Hemaglütinasyon Testi kullanarak Reaktivite ve Serum Titre Belirlenmesi

Hemaglütinasyon analizi kullanılarak serum için reaktivite ve titrenin belirlenmesi. Glütinasyon, çözünür antikorlar ile partiküler antijenler arasında gerçekleşen bir reaksiyondur. Bunlar hücreleri veya taşıyıcı molekülleri içerebilir.

Taşıyıcının yüzeyindeki epitoplar, bir antikorun bağlanmasına ve taşıyıcıyı birbirine çapraz bağlamasına olanak tanıyarak antijen antikor kompleksi adı verilen kompleks bir örgünün oluşumuna yol açar. Hemaglütinasyon, antikorların partikül antijen görevi gören kırmızı kan hücrelerine bağlandığı spesifik bir aglütinasyon formudur. Kırmızı kan hücreleri, hem kolayca temin edilebildikleri hem de sonuçlar çıplak gözle kolayca görülebildiği için kullanışlı hedeflerdir.

Serum örnekleri seri olarak seyreltilir ve ardından 96 kuyucuklu U-taban plakaya yerleştirilir. Daha sonra kırmızı kan hücreleri süspansiyonu eklenir. Yüksek konsantrasyonda bulunan antikorlar kırmızı kan hücrelerine bağlandığında geniş bir ağ yapısı oluşur.

Bu kafes yapı yerçekimiyle çöktükçe, ubo plakasının şeklini alır. Yukarıdan bakıldığında, geniş bir kırmızı kan hücresi tabakası görülür. Bu, pozitif bir hemaglütinin reaksiyonudur.

Antikor seviyeleri düşük olduğunda, ağ yapısı oluşamaz ve kırmızı kan hücreleri UBO plağının şeklini alarak tabanda toplanır ve küçük bir pellet oluşturur. Bu, negatif bir hemaglütinasyon reaksiyonudur. Bu diyagram pozitif bir reaksiyonu göstermektedir.

Hücreler çökerken bir örgü oluşturur ve U tabanlı plakanın şeklini alırlar. Solda ve sağda, geniş bir kırmızı kan hücresi tabakasının görüldüğü üstten görünüme bakıyoruz. Orta düzeyde antikor mevcutsa, bazı harf oluşumları gözlemlenecektir.

Hemaglütinasyon ayrıca farklı serum örneklerinin bilinen antijene karşı reaktivitesinin test edilmesine olanak tanır. Serum örneğinin titresi de belirlenebilir. Titre, pozitif reaksiyonun görüldüğü son dilüsyondur.

Normal şartlarda, serum örneğindeki antikor konsantrasyonu ne kadar yüksekse, titer o kadar yüksek olur. Bu diyagram negatif bir hemaglütinasyon reaksiyonunu göstermektedir. Kırmızı kan hücrelerini çapraz bağlamak için yetersiz antikor mevcuttur.

Hücreler yerçekimi ile çökerken, kuyucuğun kenarından aşağı kayarak dipte sıkı bir pelet oluştururlar. Sağdaki diyagram, kırmızı kan hücrelerinin yukarıdan görünümünü göstermektedir. Bu deney için, 1 adet 96 kuyucuklu U tabanlı plakaya ihtiyacınız olacak.

Hücrelerin bir pelet şeklinde çökelmesini engelleyip yorumlamayı imkansız hale getireceği için düz tabanlı plakalar yerine U tabanlı plaka kullanılması esastır. Her sıra kuyucuğuna 50 µL serum, %1'lik Riva hücre süspansiyonu ve tek seferlik verone tampon tuzlu solüsyonu iletebilen bir pipet kullanılır. 1'den 12'ye kadar, 50 µL roal tampon tuzlu solüsyonu iletin.

Bu, seyreltici olarak kullanılır. Şimdi, A1 kuyucuğuna 50 µL serum ekleyin. Bu, iki katlık seyreltme serinizdeki ilk örneğinizdir.

Perpet kullanarak serum örneğinin iyice karıştırıldığından emin olun. Karıştırıldıktan sonra, A1 kuyucuğundan 50 µL alarak A2 kuyucuğuna aktarın. Bu, ikinci 1:2 dilüsyonunuzdur ve böylece dört katlık bir dilüsyon elde etmiş olursunuz.

Bu dilüsyon serisine 3. kuyucuktan 11. kuyucuğa kadar devam edin. 12. kuyucuğa herhangi bir serum koymayın, çünkü burası royal buffer saline negatif kontrolünüzdür. Şimdi, iyice karıştırılmış olan %1'lik Riva hücre süspansiyonunuzdan 50 µL alarak A1 ile A12 arasındaki kuyucuklara aktarın.

Hücreler eklendikten sonra, plakayı kapatın ve numuneler ile hücrelerin karıştığından emin olmak için plakaya hafifçe vurun. Ardından 37 °C'de 60 dakika boyunca inkübe edin. Nemlendirilmiş bir inkübatör kullanımı uygundur.

60 dakikalık inkübasyon süresi boyunca, antijen antikor etkileşimleri gerçekleşecek ve hücreler çökmeye başlayacaktır. İzlediğiniz video görüntüleri, 60 dakikalık sürenin tamamının hızlandırılmış çekimidir. Bu görüntü, beşten onuncu kuyucuğa kadar olan kısmın yakın çekimidir.

Burada VBS kontrolünüz olan 12 numaralı kuyucuğu zaten inceledik. Hücreler sıkı bir pellet oluşturmuştu, bu da assay'in uygun şekilde çalıştığını göstermekteydi. Beş ve altı numaralı kuyucuklar, pozitif hemaglütinasyon örnekleridir.

Yedi numaralı kuyucuk orta düzeyde aglütinasyon sonucu için bir örnektir; sekiz, dokuz ve 10 numaralı kuyucuklar ise hemaglütinasyon açısından negatiftir. Bu sonuca göre titre, pozitif reaksiyonun gözlendiği son kuyucuk olduğu için yedi numaralı kuyucuğun dilüsyonuna göre belirlenir.