Eksplantlar gelen Yetiştirilen İlköğretim İnsan Bronşiyal Epitel Hücreleri

Bu makalede, yeni izole edilmiş insan bronşiyal segmentlerinden insan bronşiyal epitel hücrelerinin büyütülmesi ve genişletilmesine yönelik bir protokol tanımlıyoruz. Bu protokol; kodlama ve çizme, yüz milimetrelik kültür plakaları, bronşiyal dokunun onarılması, bronşiyal doku transplantatlarının açıklanması, siliyalı büyüyen insan bronşiyal epitel hücrelerinin pasajlanması ve transwell'ler üzerinde insan bronşiyal epitel hücreleri olmak üzere beş bölümden oluşmaktadır. Başlamadan önce, tüm adımların biyolojik güvenlik kabininde gerçekleştirildiğini unutmayın.

Aksi belirtilmedikçe, lütfen materyaller, reaktifler ve hazırlık bölümünü okuyun ve temel hazırlıkları yaptığınızdan emin olun. Aşağıdaki kodlama, stok çözelti kültürü, besiyeri, disosyasyon çözeltileri, kaplama ve çizme işlemleri; yüz milimetrelik kültür plaklarında, en uygun koşullarda gerçekleştirilmelidir.

Her şeyi steril tutun. Steril yüz milimetrelik kültür plaklarını ve kaplama solüsyonunu hazırlayın. BST pipetiyle, yüz milimetrelik plağın tabanını kaplamak için iki ml kaplama solüsyonu ekleyin ve plakla birlikte dairesel hareketlerle karıştırın.

Kaplama solüsyonunun plaka tabanını eşit şekilde kapladığından emin olun. Artan solüsyonu pipetle çekip ikinci bir yüz milimetrelik plakayı kaplamak için kullanın. Gereken plaka sayısı kadar işlemi tekrarlayın.

Gerekli plaka sayısı, doku eksplantlarının sayısına göre değişiklik gösterir. Kaplama solüsyonunun plakaların tabanını eşit şekilde kapladığından emin olun. Gösterildiği gibi.

Plakaları kapaklarıyla kapatın. Plakaların inkübatörde bir ila iki saat boyunca kurumasına izin verin ve bronşiyal doku eksplantasyonu öncesinde fazla solüsyonu aspire edin. Kullanılmayan kaplamalı kültür plakaları steril bir torbaya yerleştirilip daha sonra kullanılmak üzere dört derece Celsius'ta saklanabilir.

70% ethanol ile temizlenmiş sprey temizleyici, küçük, keskin makas, bistüri ve pens kullanın ve bistüri ile kuvvetle bastırarak plaka başına en az dört adet derin ve küçük XS oluşturacak şekilde BSC içinde çizikli kaplar hazırlayın. Çizikler yeterince derin olmazsa doku parçaları şırıngalara yerleşmeyecek ve yüzecektir. BSC dışında dokuyu bir P üç kabına yerleştirin. İzole edilen insan bronşiyal dokusunu Bss ile iyice yıkayın.

Bronş parçalarını açın. Dokuyu BS'ye getirin ve soğuk DM EM ham F 12 %1 antibiyotik antimikotik içeren steril yüz milimetrelik doku kültürü plağına aktarın. Dokuyu iki ila üç milimetrelik küp parçalar halinde kesmek için küçük keskin makas kullanın.

Pensle her bir X'in merkezine bir parça kesilmiş doku yerleştirin ve bastırın. Doku parçalarının veya X eksplantlarının plağa yapışması için birkaç saniye boyunca nazikçe bekleyin. Ardından, 10 ml komple medyumu yavaşça ekleyin. Medyum eklendikten sonra doku yüzeyde yüzüyorsa, pens kullanarak dokuyu X'in çıkıntılarına doğru itin veya yeni bir X oluşturun. Çıkıntılar yeterince derin değilse yeni X'ler oluşturmak gerekebilir.

Plakaları inkübatöre yerleştirin ve dokular transplantasyona hazır olana kadar her üç ila dört günde bir besiyerini değiştirin. Dokuların etrafında bir ila iki santimetrelik alanları kapsayacak şekilde yeterli epitel hücre geliştiğinde, bu işlem yaklaşık dört hafta sürer. Yüz milimetrelik kaplamalı ve çizilmiş plakalar kullanın.

