Zebra balığı sperm Kriyoprezervasyon için bir Yüksek Verim Yöntem ve In Vitro Gübreleme

Merhaba, ben California Davis Üniversitesi, Moleküler ve Hücresel Biyoloji bölümünden Bruce Draper ve ben de Seattle'daki Fred Hutchinson Kanser Araştırma Merkezi, Temel Bilimler Bölümü'nden Cecilia Moans. Bugün Cecilia ile birlikte, orijinal Brian Harvey protokolünün modifiye edilmiş bir versiyonu olan zebra balığı sperm kriyoprezervasyon protokolünü uygulamalı olarak göstereceğiz. İki kişilik ekipler halinde çalışarak, 100 farklı erkek balığın sperm hücrelerini iki saatten kısa bir sürede kriyoprezerve etmenin mümkün olduğunu size göstereceğiz.

Çözdürme sonrası fertilite oranları geniş bir yelpazede değişse de, ortalama %25 fertilite elde etmekteyiz ve bu sonuçlar yedi yılı aşkın süredir kriyoprezervasyon altında tutulan bir kütüphaneden alınmıştır. Öyleyse başlayalım. Bu prosedürü gerçekleştirmeden önce, ilk olarak sperm dondurma solüsyonlarını hazırlayın.

Ginsburg balık ringer solüsyonu her üç günde bir taze olarak hazırlanır ve dondurma ortamı, metanol içeren ve içermeyen versiyonlarıyla her gün taze olarak hazırlanır. Bu solüsyonların bileşimleri, bu protokolle birlikte sunulan çevrimiçi ek bilgilerde bulunabilir. Bu prosedürde kullanılan malzemeler, dondurma ve çözme hızını etkileyebilir; bu durum ise dondurulmuş spermlerin fertilite oranını etkileyebilir.

Bu nedenle, önerilen malzemelerin bir listesi ek çevrimiçi bilgi olarak da sunulmuştur. Spermleri kuru buz peletleri yerine ince şekilde ezilmiş kuru buz üzerinde dondurmak en iyisidir. Kuru buzu ezmenin basit bir yolu, onu bir havluya sarıp çekiçle toz haline getirmektir.

Daha verimli bir yöntem, zebra balığı spermini dondurmak için claws ve model RE iki gibi bir kuru buz öğütücü kullanmaktır. İlk olarak, 10 µL'lik kapiler tüpleri laboratuvar kalemiyle 3,33 µL seviyesinden veya tabandan yaklaşık 16,7 mm mesafeden işaretleyin; erkekleri anesteziye almak için iki ila dört erkek balığı, seyreltilmiş trica içeren bir behere yerleştirin. Tarif, zebra balığı kitabında bulunabilir.

Anestezi uygulandıktan sonra, balıkları plastik bir kaşıkla anestezik çözeltiden çıkarın ve bir kağıt havlu üzerinde nazikçe kurulayın. Özellikle ventral bölgenin kurulanmasına dikkat edin. Su spermleri aktive ettiğinden, ika çevresinin tamamen kurulanması kritik önem taşır.

Balığı, ventral tarafı yukarı gelecek şekilde sünger tutucuya yerleştirin. Pelvik yüzgeçlerin çevresi hala nemliyse, bir Kim wipe ile nazikçe kurulayın. İşaretlenmiş kılcal tüpü, kılcal tüplerle birlikte verilen kauçuk ağız pipeti adaptörüne yerleştirin.

Adaptör, bir ucunda ağızlık, diğer ucunda ise kapiler tutucu bulunan kauçuk bir hortumdur. Alternatif olarak, kapiler tüp 50 µL'lik bir Hamilton şırıngasına bağlanabilir. Uygun çapta kısa bir tigon tüp parçası kullanarak, erkeği mikroskobun altına yerleştirin ve pelvik yüzgeçleri dikkatlice birbirinden ayırarak ürogenital açıklığı açığa çıkarın.

