Geliştirici Maya Protein Konsantrasyonu bir işlev olarak Morfolojik Fenotip Kalkınma Analizi

Bu protokol, kontrollü protein ekspresyonuna olanak tanıyan regüle edilebilir bir promotör kullanmaktadır. Bu deneyde, metiyonin ile baskılanabilen bir promotörden N iki domainini eksprese eden yüksek kopya sayılı iki mikron plazmid kullanıyoruz. Yaban tip maya hücreleri bununla transforme edilir.

Plazmid ve transformantlar, uol içermeyen plaklarda seçilir. Gece boyu büyümenin ardından, seçici ortamdaki hücreler kortizol aracılı büyüme durdurması ile senkronize edilir.

Son olarak, zaman seyri deneyi sırasında hücrelerin metiyonin içermeyen ortama aktarılmasıyla ekspresyon indüklenir. Protein konsantrasyonu western blotting ile, morfolojik fenotip gelişimi ise mikroskopi ile takip edilir. Merhaba, ben Purdue Üniversitesi Biyolojik Bilimler Bölümü'nden Claudia.

Ben, AL laboratuvarındaki Bari Muji. Bugün size, vücut indüktünün protein konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak morfolojik fenotip gelişiminin analizi için bir prosedür göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, endositik adaptör protein absent two'nun N iki domaininin aşırı ekspresyonu üzerine gözlemlenen bir hücre bölünmesi fenotipinin morfolojik ve moleküler yönlerini incelemek için kullanıyoruz.

Öyleyse başlayalım. Bu protokol, ilgilendiğiniz proteini eksprese edecek bir maya suşunun oluşturulmasıyla başlar. Bizim durumumuzda, metiyonin ile baskılanabilen promotör kontrolü altındaki nth two içeren yüksek kopya plazmit DNA'sı ile vahşi tip W 3 0 3 maya suşunu transforme ettik; 2 millimolar metiyonin, met 25 promotör aktivitesini baskılar.

Metiyonin içermeyen besiyeri maksimum ekspresyona izin verse de, yakın zamanda transforme edilmiş hücreler içeren bir plakadan altı koloni seçin ve 0,2 millimolar metiyonin içeren 50 mililitre seçici besiyeri ile bir konik erlene inoküle ederek, ertesi sabaha kadar 30 degrees Celsius'ta 200 RPM sarsıntıyla inkübe edin. Kültürün 600 nanometredeki optik yoğunluğunu ölçerek hücre yoğunluğunu tahmin edin. Mililitre başına 20 OD 600 nanometre eşdeğeri hücreyi steril bir santrifüj tüpüne aktarın ve santrifüjleme yoluyla hasat edin.

Hücre döngüsünü senkronize etmek için hücreleri YPD besiyerinde vorteksleyerek yeniden süspansiyon haline getirin; DMSO içindeki 1 mg/mL'lik stoktan 15 µg/mL final konsantrasyonuna ulaşın. 30 °C'de, 200 RPM çalkalamalı inkübatörde dört saat boyunca inkübe edin. Dört saat sonra, mitozda duraklayan hücrelerin yüzdesini kontrol edin.

Mikroskop altında inceleme yaparak eşit büyüklükte tomurcuklara sahip hücreleri sayın ve bir sonraki adıma geçin. Yalnızca duraklama %90'tan fazla olduğunda, hücreleri 2200 RPM'de beş dakika boyunca santrifüj ederek hasat edin. Buz gibi soğuk su ile üç kez yıkadıktan sonra, peleti mililitre başına yaklaşık 0,5 OD 600 nanometre hücre yoğunluğunda, metiyonin içermeyen seçici besiyerinde süspande edin.

Hücre hacminin yarısını yeni bir steril tüpe aktarın ve final konsantrasyonu 0.2 millimolar olacak şekilde metiyonin ekleyin. Bu işlem, bazal protein ekspresyon seviyelerinden kaynaklanan etkiler için kontrol olarak hizmet edecektir. Her iki kültürü de 30 derece Celsius'luk inkübatöre geri yerleştirin.