Bazı doku eksplantları başarılı olmayabileceği için, plaka sayısı nakledilen doku parçalarının miktarına bağlıdır. Daha önceden kaplanmış ve dört derece Celsius'ta saklanmış plakalar kullanılıyorsa, kullanmadan önce oda sıcaklığına getiriniz. Bir penset yardımıyla dokuları orijinal plakadan dikkatlice alın, yeni plakanın merkez eksenine yerleştirin ve hafifçe bastırın. Dışa büyüme göstermeyen dokular atılmalıdır.

Dokunun plağa yapışmasını bekleyin. Birkaç saniye boyunca besiyeri ekleyin ve inkübe edin. X açıklaması için daha önce belirtilenleri ekleyin.

Böylece, her yüz milimetrelik doku kültürü plağı için iki ml tripsin ve EDTA stok çözeltisi kullanılır. Stok çözeltiyi altı ml steril 0,01 molar PBS ile seyreltin; iki ml stok çözeltisinin altı ml PBS ile karıştırılmasıyla tripsin için 250 µg/ml ve EDTA için 100 µg/ml nihai konsantrasyon elde edilir. Eksplantlar yeni bir plağa aktarıldıktan sonra, bir ila iki santimetrelik hücre halkaları bulunan plakalardaki medyumu aspire edin.

Her bir 100 mm'lik plakaya sekiz ml ılık seyreltilmiş drips ve edt çözeltisi ekleyin. Ardından 37 °C'deki inkübatöre 3 ila 15 dakika boyunca yerleştirin. Sık sık kontrol edin.

Tripsini çok uzun süre bekletmek hücrelere zarar verecektir. Hücrelerin çoğunun kalktığından emin olmak için plakaları mikroskop altında kontrol edin; hücreler, sekiz Mils sıcaklığında gösterildiği gibi yuvarlaklaşacak ve ayrılacaktır. EDTA çözeltisini etkisiz hale getirmek için plaka başına besiyerinde %10 FBS ekleyin.

Tüm plakaların hacimlerini tek bir tüpte veya farklı dokular için ayrı tüplerde birleştirin. Hücreleri bir Hema Cytometer kullanarak sayın; santrifüj işlemini 100 g'de beş dakika boyunca uygulayın. Tüpün tabanında bir hücre peleti oluşacaktır; hücre peletini istenen hücre konsantrasyonuna ulaşana kadar komple medyada yeniden süspanse edin.

Her bir T 75 flaskına 2 ila 3 milyon hücre yerleştirin ve gerektiği şekilde tamamlayıcı besiyeri ekleyin. İnkübe edin ve besiyerini değiştirin. Her üç ila dört haftada bir, hücreler T 75 flasklarında subkonfluens seviyesine ulaşır.

Yaklaşık dört hafta içinde hücreler kaldırılıp genişletilmeli veya yaşlanmayı önlemek için alt konfluens aşamasındayken kullanılmalıdır. Transwell'lerin geçirgen membranlarının hazırlanmasıyla başlayın. 24 kuyucuklu çoklu plakalara uygun olan 6,5 milimetrelik insertleri kullanın.

Membranın her iki tarafına ortam ekleyin. Alt kısma altı mil ve üst kısma 0,1 mil ekleyin. Hücre kültürü inkübatöründe bir saat boyunca inkübe edin.

Besiyerini membranın her iki tarafından dikkatlice uzaklaştırın. Bazal hacimle başlamak, membranın kolayca zarar görebileceği anlamına gelir. Bu nedenle besiyerini kültür insertinin kenarından aşağıya doğru pipetleyin ve önerilen hacmi kullanın.

Bunun yapılmaması, hücre ekimi sırasında ortamın diğer kuyucuklara sızmasına neden olacaktır. Geçirgen desteğin ön inkübasyonundan sonra, hücre süspansiyonunu dikkatlice 6,5 milimetrelik kuyucukların membranının apikal tarafına, membran apikal tarafına 0,1 ml hücre süspansiyonu gelecek şekilde pipetleyin. Membranın bazal tarafına 0,6 ml ortam pipetleyin.