Kılcal borunun ucunu kullanarak, balığın yanlarına düz cımbızla nazikçe sürterek veya işaret parmağı ve başparmağıyla yanlarından hafifçe sıkarak spermi dışarı çıkarın; dışarı atılan spermi, hafif bir vakum uygulayarak kılcal boru içine toplayın. Spermle birlikte atılabilecek dışkılardan kaçının. Hedef sperm hacmi 3.3 microliters'dır.

Kabul edilebilir minimum sperm miktarı, spermin kalitesine bağlı olarak değişir. Kaliteli sperm beyaz ve opaktır, düşük kaliteli sperm ise sulu görünür. Genel olarak, kabul edilebilir minimum sperm miktarı; kaliteli sperm için bir mikrolitre veya hedefin üçte biri, düşük kaliteli sperm için ise iki mikrolitre veya hedefin üçte ikisidir.

Sperm hacmi 3,3 microliter hedef hacme ulaşmazsa, hacmin metanolsüz dondurma ortamı kullanılarak kalem çizgisine normalize edilmesi gerekir. Eğer sperm hacmi kapiler tüpteki kalem çizgisine zaten ulaşmışsa veya bu çizgiyi aşmışsa, bir sonraki adıma geçin. Şimdi spermin üzerine kriyoprotektan ekleyin.

Metanol içeren dondurma ortamını turuncu işarete kadar çekin. Yaklaşık toplam hacim şu an 20 µL'dir. Sperm ve kriyoprotektan karışımını bir saat camının temiz bir alanına boşaltın; pipetle yaklaşık dört kez aşağı yukarı çekerek nazikçe karıştırın ve hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin.

Spermleri, her bir etiketli viyalin tabanına 10 µL sperm kriyoprotektan çözeltisi pipetleyerek iki kriyoviyale paylaştırın. Hızlı hareket ederek viyalleri kapatın ve her bir kriyoviyali ayrı bir 15 mL falcon tüpüne bırakın. Oda sıcaklığında falcon tüplerini kapatın ve ince toz haline getirilmiş kuru buzun içine yerleştirin.

Falcon tüplerini takip edebilmek için tüpler, sadece kapakları görünecek şekilde yeterince derine yerleştirilmelidir. Tüpleri numaralandırın ve her bir tüpün kuru buza girdiği saati kaydedin. Spermlerin kuru buzda 20 dakika boyunca donmasını sağlayın.

Sperm dondurulduktan sonra, iki kriyoviyali sıvı nitrojen içeren bir Dewar balonuna aktarın. Geçici saklama için dondurucu kutusunu, örneklerin ısınmaması için sıvı nitrojen banyosuna yerleştirin.

Viyalleri doer balondan çıkarmak için uzun metal maşalar kullanın ve onları kriyojenik eldivenlerle tutun. Alternatif olarak, kriyo viyaller doğrudan kuru buzdan dondurucuya aktarılabilir. Eğer dondurucu kutusu uzun süreli saklama için bir strafor kap içerisinde sıvı azotun içinde tutuluyorsa, kriyo viyalleri kriyojenik sıvı azot dondurucuya yerleştirin.

Sperm canlılığını korumak için, tüplerin sıvı azot içerisinde daldırılmış halde saklanması kritik öneme sahiptir; buhar fazında saklanan tüpler zamanla canlılığını yitirebilir. Sperm canlılığının korunmasında hız da kritik bir faktördür. Kriyoprotektanın eklenmesi ile sperm tüplerinin kuru buza yerleştirilmesi arasındaki süre 30 saniyeden fazla olmamalıdır In vitro fertilizasyon.

Kriyoprezervasyonla saklanmış sperm kullanımı, iki kişiyle en iyi şekilde yürütülür. Bir kişi dişilerden yumurtaları sağarken, diğer kişi spermleri çözer. Bir su banyosunu 33 °C'ye ayarlayın.

