Transplantasyon Kimerik Zebra balığı Embriyolar Yaratma

Merhaba, ben Cecilia Owens Laboratuvarı'ndan Hillary Kemp. Ben de Cecilia Owens. Hillary ve ben, Seattle'daki Fred Hutchinson Kanser Araştırma Merkezi'nin temel bilimler bölümündeyiz.

Bugün size, genetik mozaikler olarak da bilinen kimerik zebra balığı embriyoları oluşturma tekniğini göstereceğiz. Bu prosedür, gelişim sırasında gen fonksiyonunun hücresel temelini değerlendirmemize olanak tanır. Belirli bir genin, hücre otonom fonksiyonu olarak bilinen mutant fenotipe sahip hücrelerin içinde mi, yoksa hücre non-otonomisi olarak bilinen bu hücrelerin çevresinde mi işlev gördüğünü sorgulayabiliriz.

Bu mozaikleri, blastula veya erken gastrula evresindeki vahşi tip veya mutant embriyolar arasında hücre nakli yaparak oluşturuyoruz. Ardından, donör kaynaklı hücrelerin konak ortamındaki fenotip ve genotipini gözlemleyerek gen fonksiyonunu değerlendiriyoruz. Öyleyse başlayalım.

Protokolün bu bölümünde, donör kaynaklı hücrelerin kaderlerinin transplantasyon sonrası takip edilebilmesi için donör embriyosuna bir soy hattı boyası enjekte edilir. Bu teknik kullanılarak her türlü nükleik asit de enjekte edilebilir; ancak, embriyolarla çalışmaya başlamadan önce DNA enjekte ederken işaretleme adımını atlayın, bir Petri kabının en geniş kısmına 45 derecelik açıyla bir lam yerleştirerek bir enjeksiyon kabı hazırlayın. Kap, %1,2 arasos içeren pen strep embriyo medyumunun dörtte üçü kadar doldurulmalıdır.

Beveled bir oluk oluşturmak için agro setlendikten sonra lamı çıkarın. Oluğu pen strep embriyo ortamı ile doldurun. Şimdi tek hücre aşamasındaki embriyoların enzimatik dekore işlemine geçin.

Embriyoları tek hücre aşamasındayken, 0.5 mg/mL Pronase çözeltisi içinde bir ila beş dakika boyunca inkübe edin. Dekorasyonu yakından izleyin.

Korion görünür şekilde çökmeye başlar başlamaz embriyoları sistem suyuna daldırın. Bu işlemle tüm korionlar dökülür ve embriyolar beherin dibinde kalır. Embriyoların su yüzeyine bir kez daha çarpmaması gerçekten önemlidir; çoğunun korionu dökülmüş durumdadır. Dışarıda dönen ve korionları dökülmemiş birkaç tane kalmıştır.

Eğer herhangi bir embriyo hala korionu içindeyse, onları bu şekilde pipetlemek koriondan çıkmalarını sağlayacak ve embriyoların su yüzeyine hiç temas etmeden serbest kalmalarına imkan tanıyacaktır. Kaplanmış embriyoların, kenarları pürüzsüzleştirilmiş, ateşle cilalanmış bir pipetle tutulması önemlidir. Hassas dek kaplı embriyoları, geniş ağızlı ve ateşle cilalanmış bir cam pipet kullanarak nazikçe enjeksiyon kabının oluğuna aktarın.

Ardından, tek bir dosyayı bu oluğa yüklüyoruz. Embriyolar artık, hassas bir şekilde kalibre edilmiş, ateşle çekilmiş cam enjeksiyon pipeti ve bir basınçlı enjeksiyon düzeneği kullanılarak soy hattı belirteçleri ile enjekte edilmeye hazırdır. İğneyi kırmak için embriyo ortamı dolu bir kap ve iğneyi kalibre etmek için yağ dolu bir kap kullanacağız.

