Doku Mühendisliği 3D Hidrojeller Hücresel Kapsülleme

Hücrelerin enkapsülasyonu için izlenen aşamalı süreç, hidrojel kalıpların ve diğer malzemelerin hazırlanması ve sterilizasyonu ile başlar; bunu, her jel seti için tüplere ayrılmış hücrelerin bireysel popülasyonlar halinde izole edilmesi takip eder. Ardından, hücrelerin varlığında jelleşme gerçekleştirilir ve sonrasında in vitro veya in vivo inkübasyon süreci uygulanır. Hücre davranışına yönelik aşağı akış analizleri; canlılık, morfoloji, proliferasyon ve diferansiyasyon testlerini içerebilir.

Merhaba, ben Pennsylvania Üniversitesi Biyomühendislik Bölümü'nden Dr. Jason Burdick'in laboratuvarından Amidio Kahan. Bugün size doku mühendisliği için 3D hidrojellerde hücresel enkapsülasyon prosedürünü göstereceğiz. Bu prosedürü, hidrojel kompozisyonunun ve yapısının enkapsüle edilen hücrelerin davranışı üzerindeki etkilerini incelemek için kullanıyoruz.

Hadi başlayalım. Bu prosedüre başlamak için, PBS içinde %0,5 (ağırlıkça) konsantrasyonunda photo initiator air cure 2 9 5 9 veya I 2 9 5 9 çözeltisi hazırlayın. Karıştırın ve 37 °C'de, karanlıkta iki ila üç gün boyunca inkübe edin.

Hazır olduğunda, çözeltiyi sterilize etmek için bir şırınga filtresi kullanın ve oda sıcaklığında saklayın. Daha sonra, gösterilen miktarlarda gereken polimer ve çapraz bağlayıcı miktarını hesaplamak için Microsoft Excel gibi bir hesap çizelgesi programı kullanın. Burada, akrilat reaktif gruplarıyla fonksiyonelleştirilmiş hiyalüronik asit bulunmaktadır.

Ayrıca, amino asit olarak sistin, arjinin, glisin ve aspartat içeren fonksiyonel yapışkan domaine sahip pentan peptid miktarını hesaplayın. Sistin, polimere bağlanma amacıyla kullanılır. Polimer çapraz bağlayıcı ve pentan peptid için gerekli miktarlar belirlendikten sonra, bunları tartın ve her birini bir ependorf tüpüne yerleştirin.

Hesaplama tablosunu buna göre ayarlayın. Elde edilen gerçek polimer kütlesi için, jel kalıplarının hazırlanması aşamasına geçin. Bireysel olarak paketlenmiş steril uçları kesmek için bir jilet kullanın.

Bir mililitrelik tek kullanımlık şırıngalar. Fotodesenle jellere uygulanacak kalıplar için düz bir kesim yapıldığından emin olun. Son olarak, şırınga kalıplarını, kapakları açık EOR tüplerini ve gerekli diğer tüm malzemeleri, biyolojik güvenlik kabinine yerleşik germisidal ışık kaynağının altında 30 dakika boyunca sterilize edin.

Sterilizasyon tamamlandığında, deney ekipmanlarının sterilizasyonunun ardından hücreleri hazırlamaya geçin. Çeker ocak altında çalışın ve mika tipi çapraz bağlamada kullanılan polimere steril TEA, serbest radikal çapraz bağlamada kullanılan polimere ise steril PBS ekleyin. Sarkaç kısmının bulunduğu tüplere uygun tampon çözelti EKLEYİN ve vorteksleyin.

Sarkık grubun polimere bağlanmasını sağlamak amacıyla, peptitteki bir INE grubundaki tiyol aracılığıyla alkillenmiş hyaluronik asite bağlanması için sarkık grubu polimer çözeltisine ekleyin ve parafilm ile kapatın. Kısaca, vortexle karıştırın ve 37 °C'de inkübe edin. Sarkık grup bağlanırken, enkapsüle edilecek hücreleri (insan mezenkimal kök hücreleri veya hMSCs) PBS ile yıkayarak hazırlayın.

Ardından oda sıcaklığında bir dakika boyunca tripsin ile inkübe edin, tripsini uzaklaştırın ve 37 °C'de beş dakika daha inkübe edin. Daha sonra, tripsini nötralize etmek ve hücreleri plak yüzeyinden serbest bırakmak için HMSC büyüme ortamı ekleyin. Hücreleri bir hemositometre ile sayın.

Sayılan hücreleri, her bir jel seti için uygun sayıda olacak şekilde porsiyonlara ayırın. Mililitrede 10 milyon hücre yoğunluğunda, üç adet 50 µL'lik jel set için, 1,5 milyon hücreyi ayrı bir konik tüpe ayırın. İşlem süresi nedeniyle, tek bir sette dört jelden fazlasını hazırlamayın.

Ardından hücreleri 500 RCF'de altı dakika boyunca santrifüjleyin. Hücreler çökerken, oda sıcaklığında mical edition çapraz bağlama için polimerizasyon karışımını hazırlayın. Uygun konsantrasyonu sağlamak için çapraz bağlayıcıya tampon ekleyin.

Işıkla başlatılan serbest radikal çapraz bağlama için, önceden hazırlanan I 2 9 5 9 çözeltisini polimer çözeltisine ekleyin. Toplam jel set hacminin %10'u oranında ekleyerek nihai başlatıcı konsantrasyonunu ağırlıkça %0,05 yapın. Artık hücreler ve polimerizasyon karışımı, hidrojelde enkapsülasyon için hazırdır.

