İki foton Floresan Kurtarma üzerinden Photobleaching sonra Difüzyon Katsayıları Ölçüm

Çok fotonlu floresans kaybı sonrası geri kazanım prosedürü, serbestçe difüze olan floresan boya molekülleri içeren bir örnekle kolayca gösterilebilir. İlk olarak, lazerin odak hacmi içerisindeki D moleküllerinden bir referans floresans seviyesi oluşturmak için örneğe düşük yoğunluklu bir lazer ışını gönderilir.

Ardından, odak hacmi içindeki boya moleküllerinin bir kısmını fotobezleme (photobleaching) amacıyla kısa süreli, yüksek yoğunluklu bir lazer flaşı gönderilir. Son olarak, lazer ışını önceki düşük yoğunluk seviyesine indirilir ve fotobezlenmiş moleküller dışarı doğru difüze olurken yerlerini odak hacminin dışından gelen hâlâ floresan özellik gösteren moleküllerin almasıyla floresans izlenir. Elde edilen zamana bağlı floresans eğrisi, difüzyon katsayısını belirlemek için analiz edilir.

Merhaba, ben Rochester Üniversitesi Biyomedikal Mühendisliği Bölümü'ndeki Edward Brown Laboratuvarı'ndan Kelly Sullivan. Bugün sizlere çok fotonlu fotobleyking sonrası floresans geri kazanımının nasıl gerçekleştirileceğini göstereceğiz. Laboratuvarımızda hem in vitro hem de in vivo biyolojik sistemlerdeki difüzyonu incelemek için bu tekniği kullanıyoruz.

Haydi başlayalım. Başlamak için istenen lazer dalga boyunu ayarlayın ve fotomültipliyer tüpün veya PMT'nin önüne uygun filtreyi yerleştirin. Ardından, pcal hücresinin zarar görmesini önlemek için lazer gücünü 200 milliwatt veya altına ayarlayın.

pcal hücresinin yukarısında, dört rakamı şeklinde konumlandırılmış iki ayna bulunmaktadır. Bu aynalar, lazer ışınının pcal hücresi boyunca hizalanması için gerekli ve yeterlidir. pcal hücresi bias kontrolöründeki voltaj ofsetini sıfıra ayarlayın, lazerin ön ve arka pencerelerde ortalanacak şekilde pcal hücresi üzerinden geçen lazer yolunu düzenleyin.

Işını ön pencerede ortalamak için şekil dörtteki üst akış aynasını, arka pencerede ortalamak için ise şekil dörtteki alt akış aynasını kullanın. Şimdi, pcal hücre kristali üzerindeki voltajı maksimum değere ayarlayın. Uygun değer dalga boyuna bağlıdır ve pcal hücre kullanım kılavuzunda bulunabilir.

pcal hücresinin üst kısmında bulunan şekilde dörtteki aynaları, pcal hücresinden gelen çıkış gücü maksimize olana kadar ayarlayın. Şimdi kristal üzerindeki voltajı sıfıra getirin ve pcal hücresinden gelen çıkış gücünü minimize etmek için bias kontrolöründeki voltaj ofsetini ayarlayın. pcal hücresine gelen lazer gücünü deney için gereken değere geri getirin.

Şimdi mikroskoba geçerek, standartlaştırılmış floresan bir örneğe düzgün bir görsel odaklama yapın. Burada fikse edilmiş floresan polen taneleri kullanıyoruz. Odaklama tamamlandığında mikroskobu kapatın ve pcal hücre kristali üzerindeki voltajı değiştirerek lazer gücünü örneğin görüntülenmesi için uygun bir seviyeye ayarlayın.

Son olarak, ışıkları kapatın ve PMT'yi açın. Standardize edilmiş örneğin tekrarlı görüntü taramasını başlatın ve örneğin net bir görüntüsü elde edilene kadar pcal hücresinin çıkışındaki aynaları ayarlayın. Şimdi, örnek içindeki odak noktasında güvenli monitör güçlerini belirleme konusuna bakalım.

Bu videonun amacı doğrultusunda, bir lam üzerindeki çukura yerleştirilmiş ve lamel ile kapatılmış sulu boya örneği kullanacağız. Lazeri, örnek içinde floresan oluşturmak için düşük ancak makul bir güce ayarlayın. Mikroskobu kapatın ve PMT'den gelen çıkışı foton sayıcısına yönlendirin.

Işıkları kapatın, PMT'yi açın ve mikroskop yazılımında nokta taramasına (point scan) başlayın. Foton sayacını, beklenen floresan geri kazanım süresinden çok daha uzun bir zaman ölçeğinde entegre edecek şekilde ayarlayın ve makul sayıda veri noktası kaydedin. Gücü artırın ve bir dizi foton sayım verisi daha alın.