Bu, standart laboratuvar sınıfı normal bir mineral yağdır. Bir çift sivriltilmiş saatçi pensi alırız ve ardından uygun boyutun ne olduğunu belirlemek için okülerlerden bakarken, pensi iğnenin her iki yanına yerleştiririz ve ardından çipi nazikçe kırarız; bunu bakmadan yapmam mümkün değildir. Başlamadan önce, iletilecek boya veya ribonükleotid hacmini belirlemek gerekir.

Bolus boyutunu mineral yağı içeren bir kapta ölçün. Mikro enjektörün bir veya iki darbesiyle bir nanolitre bolus iletilecek şekilde iğne ucu kırılmalıdır. Bolus hacmi, oküler mikrometre ile ölçülen çapı üzerinden hesaplanabilir.

Kaplanmış embriyoların bir ile dört hücre evreleri arasında, %1 ila %3'lük floresan dekstran çözeltisinden bir nanolitre doğrudan vitelluse enjekte edin. Embriyoyu tam iğnenin altına yerleştireceğim. İğneyi nazikçe vitellusun merkezine batırıp ayak pedalına basacağım.

Enjeksiyon yaparken, boyanın hücrelere taşınabilmesi için vitellus akıntılarına enjekte etmek önemlidir. Bu enjeksiyon, kimera embriyolardaki hücrelerin gelişim sürecinin birkaç günü boyunca takip edilmesi için yeterli olacaktır. İdeal olarak, bu işlem hücreler dört hücreli evreye ulaşmadan önce yapılır. Enjekte edilen embriyoları, taze pen strep embriyo ortamı ile doldurulmuş kaplamalı bir Petri kabında düşük yoğunlukta büyütün.

Enjekte edilen embriyoların gelişim hızının biraz daha yavaş olma eğiliminde olduğunu unutmayın; transplantasyonların gerçekleştirilebileceği zaman aralığını genişletmek ve gelişimlerini kademelendirmek için embriyoları 25, 28 ve 31 degrees Celsius gibi farklı sıcaklıklarda inkübe edin. Zebra balığı blastulasında hücre transplantasyonu için kullanılan düzenek, üç yollu bir musluk aracılığıyla bir mineral yağı rezervuarına ve esnek bir boru vasıtasıyla bir mikropipet tutucuya bağlı, sürücü kontrollü bir Hamilton şırıngasından oluşur. Vakum ve basınç kontrol yeteneğinizi bozacağı için sistemdeki tüm hava kabarcıklarını giderin.

En az DX büyütmesine sahip, yüksek kaliteli optiklere sahip bir stereo mikroskop kullanın. Mikro pipet tutucunun ve iğnenin konumlandırmasını kontrol etmek için NARA shige manuel mikro manipülatör kullanmanızı öneririz. Titreşimlerin nakil işlemine aktarılmasını önlemek için cihazın manyetik bir taban kullanılarak tezgaha sabitlendiğinden emin olun.

Transplantasyon iğneleri, bir elektrot kutbu üzerinde hafif bir koniklik oluşturacak şekilde çekilen cam kapiler pipetlerden yapılır. Pipetlerin bir diseksiyon mikroskobu altında nasıl çekileceğine dair ayrıntılar için Miriam Goodman laboratuvarının JoVE protokolüne bakınız; çekilen iğnenin ucunu kırınız. Blastula evresi transplantasyonları için iğnenin dış çapı yaklaşık 50 ila 60 mikron, gastrula evresi transferleri için ise 30 ila 40 mikron olmalıdır.

Penetrasyonu artırmak amacıyla yapılacak bir gastro evre transferi için, öncelikle bir mikro dövme cihazı (micro forge) kullanılarak iğnenin ucundan keskin bir çentik çıkarılması gerekir; iğnenin ucunu mikro dövme cihazının filamanına yaklaştırarak düzeltin. Ardından, eğimin ön kenarı filamanla temas edebilecek şekilde iğneyi döndürün. İğnenin ön kenarı filamana temas ettiğinde, bir çentik oluşturmak için iğneyi hızla geri çekin.