Hücreleri 10 gün boyunca epikal ve bazal taraflardan besleyin. İyi farklılaşmış bir kültür oluşturmak için besiyerini haftada iki kez değiştirin. Gösterilen yöntemi kullanarak bazal hacmi uzaklaştırın.

Öncelikle, epikal hacmi değiştirin ve membranın bazal tarafına 0,6 ml besiyeri ekleyin. Bu yöntem, hücrelerin membrana tutunmasını teşvik eder ve hücrelerin uzun süre havaya maruz kalmasını önler. Besiyerini hızlıca değiştirin ve tekrar inkübatöre yerleştirin.

10. günde, AAL medyumunu uzaklaştırarak ve membranın bazal tarafındaki 0,6 ml medyumunu değiştirerek bir hava-sıvı arayüzü oluşturun. Hücreleri altı hafta boyunca hava-sıvı arayüzünde tutun ve medyumu haftada iki kez değiştirin. Siliyal hücreler, arayüzün oluşturulmasından dört hafta sonra görülmeye başlayacaktır.

Sıvı ara yüzü. Hücreler, silli hücrelere doğru tekdüze farklılaşma sağlayacaktır. Kulak sıvı ara yüzünün oluşturulmasından altı hafta sonrası.

Eksplant ve transplantlardan elde edilen sağlıklı epitel hücreli insan bronş segmentleri. Çalışmamızda, bronş dokusu eksplantlarından başarılı kültürler dokuların dokuzundan sekizinde gerçekleşmiştir. Eksplant kültürlerinden biri enfekte olduğu için, epitel hücre halkaları üç ila dört hafta içinde bir ila iki santimetre yarıçapa ulaşmıştır.

Başarılı X eksplantları altı kez daha kültüre edildi. Tüm başarılı kültürler, transplantasyonun başlamasından sonraki 48 saat içinde hücre göçü kanıtı göstermiş veya B hücrelerinde gösterildiği gibi, bu epitel hücrelerine özgü olan parke taşı görünümüne sahip X eksplantları sergilemiştir. Sonraki şekillerde, eksplanttan alınan hücrelerin ve lameller üzerine ekilen hücrelerin sitozin preparatlarının immün boyaması, tüm hücrelerin epitelyuma özgü sitokeratin için pozitif olduğunu ortaya koymuştur; burada sub-konfluan seviyeye kadar büyütülmüş insan subkültür bronşiyal hücreleri ve T 75 flasklar gösterilmektedir. Parke taşı görünümüne dikkat ediniz.

İnsan alt kültür bronşiyal hücreleri, keratin ve E.Cadherin için tekdüze pozitif immün boyama göstermiştir. Diğer hücre tiplerine karşı spesifik antikorlarla yapılan immün boyamalar; kültürlerin fibroblastlar, mezenkimal hücreler veya endotelyal hücreler tarafından kontamine olduğuna dair herhangi bir belirti göstermemiştir. Daha fazla ayrıntı için lütfen beşinci şekle ve metindeki açıklamasına bakınız. Burada gösterildiği gibi, geçirgen polyester membranlar veya transwell'ler üzerinde kültüre edilen hücreler veya sıvı ara yüzeyle farklılaştırılanlar, siliyel epitelyuma dönüşmüştür; burada gösterilenden farklı morfolojiye sahip hücreler görülmeye başlarsa hücreler ve transplantları imha edin. Bu protokolde, primer insan bronşiyal epitel hücrelerinin kültürü ve ekspansiyonu için ayrıntılı yöntemler sunduk.

İnsan akciğer hastalığı mekanizmalarının önemli yolaklarının belirlenmesi ile yeni ilaçların toksisite ve farmakolojik taramaları için insan hücre temelli çalışmalara ihtiyaç duyulmaktadır. Burada açıklanan yöntemlerin, eksplantlardan insan bronşiyal epitel hücreleri kültürlemesiniz ve bu hücreleri çalışma sistemlerinizde kullanmanız konusunda sizi teşvik edeceğini umuyoruz. Teşekkür eder, başarılar dileriz.