indikatörünü absorbe etmesi için gereken süre, dokunun boyutuna ve düz kas tabakasının kalınlığına göre değişiklik gösterir. Örneğin, fare detrusor kası ve sıçan oks kası için bu süre 70 dakikadır. Sıçan detrusor kası ve fare VA damarları için ise inkübasyonu 120 dakika boyunca gerçekleştiriyoruz.

Doku kalsiyum indikatörü ile yüklendikten sonra mikroskopi için hazırlanabilir. İlk olarak, dokuyu 10 dakika boyunca kabarcıklı PSS ile yıkayın. Ardından, dokuyu S korumalı bir preparasyon kabına yerleştirin.

Düz bir tabaka oluşturmak için hafifçe gerin. Dokuyu, örneğin 25 ila 50 µm çapında iki milimetrelik kısa gümüş tel parçaları kullanarak sabitleyin ve pinleri belirli bir açıyla yerleştirin.

Objektifi çizebileceği için birkaç milimetreden daha uzun olan pinlerin kullanılmasından kaçının. Dokunun kendiliğinden hareket etmesini en aza indirmek ve görüntüleme için uygun bir bölgenin belirlenmesini kolaylaştırmak adına dokunun dikkatli bir şekilde sabitlenmesi önemlidir. Doku sabitlendikten sonra, preparat kabını mikroskop tablasına yerleştirin.

PSS'nin kabın sil koruyucu kaplı alanının dışına çıkmamasına dikkat edin. Bu durum, geniş bir alanın PSS ile kaplanmasına yol açabilir. Demonstrasyon amaçlı süperfüzyon başladığında, aşağıdaki adımlar ışık altında gerçekleştirilecektir.

Lütfen bu deneylerin normalde karanlıkta gerçekleştirildiğini unutmayın. Hazırlığı süperfüze etmek için pompayı çalıştırın. PSS ile genellikle saatte 100 mililitre'lik bir hız kullanılır.

Isıtıcı ünitesini açın; giriş ve çıkış tüplerini ve sıcaklık probunu, her birini tabanındaki mıknatısla metal şeride sabitleyerek hazırlık kabına yerleştirin. Çıkış tüpünün ucunun yüksekliği, PSS derinliğini belirleyecektir. Çıkışın bazen gerçekleşmediği göz önünde bulundurularak, PSS'nin gerçekten uzaklaştırıldığından emin olmak için dikkatli olun.

Başlangıçta, ısıtıcı ünitedeki sıcaklığı 33 ile 35 derece Santigrat arasında istenen sıcaklığa ulaşacak şekilde ayarlayın. Dokunun, 10 veya 20 katlık düşük güçte bir objektif ile en az 10 dakika boyunca dengelenmesine izin verin.

Düz kası görüntülemek ve izleme için uygun bir bölge belirlemek amacıyla epi-floresan mikroskobu kullanın veya mavi ışıkla uyarın. Uyarma ve aydınlatmaya maruz kalma, indikatörün fotobağlanmasına (fotobeyazlama) neden olacaktır. Bir seferde birkaç saniyeden fazla kullanmaktan kaçının.

Görüntüleme algoritmasında çok sayıda yanlış pozitifle karşılaşılabileceği için parlak yapıların bulunduğu bölgelerden kaçının. Alan içinde minimum hareketin olduğu ve çok sayıda düz kas hücresinin bulunduğu bir bölge seçmeye çalışın. Görüntülenecek bölgeyi seçtikten sonra 40 x gibi daha yüksek büyütmeli bir objektife geçiş yapın.

Düz kas hücresi veya hücreleri yatay konuma gelene kadar sahneyi veya optik ekseni döndürün. Bu konum, hızlı tarama eksenine paraleldir. Düz kas hücreleri artık konfokal mikroskopi ile görüntüleme için hazırdır.

Bu protokolde, Leica SP iki dik konfokal mikroskop kullanıyoruz. Pinhole'u tek bir airy disk boyutuna getirin. Lazer gücünü, custo optic ayarlanabilir filtre üzerinden %25 ile %35 arasında ayarlayın.

Bu değer, parlaklık ve fotobleaching arasındaki bir dengedir. Veri analizine hazırlanmak için ImageJ'i indirip kurun. Platformunuza uygun sürümü indirin ve ardından eski dosyayı değiştirmek için en güncel ImageJ jar dosyasını indirerek en son sürüme güncelleyin. Sonra, Excel writer jar dosyasını indirin ve plugins jar dizinine kurun.

Bu dosyaları eklentiler dizinine kopyalayın. Bu betiklerin her birini eklenti makrolarını kullanarak yükleyin. Image J'nin yükleme işlevini kullanın. Kullandığımız Leica SP iki konfokal mikroskobunun yazılımı Leica olarak adlandırılır.

LCS, her serinin tekil karelerini ayrı bir dosya olarak kaydeder. Seriyi yeniden oluşturmak için, yeniden oluşturulacak tüm karelerin tek bir klasörde olduğundan emin olun.

Örneğin, data folder tiffs. Ardından, plugins macros menüsünden Leica SP two stacker makrosunu seçin. Kök dizini, bu durumda data folder'ı seçin.

Açılır listeden istenen klasörü seçin. Bu durumda, tiffs için bir çıktı dizini seçin veya yeni bir tane oluşturun. Örneğin, data folder stacks.

Ardından betik, hareket kaynaklı hataları düzeltmek için tekil karelerden serileri yeniden oluşturacaktır. Bir seri içindeki kareleri hizalayan veya eşleştiren, ücretsiz olarak sunulan downloads stack, rig ve turbo reg algoritmalarını kullanıyoruz. Her birine ait dosyaları stacks klasörüne kopyalayın.

