Tek Moleküler Kompleksleri görselleştirme In Vivo Gelişmiş Floresan Mikroskopi

Burada, fonksiyonel moleküler komplekslerin tespit edilmesini, izlenmesini ve miktarının belirlenmesini sağlamak amacıyla, canlı bakteri hücreleri üzerinde tek molekül floresan mikroskopisi gerçekleştirme protokolünü sunuyoruz. Bu protokol, floresan boya molekülüyle işaretlenmiş bir protein üreten bakterilerin büyütülmesiyle başlar. Dört ila altı saat sonra, kültürden küçük bir hacimde hücre alınır ve kamçı filamentleri kesme yöntemiyle kısaltılır.

Akış hücresi içindeki bir cam lamel, hücrelerin yüzeye yapışmasını sağlamak için kaplanır. Hücreler akış hücresine enjekte edilir ve bir gellar sapı aracılığıyla sabitlenir; bu yapı, lazer uyarımı mikroskopisi kullanılarak floresan altında incelenir. Daha sonra, yüksek kuantum verimliliğine sahip bir kamera, işaretlenmiş moleküler komplekslerin parlak alan ve floresan görüntülerini kaydeder.

Merhaba, benim adım Ian Doy; Oxford Üniversitesi Biyokimya Bölümü'nde Mark Lee ile çalışıyorum. Ben Alex Robertson, fizik bölümünde Mark Lee ile çalışıyorum. Ben de fizik bölümünde yer alan Leak laboratuvarından Nick De.

Bugün, gelişmiş floresan mikroskobisi kullanarak canlı bakterilerdeki tekil moleküler komplekslerin görselleştirilmesi prosedürünü size göstereceğiz. Bu prosedürü, bunları fonksiyonel durumdayken incelemek için kullanıyoruz. Ayrıca, doğal biyolojik makinelerin gerçek zamanlı dinamiklerini nanometre ölçeğinde araştırmak için de kullanmaktayız.

Hadi başlayalım. Başlamak için, genetik olarak modifiye edilmiş dondurulmuş e coli bakterisi stoklarından 50 µL çözündürün.

Bir proteini floresan boya molekülü ile işaretlemek için, beş mililitre LB büyüme besiyerini inoküle edin ve bakterileri 37 °C'de gece boyunca çalkalayarak aerobik koşullarda büyütün. Ertesi sabah, doygun kültürden 50 µL alın ve minimal M 63 Glikoz kültür besiyerine alt kültüre aktararak 30 °C'de dört ila altı saat inkübe edin. Burada iki farklı hücre suşu kullanılmıştır.

Bunlardan biri, GFP ile kaynaştırılmış bir elektron taşıyıcı sitokrom ifade eder. Diğeri ise bakteriyel kamçı motorunda yer alan bir protein ifade eder. GFP ile kaynaştırılmış hücreler, immobilize örnekler olarak incelenecekse doğrudan büyüyen alt kültürden hasat edilebilir veya bağlanmış koşullar altında inceleneceklerse bakteriyel kamçıkları kısaltmak için kesme işlemine tabi tutulabilirler.

Bakterileri parçalamak için, steril borulama yöntemiyle bir ila beş mililitre alt kültürü, iki steril şırıngadan oluşan bir düzeneğe yerleştirin. Elde edilen parçalanma derecesine bağlı olarak, kültürü dar tüplerden geçirmek için her bir şırınga pompasını sırayla yaklaşık 50 ila 100 kez itin. Ardından, hücreleri çöktürmek için kültürü santrifüjleyin ve kamçı fragmanlarını uzaklaştırmak amacıyla hücreleri minimal medyada yeniden süspanse edin. Hücreler hazır olduğunda, BK 7 cam lamellerini 20 dakika boyuncale potasyum hidroksit ve etanolün doygun bir çözeltisine daldırarak temizleyin.

Deiyonize su ve etanol ile iyice durulayın ve en az bir saat boyunca havada kurumaya bırakın. Ardından, hücreleri mikroskopta barındırmak için basit bir akış hücresi oluşturun. Bunu yapmak için, bir BK seven cam mikroskop lamı üzerine parafin gresi ile çizgiler çizin ve ardından temizlenmiş lamel örtülerden birini üzerine yerleştirerek bir tünel sandviç yapısı oluşturun.

Bir pens yardımıyla nazikçe aşağı bastırın. Bu işlem, 5 ila 10 µL hacminde bir akış hücresi oluşturmalıdır. İmmobilize edilmiş hücreleri gözlemlemek için, akış hücresini %0,1'lik poly L lysine çözeltisi enjekte ederek doldurun ve oda sıcaklığında en az bir dakika inkübe olmasını sağlayın.

Ardından, akış hücresinin bir ucundan 100 µL minimal besiyeri enjekte ederek ve eş zamanlı olarak diğer uçtan kağıt havlu ile besiyerini çekerek akış hücresini yıkayın. Sonrasında, lamine cam yüzeyini işaretlemek için minimal besiyeri içinde 1/500 oranında dilüe edilmiş 200 nm çapındaki lateks mikrokürelerden 20 µL çekin. Akış hücresini basit bir nemlendirme kabına yerleştirin ve beş dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Akış hücresi, lamine cam aşağı bakacak şekilde ters çevrilir.