Hücrelerin zarar görmesini önlemek için çıkıntı düz olmalı ve iğnenin ucu eğilmemelidir. Düzenek ve transplantasyon iğneleri hazırlandığında, kimera embriyolar oluşturmaya hazırsınız demektir. Hassas kader haritası bilgilerine ihtiyaç duyulmadığında, embriyolar arasında hücre transplantasyonu yapmak için blastula transplantasyonları kullanılır. Primordial germ hücreleri hariç, çoğu hücre genel olarak bu aşamada belirli bir kadere yönelmemiştir.

Blastulanın kader haritası, ektodermi oluşturacak hücreler ile mezodermi oluşturacak hücreleri birbirinden ayırt edebilmemize olanak tanır. Mezodermal ve endodermal hücreler, blastula evresindeki embriyonun kenar kısmına yakın konumlanırken; sinir sistemini ve yüzey dermisini oluşturacak olan dermal öncül hücreler, embriyonun kenarından daha uzakta yer alır. Bu nedenle, blastula evresindeki embriyolara hücre nakli yaptığımızda, bu hücreleri varsayılan mezoderme veya varsayılan ektoderme yönlendirebiliriz.

Ancak hücreleri ektodermin veya mezodermin herhangi bir belirli bölgesine yönlendiremeyiz çünkü nerede olduklarını bilmiyoruz. Embriyonun dorsal tarafının nerede olduğunu belirlemek için blastula aşamasında, yarısı eritilmiş %1,2 agar içeren embriyo ortamı ile doldurulmuş bir Petri kabına, kama şeklinde çıkıntılardan oluşan çift sıralı plastik bir kalıp yüzdürerek enjeksiyon kaplarını önceden hazırlayın. Agar katılaştığında, her biri sadece bir embriyoyu tutabilecek büyüklükte olan üçgen şeklinde kuyu sıraları bırakacak şekilde şablonu çıkarın.

Transplantasyon kalıbını pen strep embriyo medyumu ile doldurun ve blastula evresindeki embriyoları alevle uçları düzeltilmiş bir cam pipet yardımıyla her bir kuyuya tek tek yerleştirin. Ardından embriyoları transplantasyon kuyucuklarına aktarın ve başlangıçta yan yatmış şekilde kalmalarına izin verin. Embriyoları, donör embriyolar bir sütuna ve host embriyolar ise bitişik sütuna gelecek şekilde düzenleyin.

Kap, transplantasyon iğnesi bir embriyoya girdiğinde iğnenin embriyoyu bulunduğu kuyucuğun arka duvarına doğru iteceği şekilde sahneye yerleştirin. Mikromanipülatörü kullanarak, transplantasyon iğnesini oldukça dik bir açıyla kabın içine indirin. İdeal olarak, transplantasyon iğnesi embriyoya yaklaşık 45 derecelik bir açıyla girmelidir.

İğnenin ucu embriyo ortamının yüzeyinin altına indiğinde, Hamilton şırıngasını kontrol eden mikrometre sürücüsünü çevirerek iğneye az miktarda embriyo ortamı çekin. En hassas kontrol için, mineral yağı ile embriyo ortamı arasındaki ara yüzey, iğnenin ucuna çok yakın olmayacak şekilde ince konik kısımda kalmalıdır. Donör embriyoyu iğne yardımıyla nazikçe konumlandırın, ardından iğneyi geri çekip embriyonun blastula şapkasına istenen konumdan giriş yapın.

Hızlı ve sert bir darbe, embriyonun yuvarlanmasına neden olmadan içeri nüfuz edecektir. Hücrelerin parçalanmasını önlemek için donör hücreleri iğneye yavaşça ve dikkatlice çekin. İstenilen sayıda hücre alındıktan sonra iğneye vitellus çekilmesinden kaçının.

