Mitoz incelenmesi için Mikroenjeksiyon Teknikleri Drosophila melanogaster Sinsityal Embriyo

Bu prosedür, embriyoların taze üzüm suyu plaklarında 30 ila 60 dakika boyunca toplanmasıyla başlar. Plaka göl kafesinden çıkarıldıktan sonra, embriyolar nemlendirilmiş bir fırça ile alınır ve çift taraflı yapışkan bant üzerine yerleştirilir. Korion kırılana kadar, bir cımbızın tek ucu kullanılarak bir embriyo bant üzerinde nazikçe yuvarlanır.

Embriyoyu alın ve nazikçe kapağın üzerine yerleştirin. Üzerine bir kat sıcak silikon yapıştırıcı sürün. Yeterli sayıda embriyo elde edene kadar bu işlemi tekrarlayın.

Dehidrasyon sonrası embriyolar enjeksiyona hazırdır. Merhaba, ben California Üniversitesi Davis'teki Moleküler ve Hücresel Biyoloji Bölümü'nden Dr. Jonathan Sculley'nin laboratuvarından Ingrid Bruce Musher. Bugün size Drosophila sinsityal embriyolarına mikroenjeksiyon yapma prosedürünü göstereceğiz.

Bu prosedürü, mitozda mikro tübüllerin ve mitral tabanlı motorların rolünü incelemek için kullanıyoruz. Örneğin, spesifik mitotik proteinlerin antikorlarını veya diğer inhibitörlerini mikroenjeksiyon yoluyla aktarıyoruz. İnhibitörün mitoz üzerindeki etkisini analiz ederek, hedef proteinin işlevini belirleyebiliyoruz.

Hadi başlayalım. Hazırlıklara deneyden iki ila üç gün önce başlamak için, plastik bir şişenin karşıt kenarlarına yaklaşık bir santimetrekare boyutunda iki küçük delik açarak yumurtlama kafesini hazırlayın. Hava akışına izin verecek şekilde delikleri bir parça pamukla doldurun.

Sinekleri şişeye tıklatarak aktarın ve ardından şişeyi bir üzüm suyu plağı ile kapatın. Maya ile birlikte, bacak kafesini oda sıcaklığında tutun; sinekler deneyden en az bir gün önce başlayarak 10 güne kadar yumurta bırakacaktır. Enjeksiyon için iğneleri hazırlayın ve bunları dört derece santigrat sıcaklıkta tutun.

Deney günü, iğneleri hazırlayın ve yükleyin. İlk olarak, etiketlenmiş tubulini dondurucudan çıkarın ve beş ila 15 dakika boyunca buz üzerinde bekletin. Ardından, GPEM tamponu ile seyreltin ve daha sonra 4 °C'de 13.000 RPM'de 10 ila 15 dakika boyunca santrifüjleyin.

Son olarak, iğneye bir ila iki µL yükleyin ve dört °C'de saklayın. Bu işlem, iğne içerisinde sıcaklık kaynaklı polimerizasyonu önlemek içindir. Lamel kurulumundan önce, çift taraflı yapışkan bandı sarıp 100 mL'lik bir şişeye yerleştirerek heptan tutkalı hazırlayın.

Yaklaşık 50 mililitre heptan ekleyin, şişeyi kapatın ve birkaç gün boyunca sallayarak karıştırın. Embriyoları hazırlamadan önce, enjeksiyondan önce embriyoların yerleştirileceği birdehidratasyon odası hazırlayın. Bunun için, 100 milimetrelik bir Petri kabının içine, masa oluşturacak şekilde 35 milimetrelik bir kabın bir kısmını yerleştirin; ardından kurutucu bölgenin yüksekliği masa ve kapaktan daha yüksek olmayacak şekilde çevresine susuz kalsiyum sülfat ekleyin ve üzerini kapatın.

Embriyoların hazırlığına başlamak için, önce, her saatte bir maya içeren üzüm suyu plağını değiştirerek onları göl kafesinden toplayın; embriyolar, toplama işlemine başladıktan yaklaşık iki saat sonra görüntülenmelidir. Lamelini hazırlamak için, lameli mikroskop lamının bir tarafına yerleştirin ve hareket etmemesi için dört köşesini bantla sabitleyin. Pamuk uçlu bir aplikatör kullanarak, lamel üzerine bir hat şeklinde tek katman heptan tutkalı sürün.

