Styryl Boyaların Fotoçevrim kullanarak Synaptic veziküllü Havuzları incelenmesi

Bu video, Styro Dye FM 1 43'ün fotokonversiyon prosedürünü göstermektedir. Drosophila melanogaster'deki sinaptik vezikül havuzlarını incelemek için öncelikle, nöromüsküler kavşağı veya NMJ preparatını oluşturan ventral kasları açığa çıkarmak amacıyla drosophila larvaları disseke edilir. Preparatlar, burada gri renkle gösterilen ve hücresel membranı işaretleyen FM D içeren tampon çözeltide inkübe edilir.

Ardından, fiziksel füzyonu indüklemek için elektriksel veya kimyasal olarak stimüle edilirler ve ardından vezikül membranı internalize edilir. Stimüle edilmiş ekzositoz FM D ile boyanacaktır. Ekstraselüler FM boyası daha sonra yıkanarak plazma membranından uzaklaştırılır ve doku, sürekli yüksek yoğunluklu aydınlatma altında fikse edilir. Boya tamamen beyazlatılır (bleaching) ve di amino Ben presipitasyonu nedeniyle siyah renk görünür.

Bu çökelti daha sonra transmisyon elektron mikroskobu ile görüntülebilir. Merhaba, ben Almanya'daki Gaon'da bulunan Avrupa Nörobilim Enstitüsü'ndeki Sylvia Olli laboratuvarından Philippe o Paso. Bugün size nöromüsküler bileşke içinde FM fotokonversiyon prosedürünü göstereceğiz.

Sinaptik vezikül geri dönüşümünü incelemek için laboratuvarımızda bu prosedürü kullanıyoruz. Tamam, hadi başlayalım. Bir diseksiyon mikroskobu altında çalışın. Bir drosophila larvasını, dorsal tarafı yukarı gelecek şekilde, agar kaplı bir kaba iğneleyerek sabitleyerek başlayın.

Bir şırınga iğnesi kullanarak drosophila tuzu çözeltisi ile üzerini kaplayın ve diseksiyon makasıyla dorsal tarafı boyuna kesin. Ardından iç organları çıkarın. Sonrasında, preparatı gerdirin ve tekrar petri kabına iğneleyin.

Ardından, bu prosedürde kullanılan FM boyalarının solmasını önlemek için birkaç ventral kas kullanılabilir. Bu prosedür düşük ışık koşulları altında gerçekleştirilmelidir. Sıkıştırılmış drosophila preparatını, sinirleri kimyasal olarak stimüle etmek için 90 millimolar potasyum klorür ve 10 micromolar FM.1 43 içeren drosophila salini ile örtün.

Stimülasyonun ardından oda sıcaklığında bir dakika boyunca inkübe edin. Uyarıcı çözeltiyi uzaklaştırın ve iğnelenmiş drosophila örneğinin bulunduğu petri kabını, hücre dışı FM 1 43 boyasını uzaklaştırmak için 100 mililitre drosophila salini ile dolu bir behere iki kez daldırın; bu işlem sırasında kimyasal güvenlik davlumbazı altında çalışın.

Nöromüsküler kavşak preparatını, oda sıcaklığında 45 dakika boyunca fosfat tamponlu salin veya PBS içerisindeki %2,5'luk glutaraldehit ile fikse edin. Preparatı bir kez PBS ile yıkayın, ardından sigara kabından çıkarıp 15 dakika boyunca 100 millimolar amonyum klorür içerisine daldırın. Bu işlem, geri kalan glutaraldehit fiksatifin serbest aldehit gruplarını söndürmek içindir.

Normal PBS kullanarak amonyum klorür çözeltisini yıkayın, nöromüsküler bileşke preparatını yeni bir puro kabına yerleştirin ve PBS içinde filtrelemiş 1,5 mg/mL diamin benzidin veya DAB içine daldırarak 4 °C'de 30 dakika inkübe edin. Örneği, arka aynalı bir lamba gövdesi içeren cıva lambası ışık kaynağına sahip, nispeten düşük büyütmeli kuru objektifli bir floresan mikroskoba yerleştirin.

Numuneyi bulun. Ardından, standart mavi uyarım yeşil floresan filtre küpünü kullanarak floresan sinyalini odaklayın. Nöromüsküler kavşaklar, kaslar üzerinde parlak noktalar şeklinde görünecektir.

Ardından, aynı floresan filtre seti kullanılarak, FM D tamamen ağartılana kadar numuneye maksimum yoğunlukta ışık tutun. 20 x objektif lens kullanıldığında 30 ila 45 dakika yeterli olacaktır. Ancak, fotokonversiyon süresi; aydınlatma yoğunluğuna, DAB'nin preparata nüfuz etme gücüne ve kullanılan objektif lense bağlı olarak değişiklik gösterir.

