Rhesus Makak maymunlarının Hücresel Bağışıklık Tepkisi Multicolor Sitometrisi Analizleri
22 Nisan 2010
Biz toplam bellek altkümelerini rhesus makakların CD4 + ve CD8 + T hücreleri, HIV / AIDS aşısı çalışmaları için ideal bir model gibi ayrıntılı fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyonu için çok renkli flow sitometri yararını göstermektedir.
Bu video, periferik kan mononükleer hücrelerinin veya pbmc'lerin stimülasyonu ve boyanması prosedürünü göstermektedir. Çok renkli akış sitometrisi analizi için, tam kandan izole edilen pbmc'ler doku kültürü plaklarına yerleştirilir. Hücreler, bir bağışıklık yanıtı oluşturmak için kimyasal veya biyolojik olarak stimüle edilir.
Stimülasyonun ardından, eksprese edilen yüzey belirteçlerine göre hücre tiplerini tanımlamak için bir antikor kokteyli eklenir. Ardından hücreler permeabilize edilir ve hücre içi sitokin ekspresyonunu saptamak için farklı bir antikor kokteyli eklenir; sonrasında, PBMC'lerin spesifik alt kümeleri için sitokin profillerini belirlemek amacıyla hücreler akış sitometrisi ile analiz edilir. Merhaba, ben Teksas Üniversitesi MD Anderson Kanser Merkezi İmmünoloji Bölümü'nde Dr. Jagan SAS'ın laboratuvarından Amy Courtney.
Merhaba, ben de laboratuvardan Hong. Bugün size T-hücre yanıtlarının çok renkli sitometri analizini göstereceğiz. Laboratuvarımızda, Rhesus Macaca'lardaki hücresel bağışıklık yanıtlarını incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz.
Öyleyse başlayalım. Trian Blue boya dışlama yöntemini kullanarak, Reuss Maca'dan alınan pbmc'lerin canlı hücre sayısını belirlemek için bir hemo sitometre kullanarak bu protokole başlayın. İşlemleri laminar akışlı bir kabinde gerçekleştirin reus.
Spesifik olmayan stimülasyon için hücreleri, 96 kuyucuklu doku kültürü plağının her kuyucuğuna 100 mikrolitre hücre süspansiyonu gelecek şekilde, mililitre başına 10 milyon hücre konsantrasyonunda komple medyuma süspande edin. Ardından, toplam hacmi 0,2 mililitreye tamamlamak için, final konsantrasyonu 50 nanogram/ml PMA ve 500 nanogram/ml CIN olacak şekilde PMA ve CIN içeren 100 mikrolitre medyum ekleyin; negatif kontrol kuyucuklarına ise her birine sadece 100 mikrolitre komple medyum ekleyin. Hücreleri, nemlendirilmiş %5 karbondioksit atmosferinde, 37 °C'de 1,5 saat boyunca inkübe edin.
Kültüre, nihai konsantrasyonu 10 µg/mL olacak şekilde felden A ekleyin ve 4,5 saat daha inkübe edin. Felden A, immün boyama ile görünürlüğü artırmak için gold G cihazındaki trapp sitokinlerine eklenir; stimülasyon sonrası ortamı uzaklaştırmak için santrifüjleyin ve ardından 200 µL soğuk akış yıkama tamponu ekleyip düşük hızda santrifüjleyerek yıkayın. Bu yıkama işlemini tekrarlayın, ardından 50 µL akış yıkama tamponu içerisinde yeniden süspande edin.
Hücreler artık, yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücrelerin bulunduğu her bir kuyucuğa yüzey markerlerinin ekspresyonu için boyanmaya hazırdır. Üretici talimatlarına göre hazırlanan bir mikrolitre canlı-ölü sabitlenebilir aqua floresan reaktif boya ekleyin. Hücreler inkübe olurken, karanlıkta dört derece Celsius'ta 30 dakika boyunca inkübe edin.
Mikro tüpler içerisinde, hücreler için kullanılacak boyama solüsyonlarını hazırlayın. İlk olarak, uygun miktarlarda şunları içeren bir boyama kokteyli hazırlayın: Titre edilmiş floresan işaretli monoklonal antikorlar; anti CD3 PE SCI 7, anti CD8 Alexa 700, anti CD28 per CCP SCI 5.5, anti CD95 APC ve anti CD4 Pacific Blue; Flow Wash Buffer.