Vakumu durdurmak için basıncı hafifçe tersine çevirin ve konak embriyoyu konuma getirmek için iğneyi çıkarın. Transplantasyon kabını hareket ettirerek, vitellusa dokunmamaya dikkat edildiği sürece, transplantasyon iğnesi kullanılarak konak embriyonun konumu hafifçe döndürülerek küçük ayarlamalar yapılabilir. Donör hücreler konak embriyoya enjekte edilirken, donör hücrelere zarar verip onları öldüreceği için embriyonun içine vitellus alınmasından kaçının; tek bir donör embriyodan alınan hücreler, hücre transferleri tamamlandıktan sonra birden fazla konağa nakledilebilir.

Gelişime devam etmeleri için donör konak çiftlerini, kaplanmış 24 kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarına aktarın. Blastula evresinde hücrelerin belirli kaderlere atanmamış olması kuralının tek istisnası, primordiyal germ hücreleridir. Primordiyal germ hücreleri, gelişimin çok erken evrelerinde belirlenir ve primordiyal germ hücresi kaderine atanmış durumdadırlar.

Çok erken bir aşamadan itibaren, primordial germ hücreleri bir blastula ve gastrula evresindeki embriyonun kenarına yakın konumlanır. Bu nedenle, eğer transplantasyon deneyinin amacı primordial germ hücrelerini nakletmekse, hücrelerin donör embriyonun neresinden geldiği çok önemlidir, ancak konak embriyonun neresine gittikleri önemli değildir. Somatik hücreler için kural ise, konak embriyonun neresine gittiklerinin önemli olduğu ve bunun hücrelerin kaderini belirleyeceğidir.

Primordial germ hücreleri söz konusu olduğunda, kaderleri zaten belirlenmiş olduğu için donör embriyoda nereden geldikleri önemlidir. Amaç primordial germ hücrelerini nakletmekse, hücrelerin donör embriyonun kenar kısmından alınması gerekir; bu hücreler, gelişimin bu blastula veya gastrula evresinde, embriyonun hemen kenarında, her biri üç veya dört hücreden oluşan dört küçük küme halinde yer alırlar. Vitellusu yanlışlıkla çekmeye başlamamak için bu hücreleri çok dikkatli bir şekilde toplamanız gerekir.

Tamam, yaptığım işlem buydu; şimdi ise bir konak embriyoya geçiyorum. Primordial germ hücreleri, içinde bulundukları embriyonun genital ridge bölgesine kendiliğinden yönelecektir. Bu nedenle, bu primordial germ hücrelerini kenara nakletmeye gerek yoktur, oraya kendileri ulaşacaklardır.

Yani, hücreleri post-embriyo içerisindeki herhangi bir yere geri naklediyorum. Diğer tüm nakil türlerinin tam aksine, germ hücre nakilleri için kilit nokta, donör hücrelerin nereden geldiğinin önem taşımasıdır. Hücrelerin gastrula evresindeki bir konakçıya nakledilmesi, deneycinin, embriyonik kalkan görünür hale geldiğinde ortaya çıkan zebra balığı kader haritasından yararlanmasına olanak tanır.

Farklı doku tiplerinin yanı sıra, muhtemel merkezi sinir sistemi içindeki bölgelerin ayırt edilmesi mümkün hale gelir. Gastrula evresindeki embriyolar arasında hücre transferi yaparken protokolde bazı varyasyonlar olsa da, genel prosedür blastulaları sabitlemek için kullanılan gastrula çalışma yöntemine benzerdir. Önce cam bir çukur lamın çukur kısmına dikey bir şerit halinde Metilselüloz sürün, ardından alevle pürüzsüzleştirilmiş bir transfer pipeti kullanarak bol miktarda pen strep embriyo besiyeri ile doldurun.

Bir donör ve üç kalkan evresindeki konakçıyı depresyon lamına yerleştirin. Konakçılardan biraz daha genç olan donör embriyolarını seçin. Gastros yapıştırıcısını manipüle etmek için yeni bir araç gereklidir; bunun için kısa bir parça iki poundluk test balık misinasının uçlarını bir kapiler tüpün ucuna yerleştirin.