Aydınlatmanın ardından, örneği transmisyon ışığı altında inceleyin. Eğer fotokonversiyon gerçekleşmişse, koyu kahverengi bir çökelek görülmelidir. Diseksiyon mikroskobuna geri dönün ve ardından makas kullanarak fotokonversiyona uğramış bölgeyi larvadan kesin.

Diseksiyon mikroskobuna geri dönün. Ardından, makas kullanarak fotoğraf ile belirlenen bölgeyi larvalardan kesin. Şimdi, eldiven ve göz koruması dahil uygun güvenlik ekipmanlarını giyerek ve bir kimyasal güvenlik davlumbazı altında çalışarak, örneği PBS içeren bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.

Örnek başına 300 µL %1 osmiyumat tetroksit hazırlayın. Ardından örneği plastik kapaklı bir cam flaska yerleştirin ve hazırlığı sabitlemek için hazırladığınız osmiyumat tetroksit çözeltisini ekleyin. Örnek inkübe olurken; %30, 50, 70, 90, 95 ve 100 etanol içeren ayrı çözeltiler hazırlayın.

Numuneyi, her biri beş dakika sürecek şekilde PBS ile dört ila beş kez yıkayın. Her yıkamadan sonra, numuneyi yeni bir erlene aktarmak için pipetinize plastik bir PE ekini takarak kullanın. Son yıkamadan sonra, numuneyi temiz bir cam erlene aktarın.

Ardından, örneği bir dizi etanol çözeltisine yerleştirerek dehidrate edin. İşleme, bir mililitre %30 etanol içinde inkübe ederek başlayın. Beş dakika sonra etanolü bir pastör pipeti yardımıyla uzaklaştırın ve yerine bir mililitre %50 etanol ekleyin.

Nöromüsküler kavşak preparatını %70, %90 ve ardından %95'lik çözeltilerde inkübe ederek dehidrasyon işlemine devam edin. Numune, dehidrasyon sonrası %95'lik etanol çözeltisinde daha fazla kez inkübe edilecek ve ardından %100 Etanol'de üç kez inkübe edilecektir. Etanole iki mililitre bire bir EIN reçinesi ekleyin ve numuneyi bir rotasyonel inkübatöre yerleştirin.

%100 ein ile döndürme işleminin ardından oda sıcaklığında iki ila dört saat bekletin ve kalan etanolün buharlaşması için örneği açık bir flaska yerleştirip dört ila altı saat bekletin. Taze EIN'yi bir kalıba dökün. Hazırladıklarınızı ekleyin ve 60 °C'de 36 saat boyunca inkübe edin.

EIN gömülü preparatlar hazır olduğunda, elmas bıçak kullanarak 50 ila 80 nanometre inceliğinde kesitler hazırlamak için bir ultramikrotom kullanın. Örnekler ince kesitler halinde kesilir. Kesitler bıçağın su banyosunda yüzer ve ardından standart EM ızgaraları üzerine alınabilir.

Hazırlıklar artık geleneksel EM prosedürleri kullanılarak görüntülenmeye hazırdır. Drosophila melanogaster'den izole edilen nöromüsküler bileşkeler, yüksek potasyum kullanılarak stimüle edilmiş ve internalize edilen membranlar burada gösterildiği gibi FM 1 43 ile boyanmıştır.

Bir sinir terminalinin floresansı, konvansiyonel bir epi-floresans mikroskobu kullanılarak gözlemlenebilir. Sürekli aydınlatma altında, boya tamamen ağartılır ve aydınlatma devam ettiğinde, dino-benzin çökelmesi nedeniyle siyah bir renk belirir. Bu sinir terminali sinaptik veziküller içerir, ancak bunların hiçbiri fotokonverte edilmemiştir.

Bu durum, yetersiz aydınlatmadan veya dokuda zayıf DIA aminobenzen penetrasyonundan kaynaklanabilir. Buna karşılık, aşırı aydınlatma, veziküllerin veya organellerin ayırt edilemediği genel olarak karanlık bir görüntüye yol açar; uygun miktardaki aydınlatma ile fotokonversiyon görülebilir. Bu mikrograf, FM fotokonversiyonunu gösteren bir grup koyu vezikülün görüldüğü bir sinaptik butonu göstermektedir.

Fem boyası ile işaretlenmiş sinaptik veziküllerin nasıl fotokonvert edildiğini size göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, konversiyon adımı için aydınlatma sürelerini her zaman dikkatlice kalibre etmeyi hatırlamak önemlidir. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler. Deneylerinizde başarılar dileriz.