Santrifüj edilen hücrelerin süpernatanını aspire ederek başlayın. İlk aspirasyondan sonra sıvının çökmesini bekleyin ve hücre peletini bozmadan mümkün olduğunca fazla medyumu uzaklaştırmak için tekrar aspire edin. Hava kabarcıklarını önlemek için hücre peletini polimer solüsyonu ile resüspande edin.

Hücrelerin eşit şekilde dağılmasını sağlamak için çözeltiyi pipetle yaklaşık 10 kez yavaşça çekip bırakın. Mika tipi ekleme reaksiyonu için, polimer hücresine uygun hacimdeki çapraz bağlayıcı çözeltisini eklemek amacıyla geniş ağızlı bir pipet ucu kullanın. Karıştırın. Pipeti istenen tekil jel hacmine ayarlayın.

Çözeltiyi homojenleştirmek için pipetle aşağı yukarı çekin ve şırınga ucu kalıplarına aktarın. Hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için bu adımı hızlıca gerçekleştirin ve çapraz bağlanma için kültür kabininde 10 ila 30 dakika inkübasyona bırakın. Işıkla başlatılan serbest radikal çapraz bağlanması için.

Uygun hacimdeki miktarları şırınga ucu kalıplarına paylaştırın. Radikal çapraz bağlanma için şırıngaları 365 nanometre dalga boyundaki UV ışığına 10 dakika boyunca maruz bırakın. ACRL fonksiyonelleştirilmiş polimerler için santimetrekare başına dört miliwatt UV ışığı yaygın olarak kullanılır.

UV ışığına maruz bırakmadan önce hücre çökmesini en aza indirmek için bu adımı hızlıca gerçekleştirin. Çapraz bağlama işlemini takiben, jelleri inkübasyon ve analiz için besiyeri içeren bir doku kültürü plağının kuyucuklarına daldırın. Hidrojelin çapraz bağlanması sıralı olarak da gerçekleştirilebilir.

İlk olarak, fonksiyonelleştirilmiş boya metolize edilmiş rümini jel içerisine 20 nanomolar nihai konsantrasyona gelecek şekilde ekleyin. Boya, jelin radikal şeklinde çapraz bağlı bölgelerine öncelikli olarak dahil olduğu için desenlemenin görselleştirilmesine yardımcı olur. Ardından, aşağıdaki işlemler için teorik çapraz bağların bir kısmını veren mik tipi polimerizasyon reaksiyonunu başlatın.

Serbest radikal çapraz bağlama için, Adobe Photoshop veya Illustrator gibi bir programda tasarlanan ve doğrudan şeffaf maskeler üzerine basılan bir maske kullanılması gerekir. Maske boyutları, şırınganın yuvarlak üst kısmıyla uyumlu olmalıdır. Jel yüzeyine steril bir maske uygulamak için steril cımbız kullanın ve jeli çapraz bağlamak için ışığa maruz bırakın.

Burada ayrıca, enkapsülasyondan bir saat sonra HA bazlı hidrojeller içindeki HMC'ler gösterilmiştir. Sentezlenen hidrojeller genellikle şeffaf olduğu için hücreler, ışık mikroskopisi kullanılarak morfoloji açısından görselleştirilebilir. Aynı hücrelerin canlılığı, enkapsülasyondan 24 saat sonra floresan canlı-ölü boyama kiti kullanılarak görselleştirilmiştir.

Canlı hücreleri tespit etmek için kalsiyum M, ölü hücreler için ise ateryum homodimeri kullandık ve %95'ten fazla canlılık gözlemledik. Ayrıca, hücrelerin assay reaktifini ne kadar iyi metabolize ettiğinin sonucunda meydana gelen renk değişimi ile ölçülen hücre proliferasyonu düzeyini belirlemek için alamar blue assay kullandık. Hücre boyaması, parçalanabilir ve yapışkan HA tabanlı bir hidrojel içine enkapsülasyondan yedi gün sonra, standart fiksasyon ve permeabilizasyon prosedürleri kullanılarak H HMC'ler üzerinde gerçekleştirildi.

Hücresel aktin, floresein işaretli phalloidin kullanılarak, çekirdekler ise dpi ile sınırlandırılarak görünür hale getirilmiştir. Hidrojel matrisi içindeki fokal adezyonların görselleştirilmesi için cullin'e karşı immün boyama kullanılmıştır. Radikal polimerize HMSC enkapsüle HA hidrojellerinin standart protokoller kullanılarakle dehidrasyonu, parafin gömme işlemi ve kesit alınmasının ardından histolojik boyama gerçekleştirilmiştir.

Kültürde bir hafta geçtikten sonra, çekirdekleri işaretlemek için hematoksilin, bağ dokuyu işaretlemek için ASIN ve glikozaminoglikanlar için mavi boyalar ile boyama yapıldı. Kapsüllenmiş kök hücrelerin farklılaşmasını nicelleştirmek için Real-time PCR kullanılmıştır. Arka plan çıkarıldıktan sonra, ilgilenilen bir genin ekspresyon seviyesi, konstitütif olarak aktif bir housekeeping geni olan pasif referans sinyali ile karşılaştırılarak, eşik floresan değerine ulaşılan döngü sayısı ile belirlenir. Böylece, hücrelerin 3D hidrojeller içine nasıl kapsülleneceğini ve hücrelerin jeller içindeki davranışlarının nasıl inceleneceğini göstermiş olduk.

Bu prosedürleri uygularken, steril tampon çözeltileri ve reaktifleri uzun süre muhafaza ederek veya germisid UV lamba ile sterilize ederek materyallerin tamamen steril olduğundan emin olmak önemlidir. Şimdilik bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.