Kararlı Konsantrasyon Degradeler Bakteriyel Kemotaksis miktarının mikroakışkan Aygıt

E Coli RP 4 37, tanımlanmış uzamsal konsantrasyon gradyanlarına maruz kaldıkları bir kemotaksi cihazına aktarılır. Hazneye giren hücreler, konsantrasyon gradyanının orta noktası ile karşılaşır. Sinyalin bir çekici mi yoksa itici mi olarak algılandığına bağlı olarak bakteriler, konsantrasyon gradyanı boyunca hızla yukarı veya aşağı doğru hareket ederler.

Merhaba, ben Texas A&M Üniversitesi Moleküler Sistem Biyoteknolojisi Laboratuvarı ve Kimya Mühendisliği Bölümü'nden Derek Engler. Bugün size mikroakışkan bir cihazda bakteriyel kemotaksisin incelendiği bir prosedürü göstereceğiz. Laboratuvarlarımızda bu prosedürü, E. coli RP 4 37'nin nikel sülfat konsantrasyon gradyanında nasıl göç ettiğini çalışmak için kullanıyoruz.

Hadi başlayalım. Akışkan katmanı ve kontrol katmanı, SU-8 kalıptan Polimetil SUBOXANE veya PDMS'in replika kalıplama yöntemiyle üretilir. Bu prosedüre başlamak için, PDMS ön polimerini ve çapraz bağlayıcıyı 10'a bir ağırlık oranında karıştırın.

Hava kabarcıkları giderilene kadar karışımı bir desikatörde bir saat boyunca degaze edin. PDMS karışımı hazır olduğunda, SU eight master'ı bir Petri kabına yerleştirin ve karışımı istenen kalınlığa ulaşana kadar SU eight master'ın üzerine dikkatlice dökün. PDMS'in kürlenmesi için PDMS ve SU eight master kalıbını içeren Petri kabını 80 °C'de iki saat boyunca ısıtın.

İki saat sonra, kürlenmiş PDMS kaplı SU-8 master'ı ısıtıcı plakadan çıkarın ve PDMS kalıbını SU-8 master'dan soyun. İstenen yapı PDMS kalıbın içine gömülmüş olacaktır; 20 gauge küt uçlu iğne kullanarak PDMS kalıba, gradyan jeneratörüne, hücre girişine ve hücre çıkışına gidecek tüpler için dört delik açın. Artık PDMS cihazını birleştirmeye ve PDMS cihazını bağlamaya hazırız.

İlk olarak, cam bir mikroskop lamını izopropanol ile temizleyin ve Airstream ile kurulayın. Ardından, PDMS kalıbı ve cam lamı bir plazma aşındırıcıda yaklaşık 30 saniye boyunca oksijen plazmasına maruz bırakın. PDMS kalıbı cam lam ile temas ettirin. Temas halindeki lamı ve PDMS kalıbı bir ısıtıcı tabla üzerinde 15 dakika boyunca 65 °C'ye ısıtın.

PDMS cihazını monte etmek için, mikroskop kurulumuna bağlı olarak gerekli uzunlukta tüpü bir jilet yardımıyla 45 derecelik açıyla kesin. Ardından bir pens kullanarak, tüpün bir ucunu cihazda açılmış dört delikten birine yerleştirin.

Hortumun diğer ucuna küt uçlu 30 gauge iğne göbeği yerleştirin. Hortum ve iğne göbeği yerleştirme işlemini geri kalan tüm delikler için tekrarlayın. Üç mililitrelik bir şırıngaya bir mililitre chemo taxes, tampon çözelti veya CB yükleyin.

Şırıngadaki havanın çıkarılmasına dikkat edin. Bir pipet kullanarak çıkış iğne göbeğine CB ekleyin ve hava kabarcıklarını gidermek için iğne göbeğine hafifçe vurun. Üç mililitrelik şırınganın ucundan bir miktar CB dışarı itin ve şırıngayı, hava hapsolmadan iğne göbeğine bağlayın.

Kalan tüm iğne göbekleri CB ile dolana kadar, CB'yi cihazdan geçirin. Bu işlem hava kabarcıklarının çoğunu giderecektir. Ardından, iki adet 500 µL'lik şırıngayı, test edilen kemo efektörün uygun konsantrasyonlarını içeren CB ile doldurun.

Yüksek hareketliliğe sahip bakteriler hazırlamak için şırınganın içeriğinden küçük bir damla dışarı iterek iğne göbeğindeki sıvı damlalarına temas ettirin ve hava kabarcığı oluşumunu engelleyerek şırıngayı takın. Kemotaksi deneyi için, GFP ekspresyon plazmidi taşıyan e coli RP 4 37'nin tripton broth veya TB içerisinde, 32 °C'de çalkalamalı olarak bir gece boyunca kültürünü büyütün. Ertesi gün, 250 mL erlenmeyer flask içindeki 20 mL TB kültürünü 600 nm'de yaklaşık 0,05 optik yoğunluğa ulaşana kadar inoküle etmek için bir gecelik kültürü kullanın.

Hücreler yaklaşık 0,35 ile 0,45 arasında bir OD 600 değerine ulaştığında, kültürü 32 °C'de çalkalayarak büyütün. Hücreleri düşük hızlı santrifüj ile hasat edin ve kanalın ortasında olması beklenen konsantrasyondaki kemo efektörü içeren CB içerisinde yaklaşık 0,35 OD 600 değerine gelecek şekilde yeniden süspande edin. Son olarak, GFP eksprese eden canlı hücrelere, yaklaşık 0,35 OD 600 değerinde RFP ile işaretlenmiş ölü hücreler ekleyin.