Böylece küçük bir halka oluşturun. Donör ve host embriyoları hafifçe yuvarlayarak Metilselüloz şeridinin üst kısmına taşımak için halkayı kullanın ve sabitlenene kadar Metilselülozun içine itin. Hedeflenen bölge en üstte kalacak şekilde onları konumlandırın.

Nakil sırasında, donör hücreleri ylk'ye zarar vermeden iletmek için iğne embriyoya teğetsel olarak girecektir. Gastro evre nakilleri, sabit evreli bir bileşik mikroskop altında en iyi şekilde gerçekleştirilir. Nakil iğnesinin ucunu odak noktasına getirmek için mikromanipülatörün kontrollerini kullanın.

Mikropipet tutucu ve iğneyi, iğne lam üzerindeki çukurluğun kenarının izin verdiği ölçüde yatay konuma yakın olacak şekilde oldukça düşük bir açıyla konumlandırın. Ardından donör embriyoyu delin. Eğer uygun şekilde sabitlenmişse, embriyo iğnenin kolayca nüfuz etmesine izin vermeyecek kadar yaşlı olmadığı sürece, transplantasyon iğnesi girerken yuvarlanmayacaktır.

Yolk'u delmekten kaçınmak için iğne, embriyoya EDL'nin biraz daha derininde olan bir odak düzleminden girmelidir. Delindikten sonra, donörden üç konak hücresi enjeksiyonuna kadar yetecek miktarda çok sayıda hücre alınabilir. Hücreleri çekerken, istenirse hücreler alınırken iğneyi hareket ettirerek yolk'un çekilmesinden kaçının.

Hücreleri konakçıya aktarmadan önce, aynı iğne kullanılarak daha fazla hücre elde etmek amacıyla ek embriyolar hasat edilebilir; hücreler konakçı embriyoya aktarılırken, hücreleri tek bir küme halinde bırakmak yerine, iğne hedeflenen bölge boyunca çekilirken hücreler dışarı verilmelidir. Bu işlem, donör hücrelerin istenen dokuya katkıda bulunma olasılığını artıracaktır. Hücre transferleri tamamlandığında, lamın tamamı bir Petri kabına yerleştirilmeli ve üzerine dikkatlice pen strep embriyo besiyeri doldurulmalıdır.

Önümüzdeki birkaç saat içinde metilselüloz çözünerek embriyoları serbest bırakacaktır. Transfer edilen hücre sayısı, deneyin özel amacına bağlıdır. Tek bir donörden alınan hücreler, transplantasyonun ertesi sabahı üç veya dört konakçıya nakledilebilir.

Donör hücre hedeflemesinin başarılı olup olmadığını belirlemek için konakçılar incelenebilir. Blastula evresindeki primordial germ hücrelerinin başarılı transplantasyonu, ylk ve ylk uzantısı arasındaki birleşme noktasına yakın, ventral olarak konumlanmış floresan işaretli hücrelerle sonuçlanır. Böylece size gastrula ve blastula evresi transplantasyonlarının nasıl yapılacağını göstermiş olduk.

Bu tekniği uygularken, hücrelerinizle hedeflemeyi umduğunuz hedef doku için doğru transplantasyon yöntemini seçmek önemlidir. Dolayısıyla, hücrelerin dermise karşı ektoderme gidip gitmediğini belirlemek için blastula evresi transplantasyonu yeterlidir. Ayrıca bu tekniği primordial germ hücrelerini hedeflemek için de kullanabilirsiniz.

Daha hassas bir haritalama yapmak isterseniz, dorsal tarafın önceden belirlendiği bir gastros yaş nakli kullanmak daha iyidir. Bu teknikle hücreleri sinir sisteminin çeşitli bölgelerine, özellikle de ön beyin, orta beyin, arka beyin ve omuriliğe hedefleyebilirsiniz. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için çok teşekkürler, tüm deneylerinizde başarılar dileriz.