Ardından, her bir floresan konjuge antikorun tek başına tek renkli boyama olarak hazırlandığı tüplerle, her bir boyanın diğer dedektörlere olan taşma katsayılarını belirlemek için kullanılacak kompanzasyon kontrollerini hazırlayın. Son olarak, ilgilenilen reaktif dışındaki tüm reajenleri birleştirerek floresan eksi bir veya FMO boyamalarını hazırlayın. Bu işlem, tam boyanmış örneklerdeki verileri ve otofloresans seviyelerini tekrarlayarak, pozitif ve negatif popülasyon arasındaki sınırı belirlemek için kullanılacaktır.
Hücreler canlı-ölü boyasında inkübe edildikten sonra, fazla boyayı uzaklaştırmak için onları bir kez soğuk akış yıkama tamponu ile yıkayın ve yıkama tamponunu aspire edin. Ardından hazırlanan boyama çözeltilerini ekleyin. Hücreleri dört derece Celsius'ta, karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe edin.
Fazla antikorları uzaklaştırmak için boyanmış hücreleri soğuk akış yıkama tamponu ile yıkayın. Ardından 100 µL BD fiksasyon permeasyon çözeltisi ekleyerek en az 10 dakika bekletin. Hücreleri, kullanılana kadar karanlıkta, dört °C'de 24 saate kadar saklayın veya hücre içi sitokinleri işaretlemek için hücre içi sitokin markalama adımına geçin.
Öncelikle hücreleri 100 µL 1X perm yıkama tamponu ile permeabilize edin. Hücreler inkübe olurken 4 °C'de, karanlıkta 10 dakika boyunca bekletin. Boyama antikorlarını, kompanzasyon kontrollerini ve FMO kontrollerini, daha önce yapıldığı gibi 1X perm yıkama tamponu içinde hazırlayın.
Hücreler 10 dakika inkübe edildikten sonra, santrifüjle çöktürün ve 1x perm yıkama tamponunu uzaklaştırın. Uygun boyama antikorlarını ekleyin. Ardından, hücreleri ve antikorları 4 °C'de, karanlıkta 60 dakika boyunca inkübe edin.
Hücreleri permeasyon solüsyonu ile iki kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, hücreleri sabitlemek için DPBS içinde %1 paraformaldehitte yeniden süspande edin. Hücreleri, kullanılana kadar 24 saate kadar dört derece Celsius'ta, karanlıkta saklayın.
Hücreler boyandıktan sonra, FACS analizi gerçekleştirmek için bir LSR II akış sitometresi veya CytoDP akış sitometresi kullanın. Ardından verileri FlowJo veya benzeri bir yazılım kullanarak analiz edin. Rhesus maca'daki PBMC kompozisyonu, FACS analizi kullanılarak belirlenmiştir.
Bu şekil, temsilci bir hayvandan alınan farklı T hücresi alt kümelerinin analizi için kullanılan kapılama şemasını göstermektedir. Lenfositler önce ileri saçılım FSC'ye karşı yan saçılım SSC üzerinden kapılanmış, ardından canlı lenfositler SSC ve AQUA negatif popülasyona göre belirlenmiştir. Daha sonra T hücreleri CD3 ekspresyonu ile tanımlanmış; CD3 pozitif T hücresi popülasyonu içerisinde CD4 pozitif, CD8 negatif ve CD4 negatif, CD8 pozitif popülasyonlar da belirlenmiştir.
CD4 pozitif ve CD8 pozitif T hücreleri, CD28 ve CD95 ekspresyonuna dayalı olarak naive, merkezi bellek ve efektör bellek hücreleri şeklinde farklı alt kümelere ayrılmıştır. Bu şekil, uyarılmamış ve PMA/ionofor ile uyarılmış CD4 pozitif T hücreleri ve alt kümelerindeki interferon gamma ve IL-2 üretimini göstermektedir.
Stimülasyonla ortaya çıkan belirgin sitokin profillerine dikkat edin. Her alt kümede. Size pbmc'lerin çok renkli akış sitometrisi analizinin nasıl yapılacağını göstermeliyiz.