Hücreler, her bir zaman noktasında altı saat boyunca her saat başı fenotip gelişimi açısından analiz edilir. Her kültürden bir mililitre hücre süspansiyonu steril bir mikro santrifüj tüpüne aktarılır ve hücreler santrifüjleme ile toplanır, süpernatan aspire edilir ve pelet 70 µL besiyerinde yeniden süspande edilir. Ardından, steril su içerisinde bir mg/mL'lik stoktan 30 µL metilen mavisi eklenir.

Ardından, bu süspansiyondan yaklaşık altı µL'yi temiz bir lam üzerine pipetleyin ve damlanın üzerine bir lamel yerleştirin. Cam yüzeyler arasında ince ve homojen bir hücre tabakası oluşturmak için lamele hafifçe bastırın. Lameli dokuz kadrana bölün ve her kadran başına üç görüntü alın.

Doğru nicelleştirme yapabilmek için alan başına hücre sayısı 30 hücreden fazla olmamalıdır. Bu örnekte, birbirlerinden ayrılamayan, uzamış ve/veya birbirine eklenmiş tomurcuklara sahip tomurcuklanan maya hücreleri olan, incelenen fenotipi gösteren hücrelerin sayısını sayın. Hücre bölünme kusuru nth üzerinde indüklendiğinden, mavi renklerinden tanımlanan ölü hücrelerin sayısını da sayıyoruz.

Fenotipe özgü defektleri her zaman diliminde görselleştirmek için iki aşırı ekspresyon hücre ölümüne yol açar. Steril bir mikro santrifüj tüpüne bir mililitre kültürden alikot alın ve hücreleri santrifüj ile hasat edin. Hücre peletini, steril su içinde hazırlanmış bir miligram/mililitre konsantrasyonundaki kalsiflores beyaz çözeltinin 100 mikrolitresi içinde süspanse edin ve oda sıcaklığında, karanlıkta beş dakika inkübe edin.

Calcior white ile boyama, e hücre duvarının görüntülenmesini sağlar. Peleti üç kez 1x PBS ile yıkayın. Son peleti 100 µL PBS içinde süspande ediyoruz.

Hücre duvarını görüntülemek için UV optikleri kullanarak hücreleri mikroskop altında gözlemleyin ve 100 x büyütmede görüntüler edinin. GFP etiketli septini görüntülemek için FS E filtresi kullanarak görüntüler edinin. Lamelini dokuz kadrana bölerek ve sayım için her kadranda üç görüntü alarak, daha önce gösterilen yöntemi kullanarak hücre duvarı defektleri ve septin hatalı yerleşimi olan hücrelerin yüzdesini belirleyin TimeLapse videosu. Tekil maya hücrelerinin mikroskopisi, agar yatakları oluşturmak için medya gömülü agar yatakları gerektirir.

Öncelikle, konkav bir çukura sahip cam lamı %70 alkol ile temizleyin ve lamın havada kurumasına izin verin. Lam kururken, 0,06 gram agros'u metiyonin içermeyen beş mililitre seçici besiyerinde, agros tamamen ve hızla çözünene kadar mikrodalga fırında kaynatın. Agros içeren besiyerinden 200 µL'yi lamın üzerine pipetleyin.

Çukurcuk üzerine başka bir temiz lamı ters şekilde yerleştirin ve altında hava kabarcığı kalmadığından emin olun. Jel katılaştığında, üstteki lamı yüzeyleri her zaman paralel tutarak çukurcuk lamından yavaşça uzaklaştırın. Bu işlem, agar yatağının yüzeyinin çukurcuk lamının yüzeyiyle aynı hizada olmasını sağlar.

Agros yatağını çevreleyen lam bölgesini hassas bir mendille temizleyin. Lam, dört saatlik sürenin sonunda kullanıma hazır hale gelir. Kültürden bir mililitre hücreyi steril bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve santrifüjle hasat edin.