Sıvı azot dondurucudan bir kriyoviyol çıkarın ve çözülmeye hazır olana kadar sıvı azot içeren bir kaba veya erlene aktarın. Anestezi uygulanmış dişilerden yumurtaları 35 milimetrelik plastik bir Petri kabına sıkın. Bu işlem, zebrafish'lerin ayrıntılı bir açıklamasını sunan "Making Gyno Genetic deployed zebrafish by early pressure" başlıklı JoVE protokolünde ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

In vitro fertilizasyonda, iyi bir yumurta grubu, tek tip ve sarımsı renkte olan 150'den fazla yumurta içerir. Herhangi bir beyaz kalıntı, dejenerasyonun göstergesidir. Mümkünse, üç yumurta grubu elde etmeye çalışın ve bunları tek bir kaba birleştirin.

İlk clutch'tan sonra bir dakika içinde üç adet iyi clutch elde edilemezse, bir sonraki adıma geçin. Sperm çözülürken kabı kapalı tutun. Bu sırada, viyali sıvı azot içerisinden çıkarın ve kapağını açın.

Viyali, 33 °C'lik bir su banyosuna hızlıca yarıya kadar daldırıp sekiz ila 10 saniye bekletin. Viyala hızlıca oda sıcaklığında 70 µL Hank'in tamponlu tuz çözeltisi ekleyin ve pipetle yukarı-aşağı çekerek karıştırın; ardından hemen Petri kabındaki yumurtalara ekleyin ve pipet ucuyla nazikçe karıştırın. Sonrasında, 750 µL balık suyu ekleyerek sperm ve yumurtaları hemen aktive edin, karıştırmak için çalkalayın ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

Beş dakika sonra, kabı balık ve su ile doldurun ve 28 °C'de inkübe edin. İki ila üç saat sonra, canlı embriyoları sayın ve her kapta 50 embriyo olacak şekilde 100 mm'lik kaplara aktarın. Ayrıca, sperm örneğinin fertilite oranının belirlenebilmesi için döllenmiş yumurtaları da sayın.

Sperm fertilite oranı, in vitro fertilizasyon için kullanılan toplam yumurta sayısının canlı embriyolara oranıdır. Yumurtalar, in vitro fertilizasyondan iki ila altı saat sonra herhangi bir zamanda ayrıştırılabilir. İnfertil yumurtalar canlı embriyolardan kolayca ayırt edilebildiğinde, infertil yumurtalar şeffaf ve bölünmemiş haldedir.

Stereo mikroskopta trans-aydınlatma ile incelendiğinde, kriyokonserve edilmiş spermlerin ortalama fertilitesi geniş bir değişkenlik gösterir. Bununla birlikte, birden fazla yıl boyunca stabil kalan ortalama %25 fertilite elde etmek mümkün olmalıdır. Bu grafik, 2001 ile 2003 yılları arasında dondurulmuş ve 2008 yılına kadar saklanmış spermlerin ortalama yüzde fertilitesini göstermektedir.

Balık sperm hücrelerinin kriyoprezervasyonu için yüksek kapasiteli bir yöntemi uygulamalı olarak gösterdik. Bu protokolü gerçekleştirirken, önerilen tüm plastik malzemelerin ve ekipmanların kullanılmasının yanı sıra, kuru buz peletleri yerine toz haline getirilmiş kırılmış kuru buz kullanılması önemlidir. Gerçekten yüksek kaliteli sperm ve yumurtaların kullanılması kritik öneme sahiptir; in vitro fertilizasyon sırasında, spermler çözüldükten sonra, sürecin sonunda elde edilen fertil embriyo sayısını artırmak için mümkün olduğunca çok sayıda yumurta kullanmak önemlidir, ki bu da üç ila dört dişi balık gerektirebilir, değil mi?

Protokolün bir diğer kilit bileşeni ise hızdır. Spermin erkekten alınmasıyla kuru buza yerleştirilmesi arasındaki süre hiçbir zaman bir dakikayı geçmemelidir. Sanırım bu kadar.

Deneylerinizde başarılar dileriz.