Bağlanmamış boncuklar daha sonra, doku kağıdıyla 100 µL minimal besiyeri üzerinden emdirme yapılarak yıkanır. Bağlanmış hücreleri gözlemlemek için bunun yerine poli L lizin inkübasyon adımını atlayın; akış hücresini 5 µg/mL Anti-Flag gellan antikor çözeltisi ile doldurun ve ardından 10 dakika boyunca nem odasına yerleştirin. İnkübasyon sonrası, doku kağıdıyla emdirme yaparak akış hücresini yıkayın.

Ardından, ya bağlanmış hücreleri gözlemlemek için kesilmiş örneği ya da immobilize hücreleri görüntülemek için kesilmemiş örneği kullanarak, doku kağıdı aracılığıyla akış hücresinden 20 µL hücre kültürü emdirilir; akış hücresi ters çevrilir ve 20 dakika boyunca nem odasında bekletilir. Daha sonra, 100 µL minimal medya emdirilerek bağlanmamış hücreler yıkanır. Lamelin üst yüzeyinin merkezine bir damla immersiyon yağı damlatın.

Akış hücresini, özel olarak yapılmış floresan mikroskobunun numune tutucusuna nazikçe yerleştirin. Bu işlem, yüksek sayısal açıklıklı objektif lens ile optik temas sağlanmasını sağlayacaktır. Ardından, mikroskobun elektron çarpanlı kamerasını açın ve kamerayı eksi 70 °C'ye soğutulacak şekilde ayarlayın.

Yazılım, kare aktarım modunda, tipik olarak 25 hertz'lik bir kare hızında görüntü alacak şekilde ayarlanmıştır. Aydınlık alan aydınlatmasını açın ve görüntüyü odaklayın.

Uzun eksenleri boyunca yapışık oldukları temelinde, görüntüsü alınacak uygun bir hücre veya hücre grubu seçin. Lamel yüzeyine paralel olarak, lamel yüzeyine yapışmış 200 nanometre latex boncukların tam odak noktasında olduğundan emin olmak için odağı ayarlayın. Hücre gövdesinin ana hattını kaydetmek için aydınlık alanda bir görüntü dizisi elde edin.

Ardından parlak alan aydınlatması kapatılır ve toplam internal yansıma floresan (TIRF olarak da bilinir) kullanılarak görüntüleme yapmak için kamera kazancı maksimuma getirilir. Kamera çekimini başlatın ve bakterilerdeki floresan proteinleri uyarmak için lazer kepenklerini açın. Lazer yoğunluğu ve çekim hızı parametrelerinin, söz konusu biyolojik sisteme göre optimize edilmesi gerekir.

İncelenen örnekler, genellikle yaklaşık 10 saniye süren fotobağlama (photo bleaching) gerçekleşene kadar aydınlatılır. Veriler toplandıktan sonra görüntüler, hücrelerdeki floresan lekelerin konumlarını birkaç nanometre hassasiyetle otomatik olarak tespit eden ve bunların boyutunu ve parlaklığını çıkaran özel olarak yazılmış bir analiz programına aktarılır. Ardından, çekici moleküler kompleksin zamana göre fotobağlama izinin parlaklığı, stokiyometriyi tahmin etmek için kullanılır.

Bu yöntem kullanıldığında, parlak alan altında görüntülenen hücrelerin görüntüsü oldukça belirgindir; öyle ki, immobilize edilmiş hücrelerle floresan kullanıldığında, hücre gövdelerinin çevreleri beyaz gri hücre gövdesine karşı koyu görünür. Burada yalancı renkte gösterilen, tipik olarak 250 ila 300 nanometre genişliğinde belirgin yoğunluk noktaları görülebilir. Floresan uyarımı altındaki parlak alan görüntülerinde, sağlıklı sabitlenmiş hücrelerin bağlantı noktasının etrafında döndüğü görülebilir.

Bazı moleküler kompleksler, bağlanma noktasında da görülebilir ve bu durum, etiketlenmiş proteinin Geller motoru ile lokalizasyonuna işaret eder. Bu noktalar, bireysel moleküler komplekslerdir. Bunlardan kaç tanesinin görüleceği, kullanılan aydınlatma moduna ve herhangi bir anda hücrede gerçekte kaç kompleksin bulunduğuna bağlıdır.

Burada kullanılan işaretli sitokromlarda olduğu gibi, lekelerin yoğunluğu başlangıçta çok yüksekse, başlangıçta bir FRAP ağartma işlemi uygulamak görüntüleme kontrastını artırabilir. Lekelerin mobilitesi, incelenen spesifik biyolojik sisteme bağlıdır. Gelişmiş floresan mikroskopisi kullanarak tekil moleküler komplekslerin nasıl görselleştirileceğini göstermiş olduk.

Bu prosedür uygulanırken, kamçı motorunun işlevselliğini bozabileceği için hücrelerin makaslanmamasına dikkat edilmesi önemlidir. Ayrıca, oksijensiz kalabilecekleri için hücrelerin mikroskop lamları üzerinde bir saatten fazla bırakılmaması gerekir. En iyi görüntüleme koşullarını belirlemek için optimizasyon gereklidir.

Kendi mikroskop sisteminiz için doğru lazer gücünü belirlemek amacıyla yalnızca saflaştırılmış GFP kullanmak faydalı olabilir. Şimdilik bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.