Bu prosedürü uygularken, hem tek renkli kompanzasyon kontrollerinin hem de floresan eksiltmeli (FMO) kontrollerin hazırlandığını hatırlamak önemlidir. Akış sitometrisi verilerinin doğru analizi için bu iki kontrolün de gereklidir. Kompanzasyon kontrollerinin seçimi hakkında daha fazla bilgi için lütfen yazılı protokolümüze bakınız.
Ayrıca, floresan işaretli antikor kullanırken, örnekleri ışık maruziyetinden korumak için üzerlerini örtmenin önemli olduğunu lütfen unutmayın. Şimdilik bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu video, çok renkli akış sitometrisi analizi için periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC) stimülasyonu ve boyanması prosedürünü göstermektedir. Çalışma, HIV/AIDS aşı araştırmaları için bir model olan rhesus makaklarında CD4+ ve CD8+ T hücresi alt kümelerinin fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyonuna odaklanmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- İmmünoloji
- Akış Sitometrisi
- HIV/AIDS Araştırmaları
Arka Plan
- HIV/AIDS çalışmalarında model olarak Rhesus makakları kullanılır.
- T hücresi alt kümelerinin anlaşılması, aşı geliştirme süreci için kritik öneme sahiptir.
- Çok renkli akış sitometrisi, bağışıklık hücrelerinin detaylı analizine olanak tanır.
- PBMC'ler, bağışıklık yanıtlarının incelenmesinde temel bileşenlerdir.
Çalışmanın Amacı
- T hücrelerinin toplam ve hafıza alt kümelerini karakterize etmek.
- Detaylı immün profilleme için çok renkli akış sitometrisini kullanmak.
- HIV/AIDS bağlamında immün yanıtların anlaşılmasını geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Tam kandan PBMC izolasyonu.
- PBMC'lerin kimyasal veya biyolojik stimülasyonu.
- Hücre tiplerini ve yüzey belirteçlerini tanımlamak için antikor kokteyllerinin kullanımı.
- Akış sitometrisi kullanılarak sitokin profillerinin analizi.
Ana Sonuçlar
- Analiz için PBK'ların başarılı bir şekilde stimülasyonu ve boyanması.
- Yüzey belirteçlerine dayanarak spesifik T hücresi alt kümelerinin tanımlanması.
- Hücre içi sitokin ekspresyonunun karakterizasyonu.
- HIV/AIDS ile ilgili bağışıklık tepkilerine dair içgörüler.
Sonuçlar
- Çok renkli akış sitometrisi, T hücresi analizi için etkilidir.
- Rhesus makakları, HIV aşı araştırmaları için değerli bilgiler sağlar.
- T hücresi dinamiklerini anlamak, etkili tedaviler geliştirmek için temel teşkil eder.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektör İçin Yönetici Özeti ve Uygunluk
Çok renkli akış sitometrisi, HIV aşı geliştirme süreci için kritik bir preklinik model olan rhesus makaklarında T-hücre alt kümelerinin hassas fenotipik ve fonksiyonel profillemesini sağlar. Bu yaklaşım, sitokin üreten immün yanıtları nicelleştirerek hedef doğrulamayı destekler ve erken keşif aşamasındaki devam/durdur kararlarına bilgi sağlar. Yöntem, antijene özgü stimülasyonu, tanımlanmış hafıza popülasyonlarındaki ölçülebilir hücre içi sitokin çıktıları ile ilişkilendirerek öngörü güvenini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Stimülasyon sonrası CD4+ ve CD8+ T hücresi alt kümelerinde IFN-γ ve IL-2 üretimini ölçerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: İmmün hedef doğrulamadaki mekanistik belirsizlikleri gidermek için hücre içi sitokin ekspresyonunun kalitatif ve kantitatif ölçümlerini sağlar.
- Bilimsel Değer: Aşılanmış hayvanlardan alınan PBMC örneklerindeki düşük miktarlı antijenle spesifik T hücresi fraksiyonlarının hassas tespiti yoluyla biyolojik risk azaltmayı destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Tekrarlanabilir immün profilleme için standart boyama ve stimülasyon protokolleri oluşturarak, valide edilmiş biyolojik sistemleri sonraki iş akışlarına hazırlar.