Foton sayısındaki artış belirgin şekilde azalana kadar gücü artırmaya devam edin. Güç artış grafiğinde, foton sayısının logaritması güç logaritmasının bir fonksiyonu olarak değerlendirilir. Eğiminin ikiden herhangi bir sapma göstermesi, ağarma (bleaching) olduğunu belirtir.

İzleme sırasında, bu kesme değerinin altında olan makul bir izleme gücü seçin. Şimdi, çok kanallı sayıcı ve darbe üreteci için giriş parametrelerini belirleyelim. Darbe üreteci üzerinde.

Ön eğitim süresini beklenen yarı iyileşme süresinin bir ila iki katı, ağartma süresini ise ölçekleyici üzerindeki beklenen yarı iyileşme süresinin 10'da biri olarak ayarlayın. Bin genişliğini yaklaşık olarak ağartma süresinin yarısına ayarlayın ve kayıt başına bin sayısını, seçilen bin genişliği ile kayıt başına bin sayısının çarpımı beklenen tam iyileşme süresinden daha büyük olacak şekilde belirleyin. Ön ağartma ve ağartma sürelerini ekleyerek darbe jeneratörüne dönün ve ön ağartma ile ağartma dizisinin frekansını, bin genişliği ile kayıt başına bin sayısının çarpımının tersinden biraz daha küçük bir değere eşitleyin.

Son olarak, seçtiğiniz monitör gücündeki sinyal yoğunluğuna göre skalerdeki tarama başına kayıt sayısını ayarlayın. Şimdi monitör gücünü güvenli bir seviyeye getirin ve ağartma gücünü, monitör ağartma testi sırasında belirlenen ağartma eşiğinin yaklaşık 200 milliwatt üzerine ayarlayın. Bu güçlerin her ikisi de AVO hücresi kristal mühürü boyunca farklı voltajlar olarak ayarlanır; ardından mikroskobun ışıkları kapatılır.

PMT'yi açın. Görüntüleme yazılımında bir nokta taraması başlatın. Ardından darbe jeneratörünü ve sayacı başlatın.

Ortaya çıkan geri kazanım eğrisini analiz etmek için üç önemli noktayı işaretleyin. Ağartma öncesi floresan, ağartma hemen sonrası floresan ve veri setinin sonundaki floresan. Yarı geri kazanım süresini daha iyi tahmin etmek için ağartma öncesi ve hemen sonrası floresan değerlerini kullanın.

Şimdi, önceki adımlarda belirtilen kuralları kullanarak preble bleach (ön ağartma) ve begin width (başlangıç genişliği) sürelerinin değerlerini güncelleyin. Yeni bir eğri alın ve sonuçtaki eğri güçlü bir ağartma ve pürüzsüz bir toparlanma sergileyene kadar parametreleri ince ayarla düzenlemeye devam edin. Ağartma derinliği parametresinin logaritmasını, gücün logaritmasının bir fonksiyonu olarak grafikleyerek eksitasyon satürasyonunu kontrol edin.

Eğim değerinin ikiden herhangi bir sapma göstermesi, eksitasyon saturasyonuna işaret eder. Güçlü bir ağartma sağlayan ancak saturasyona neden olmayan bir ağartma gücü seçin. Son olarak, uygun parametreler belirlendikten sonra, ilgilendiğiniz örneğin çok fotonlu fotobleaching sonrası floresans geri kazanımı veya MP FP eğrilerini almaya devam edin.

Şimdi, hem ham MP FRAP verilerinin hem de yayılım katsayılarının belirlenmesi için uydurulmuş normalize edilmiş bir MP F FRAP eğrisinin temsili sonuçlarını göstereceğiz; ham MP F FRAP verileri güçlü bir ağartma ve pürüzsüz bir geri kazanım sergilemektedir. Verilere uydurma işlemi için, verilerin ikinci yarısında tam geri kazanım raporlanmıştır. İlk olarak geri kazanımı ortalama ağartma öncesi floresansa normalize ederiz ve ardından doğrusal olmayan en küçük kareler uydurması gerçekleştiririz.

Uygun modelle ilgili olarak. Her iki veri seti de sulu floresein içinde alınmış olup difüzyon katsayılarını vermektedir. Literatürle tutarlı olarak, size çok fotonlu fotobleyking sonrası floresans geri kazanımı deneyinin nasıl gerçekleştirileceğini göstermiş olduk.

Bu prosedürü uygularken, özellikle ağartma süresi ile ağartma ve izleme güçlerini protokolde tanımlanan güvenli sınırlara ayarlayarak dikkatli olmanız önemlidir. İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.