İşlenecek olan bir yığını yükleyin ve ardından ilgi alanını net bir şekilde gösteren bir kareye gidin. Diğer kareler bu referans kareye göre hizalanacaktır. Bundan sonra, pluginler (eklentiler) altındaki stacks (yığınlar) bölümüne gidin.

Yığın Kayıt. Her bölge için en etkili olanı belirlemek amacıyla farklı transformasyonların her birini deneyin. Kalsiyum geçişlerinin tespitini etkileyen görüntülenen faktörler, her bölgenin belirli özellikleri ve partikül parametreleri ölçülerek değişiklik gösterecektir.

Tespitin hassasiyeti ve özgüllüğü artırılmıştır. Bu nedenle, her bölge için oran için çıkarılmış eşik değerini ve hücre kenarı eşik değerini hesaplayacağız. Başlamak için eklentiler (plugins), makrolar (macros), yükle (install) adımlarını izleyin ve jn CTO dot oh eight release dot IJM JM dosyasını seçin. Ardından eklentiler (plugins), makrolar (macros), yığını yükle (load stack) seçeneğine gidin.

Bir seri seçin ve aşağıdaki partikül parametrelerini hesaplayın. Çıkarılmış değer için eşiği hesaplamak amacıyla, arka plan ölçümü olduğuna inandığınız bir bölge üzerinde dikdörtgen bir ilgi alanı seçin. Ortalamayı not edin. Oran için eşiği hesaplamak amacıyla, düz kas hücresinin veya hücrelerinin optik olarak düz bir alanı etrafında dikdörtgen bir ilgi alanı seçin.

Ortalamayı ve standart sapmayı ölçüp not edin. İşlemi iki kez daha tekrarlayın veya shift tuşuna basarak aynı anda üç kutu çizin. Oran için eşik değerini hesaplayıp not edin.

Standart sapmanın ortalamaya bölünmesi ve ardından sonuca 1 eklenmesi şeklinde hesaplayın, daha sonra elde edilen sonucu 32 ile çarpın. Üç tekrardan gelen değerlerin ortalaması alındığında, önceki kareyle kıyaslandığında hiçbir değişikliğin 32 tam sayı değerine karşılık geldiği oranlama algoritmasını hesaba katmak için 32 faktörü gereklidir. Bu, orandaki artış ve azalışları tespit etmek için uygun bir dinamik aralık sağlar.

Sekiz bitlik bir görüntü için, görüntü ayarlama eşiğini (image adjust threshold) seçin. Siyah ve beyazı seçin. Üst sürgü sınırının altını tanımlayın ve karşılık gelen değeri not edin.

Bu, sürgünün sağındadır. Yalnızca siyah bölgelerde meydana gelen olaylar sayılacaktır. Sıfırla'ya tıklayın.

Oran için çıkarılmış eşik değeri ve hücre kenarı eşik değeri hesaplandığına göre, artık görüntü yığınlarını analiz edebiliriz. Analiz edilecek yığınların konumunu belirleyin. Bu aşamada yalnızca bir seri seçin.

Bu ilk dosyadır ve son dosya da aynı olmalıdır. Ardından veri dosyalarının ve yığınların (stacks) çıktıları için bir konum seçin. Örneğin, veri klasörü çıktısı.

Çıkarılan eşik değeri, oran eşiği ve hücre kenarı eşiği değerlerini girin. Diğer ayarları varsayılan değerlerinde bırakın. Algoritma, işlenen serinin solda ve orijinal serinin sağda gösterildiği çift bölmeli bir pencere oluşturacaktır.

Çıktı klasöründeki bu dosyayı açın ve yalancı pozitiflerin sayısını ve gözle görülebilen olayların tespit edilemediği durumları değerlendirmek için dosyayı dikkatlice inceleyin. Algoritma, her seri için tespit edilen olayın genlik alanı ve konumu gibi özelliklerini detaylandıran bir Excel dosyası oluşturur; algoritmanın çıktı olarak verdiği görüntü dosyalarının incelenmesiyle belirlenen yalancı pozitifler, bu Excel dosyasından manuel olarak silinebilir. Ancak, bunu yaparken katı kriterlere sahip olmanız gerekir.

Bu, düz kaslardaki kalsiyum geçişinin bir videosudur. Bu örnekte video, beş hertz hızında elde edilen 100 ayrı kareden oluşmaktadır. Örneğin, belirli bir ilacın kalsiyum geçişi frekansı üzerindeki etkisini araştırırken deney başına bu videolardan birçok tane elde ederiz.

Burada, düz kas hücrelerinde çok sayıda spontan kalsiyum geçici artışı görülmektedir. Parçacık algılama algoritmasının sonucu burada gösterilmiştir. Algoritma, her seri için tespit edilen olayın genlik alanı ve konumu gibi özelliklerini detaylandıran bir Excel dosyası oluşturur.

Böylece idrar kesesi gibi düz kas organlarında kalsiyum geçişlerini görüntülemek için bir yöntem ve laboratuvarımızda geliştirdiğimiz bir algoritmayı kullanarak bu kalsiyum geçişlerini analiz etme yolunu göstermiş olduk. Hatırlanması gereken önemli hususlar, dokunun kalsiyum görüntüleme için iyi şekilde hazırlanmasıdır. Bugün gösterdiğimiz doku örneğinde bu işlem, bağ dokusunun temizlenmesini ve alanı kapatabilecek tüm yağların uzaklaştırılmasını kapsamaktadır.

Dokuyu düz bir tabaka halinde sabitlemek de önemlidir. Deneylerinizde başarılar diler, izlediğiniz için teşekkür ederiz.