- Operasyonel Değer: Doğru popülasyon kapılamasını (gating) sağlamak için kompanzasyon kontrolleri ve FMO kontrolleri kullanarak, analiz standardizasyonu ve tekrarlanabilirlik sorunlarını çözer.
- Bilimsel Değer: Naif, merkezi hafıza ve efektör hafıza T-hücresi alt kümelerinde sitokin profillerinin tespitini mümkün kılarak tarama hazırlığını vurgular.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Rhesus makaklarında hücre içi sitokin ölçümlerini HIV patogenezi ve aşı kaynaklı bağışıklık yanıtları ile ilişkilendirerek hastalığın önemini tartışır.
- Operasyonel Değer: PBMC stimülasyon sonuçlarını fonksiyonel T-hücresi karakterizasyonu ile bağlayarak, keşif sürecinden preklinik doğrulamaya kadar olan sürekliliği tanımlar.
- Bilimsel Değer: Aşı immünojenite değerlendirmesi için sitokin üretimini fonksiyonel bir okuma olarak kullanarak, öngörücü risk azaltma değerine odaklanır.
Pipeline ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, erken dönem immün profillemeden öncü bileşik tanımlamaya kadar keşif sürekliliği içinde yer alarak, enfeksiyöz hastalık modellerinde hipotez testlerini ve yolak aydınlatmasını destekler.
- Keşif Biyolojisi: Yöntemin, PMA/ionomycin veya antijene özgü stimülasyon sonrası belirli T hücresi alt kümelerinde sitokin üretimini nicelleştirerek hipotez testlerini nasıl desteklediğini açıklar.
- Tarama: Standartlaştırılmış stimülasyon, yüzey ve hücre içi boyama ve PBMC örneklerinin akış sitometrik analizi aracılığıyla assay hazırlığını tanımlar.
- Analitikler: Farklı koşullar ve alt kümeler arasında immün yanıtların karşılaştırılmasına olanak tanıyan IFN-γ ve IL-2 üretim frekansları gibi ölçümleri vurgular.
- Translasyonel Araştırma: Rhesus makaklarında vaccine kaynaklı T hücresi yanıtlarını, HIV vaccine geliştirmesiyle ilgili fonksiyonel immün profillemeye bağlayarak yöntemi preklinik sürekliliğe bağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Yöntemi, vaccine adayları ve adjuvan formülasyonları genelinde boylamsal immün izleme için yeniden kullanılabilir bir yetkinlik olarak çerçeveler.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Öngörücü güven, hedef doğrulaması, T-hücre aracılı immün yanıtlardaki mekanistik belirsizliğin azaltılması.
- Operasyonel Değer: İmmün profilleme için çok renkli akış sitometrisi analizlerinin standardizasyonu, tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği.
- Stratejik Değer: Aşı geliştirme programlarında daha iyi devam/durdur kararları, sermaye verimliliği ve geç evre biyolojik risklerin azaltılması.
- Portföy Etkisi: Preklinik modellerdeki kantitatif sitokin profillerine dayalı, riske göre ayarlanmış önceliklendirme ve ilerletme kararları.
Uygulama Hususları
- Çok renkli immünofenotipleme için akış sitometrisi panel tasarımı, kompanzasyon ve kapılama stratejisi konularında gerekli bilimsel uzmanlık.
- Akış sitometresi (örneğin, LSR II) ve yüksek boyutlu veri analizi için yazılım (örneğin, FlowJo) dahil olmak üzere enstrümantasyon ve analitik altyapı ihtiyaçları.
- Laboratuvarlar arası stimülasyon koşulları, antikor titrasyonu ve kontrol kurulumu (tek renkli ve FMO) için ekipler arası standardizasyon gereklilikleri.
- İnsan dışı primat PBMC'leri için stimülasyon konsantrasyonlarının ve inkübasyon sürelerinin optimizasyonu dahil olmak üzere model sistemler arası adaptasyon değerlendirmeleri.
- Kaynak materyal ile desteklenen pratik sınırlamalar: floresan antikorlar için ışık korumasının gerekliliği ve çok renkli panellerde sızıntıyı (spillover) minimize etmek için dikkatli titrasyon.