Yapıştırıcı viskoz olmamalı ve birkaç saniye içinde kurumalıdır. Eğer çok kıvamlıysa, daha fazla heptan ekleyin. Son olarak, lamın üzerine, örtü camının yanına bir parça çift taraflı yapışkan bant yerleştirin.

Nemlendirilmiş bir fırça ile kaydırın. Embriyoları üzüm suyu plakası üzerinden dikkatlice alın ve lam üzerindeki çift taraflı yapışkan bandın üzerine yerleştirin. Ardından, korion yırtılana kadar embriyoları çift taraflı yapışkan bant üzerinde yuvarlamak için bir cımbız ucunu kullanın.

Embriyoyu, cımbıza yapışması için Corian üzerinde nazikçe yuvarlayarak alın ve lam üzerindeki heptan tutkalının üzerine yerleştirin. Embriyonun uzun kenarı, lamın uzun kenarına paralel olacak şekilde kaydırın. Bir sıraya 10 ila 20 embriyo yerleştirin.

Lamelliği kaldırın ve üç ila sekiz dakika boyunca kurutma haznesine yerleştirin. Süre, yerel nem oranına ve enjekte edilecek miktara bağlıdır. Ardından, lamelliği vakum gresi sürülmüş metal bir hazneye yerleştirin.

Son olarak, daha fazla dehidrasyonu önlemek için embriyoların üzerini halokarbon yağı ile kapatın. Embriyolar artık enjeksiyona hazırdır. İlk olarak, embriyoları 16 x objektif altında bulun.

Embriyoları kenara çekin ve odak düzlemini değiştirmeden iğneyi bulun. İğneyi merkezleyin ve X veya Y yönünde hareket ettirmeden yukarı taşıyın. İğneyi açmak için, lamine camın kenarını, iğnenin bulunacağı yerin dışına gelecek şekilde görüş alanına getirin.

Ve iğneyi aynı odak düzlemine indirin. Lam örtü camını, iğneye çarpıp onu nazikçe kırana kadar çok dikkatli bir şekilde hareket ettirin. İğneyi yukarı kaldırın.

Şimdi embriyoları görüş alanına getirin. İğneyi yağın içine indirin ve iğneden düzgün sıvı damlacıkları geldiğinden emin olun. Embriyoyu yavaşça iğneye doğru hareket ettirin, embriyoya bir damla enjekte edin ve ardından embriyoyu uzaklaştırın.

Tüm embriyolar enjekte edildikten sonra, 60 veya 100 x objektife sahip bir konfokal mikroskopta gözleme hazır hale gelirler. Kontrol embriyosu, bu filmdeki gibi görünmelidir. Bu, dönen disk konfokal mikroskobunda 100 x objektif ile görüntülenen, GFP tubulin ve RFP histon eksprese eden bir embriyodur.

Gösterilen toplam süre sekiz dakikadır. Kutuptan kutuba mesafe grafikleri oldukça tekrarlanabilirdir ve kontrol embriyolarında başarının güvenilir bir ölçütüdür. Bu grafikler, burada 11 ile 13. döngüler için gösterilenlere benzemelidir.

Bu videoda başka bir kontrol embriyosu gösterilmektedir. Bu embriyo KLP 61 FGFP eksprese etmekte ve r Domine tubulin ile enjekte edilmiştir. Bu örnek de spinning disc konfokal mikroskopta 100 x objektif ile görüntülenmiş olup toplam süre yedi dakikadır.

Bu video, mikroenjeksiyondan hemen sonra kaydedilmiştir ve r Domine tubulin konsantrasyonundaki gradyan videonun başında açıkça görülmektedir. Bu embriyolar, Klp 61 F antikoru mikroenjeksiyonu sonrası Klp 61 F inhibisyonunu incelemek için kullanılabilir. Klp 61 FGFP'nin iğciklerden kaybolduğunu görebiliyoruz.

Drosophila insizyonel embriyolarının nasıl mikroenjekte edildiğini az önce gösterdik. Bu prosedürü uygularken, kontrol deneylerini gerçekleştirmenin, öncelikle tek başına tampon çözelti veya rutin enjekte etme pratiği yapmanın ve mitozun hücresel aşama boyunca normal şekilde ilerlediğinden emin olmanın önemli olduğunu unutmayın. Tüm enjeksiyonlarınız güvenilir hale geldiğinde ve herhangi bir hasara yol açmadığında, bir inhibitör enjekte edebilir ve söz konusu inhibisyonun etkisini inceleyebilirsiniz.

Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.