Bu ölü hücreler, meydana gelen herhangi bir migrasyonun akış etkilerinden kaynaklanmadığından emin olmak için dahili kontrol olarak kullanılacaktır. Hücre süspansiyonu artık kemotaksi deneyi için mikroakışkan cihaza yüklenmeye hazırdır. Kemotaksi deneyine başlamak için, hücre giriş iğne göbeğindeki CB'nin bir kısmını boşaltın ve hücre süspansiyonu ile doldurun.

50 µL'lik bir şırıngayı resüspande edilen hücrelerle nazikçe doldurun. Kamçıların kopması motiliteyi azaltabileceği için bu işlemi yavaşça yapın. Şırınga içeriğinden küçük bir damla dışarı itip bu damlayı iğne göbeğindeki sıvıya değdirerek ve şırıngayı takarak, 50 µL'lik şırıngayı daha önce gösterildiği gibi giriş iğne göbeğine sabitleyin; cihazı, görüntüleme için yüksek hızlı kamera ile donatılmış bir floresan mikroskobun tablasına yerleştirin.

Her iki giriş şırıngasını şırınga pompasına yerleştirin ve gradyan oluşacak ve hücreler tüpler boyunca akacak şekilde akışı başlatın. Hücreler kemotaksis odasına girdikten sonra, sistemin stabilize olması için yaklaşık 20 dakika bekleyin. Görüntüleme yapmadan önce, odanın uzunluğu boyunca farklı konumlardan canlı yeşil ve ölü kırmızı floresan görüntüleri toplayın.

Genellikle her konumda üç saniye aralıklarla 100 görüntü topluyoruz. Elde edilen floresan görüntüler, Image J veya metamorph gibi ticari olarak mevcut herhangi bir görüntü analiz programı veya MATLAB ile yazılmış basit kodlar kullanılarak analiz edilebilir. Bu örnekte, MATLAB kodlarını kullanacağız.

Görüntüdeki arka plan piksellerini belirlenen eşik piksel yoğunluğu aracılığıyla kaldırarak başlayın ve yoğunluğu eşik değerinden düşük olan tüm pikselleri silin. Bu işlem gürültüyü en aza indirir. Analizde, görüntünün merkezini belirlemek için ölü hücrelerin konumunu kullanın.

Bu, hücrelerin kemotaksi odasına girdiği ve herhangi bir migrasyonun olmadığı durumda tespit edilecekleri konumu temsil eder. Ardından, görüntüdeki canlı hücreleri belirleyin, görüntüyü kanallara ayırın ve her kanaldaki canlı hücre sayısını tespit edin. Önceki çalışmamızda, 10 50 µm genişliğindeki kemotaksi odası, her biri yaklaşık 16 µm genişliğinde olan 64 kanala ayrılmıştır.

Bu adımlar tüm görüntüler için tekrarlandıktan sonra, tüm görüntüler boyunca her kanal için toplam hücre sayılarının bir kısmı elde edilir. Bu, deney süresi boyunca her kanalda tespit edilen toplam hücre sayısını verir. Göç yönünü temsil eden kemotaksi bölüntü katsayısını veya CPC'yi hesaplayın.

Aşağıdaki adımları uygulayarak, ölü hücrelerin yüksek konsantrasyonlu (sağ) ve düşük konsantrasyonlu (sol) taraflarında yer alan her bir hücreye sırasıyla artı bir ve eksi bir çarpanı atayın. Tüm çarpılmış değerleri toplayın ve toplam tespit edilen hücre sayısına göre normalize edin. Hücrelerin göçünü kat edilen mesafeye göre ağırlıklandıran kemotaksi göç katsayısını veya CMC'yi hesaplayın.

En uzak yüksek konsantrasyon konumu olan kanal 64'e hareket eden bir hücreye artı bir ağırlık faktörü verilirken, yüksek konsantrasyon tarafına yarı yola kadar hareket eden bir hücreye artı 0.5 ağırlık faktörü verilir. En uzak düşük konsantrasyon konumuna hareket eden hücre ise eksi bir ile ağırlıklandırılır. Tüm ağırlıklı hücre sayılarının toplamı alınır ve CMC'yi oluşturmak için hücre sayısına normalize edilir.

Bu grafik, mikroakışkan cihazda floresein izotiyosiyanat kullanılarak oluşturulan lineer bir konsantrasyon gradyanını veya profilini göstermektedir. Konsantrasyon gradyanının oluşumu, bu şekilde mavi ve sarı renkli boyalar kullanılarak gösterilmiştir. Hücre girişi CA olduğu için içinden akış gerçekleşmemiştir ve mavi ile sarı arasında bir renk yelpazesinin oluştuğu görülebilmektedir.

Burada, E. coli RP 4 37'nin cihaz içinde 0 ila 100 µM L aspartat veya 0 ila 225 µM nikel sülfat gradyanına maruz bırakıldığı temsili bir kemotaksi deneyinden alınan yalancı renkli görüntüler yer almaktadır. Canlı yeşil bakterilerin L aspartata doğru veya nikelden uzağa göçü, 30 dakika boyunca her 2,5 saniyede bir görüntülenmiştir. Kırmızı ile gösterilen ölü bakteriler, cihazdaki akış etkileri için kontrol olarak kullanılmıştır.

Gradyan yokluğunda mikroakışkan cihazdaki RP 4 37'nin uzamsal dağılımı, aspartat gradyanına ve nikel sülfat gradyanına verdiği yanıtla karşılaştırmalı olarak bu grafikte gösterilmiştir. Size, nikel sülfat gradyanındaki e coli RP 4 37'nin kemotaksisinin nasıl izleneceğini göstermiş olduk. Bu prosedür uygulanırken, yüksek motiliteye sahip bir alt popülasyonun kullanılabilmesi için hücrelerin vorteksleme işlemini en aza indirgemeyi hatırlamak önemlidir.

İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.