Süpernatantı aspire edin ve hücreleri metiyonin içermeyen 100 µL taze seçici besiyerinde yeniden süspande edin. Lamelin kenarlarına vazelin uygulayın. Ardından, hücre süspansiyonundan bir damlayı agros yatağının merkezine yerleştirin ve üzerine bir lameli hafifçe bastırarak homojen bir şekilde yayın.

Kapak camının kenarlarını oje ile çevreleyerek kenarları mühürleyin ve konumunu sabitleyin. Oje kuruduktan sonra, lamı bir mikroskobun ısıtmalı tablasına yerleştirin. Zamanla görüş alanı kalabalıklaşacağı için, hücrelerin yeterince aralıklı olduğu ve sayısının 10'u geçmediği bir alan seçmek amacıyla Zeiss Axio camm, MRM monokrom dijital kamera ile donatılmış bir Zeiss Axio 200 M mikroskobu kullanıyoruz.

Hücreler bölündükçe, yaklaşık beş saat boyunca her beş dakikada bir alanın görüntüsünü alın. Odağı tekrar tekrar ayarlamaktan kaçınmak için, görüntüleme yazılımını her zaman noktasında otomatik olarak birkaç Z-serisi görüntü alacak şekilde programlıyoruz.

Hücreler için yeterli ısının sağlanması amacıyla, mikroskobun iletilen beyaz ışığının tüm görüntüleme süresi boyunca açık bırakılmasının yanı sıra, ısıtmalı sahnelere ek olarak harici bir ısı kaynağı kullanılacaktır; daha sonra movie oluşturmak için en iyi odaklamaya sahip görüntü seçilecektir. Fenotip regresyonu, görüntülerin Image J yazılımı kullanılarak bir movie haline getirilmesiyle incelenebilir. Burada, ilgilendiğimiz proteinin aşırı ekspresyonuna ilişkin temsili sonuçları gösteriyoruz. Nth two.

İlk olarak, nth two'nun protein ekspresyonu, deneyin zaman seyri boyunca belirlenmiştir. HA nth two eksprese eden hücrelerden alınan lizatlar, immünoblotta gösterildiği üzere monoklonal bir anti HA antikor kullanılarak western blotting ile analiz edilmiştir. 0.2 millimolar metiyonin varlığında büyütülen hücreler minimal protein ekspresyonu göstermektedir. Bununla birlikte, metiyonin içermeyen medyumlarda büyütülen hücreler, deneyin zaman seyri boyunca S two konsantrasyonunda tutarlı bir artış sergilemektedir.

Düşük nth iki konsantrasyonunun hücre bölünmesi fenotipi veya sadece hücre ölümü tetikleyemediği nedeniyle, altı saat boyunca metiyonin varlığında veya yokluğunda büyütülen hücreler analiz edilmiştir. Metilen mavisi ile boyama sonrası mavi renkleri ile belirtildiği üzere, hücrelerin düşük bir yüzdesi ölüdür. Benzer şekilde, hücre başına çekirdek sayısı, hücre duvarı ve septin organizasyonu beklendiği gibi normaldir.

Buna karşılık, M iki'nin aşırı ekspresyonu, metilen mavisi ile boyandığında mavi rengini koruyan, birbirine bağlı uzamış tomurcuklardan oluşan uzun zincirlerle kanıtlandığı üzere, ciddi bir hücre bölünmesi kusuruna ve hücre ölümüne yol açar. DPI boyamasının gösterdiği üzere, fenotipik hücrelerin çoğu çok çekirdeklidir. Calcofluor white boyaması ise anormal hücre duvarı yamalarının birikimlerini ortaya koymaktadır.

Ek olarak, septin belirgin şekilde yanlış yerleşmiş ve düzensizdir. Fenotipin zamana bağlı nicelleştirilmesi bu grafikte gösterilmiştir; burada açık daireler 0 mM metiyonini, kapalı daireler ise 0,2 mM metiyonini temsil etmektedir. Burada, hücrelerde zamanla nth iki konsantrasyonu arttıkça, hücre bölünmesi fenotipi gösteren hücrelerin yüzdesinin de yükseldiğini görmekteyiz.

0.2 mM metiyonin ile büyütülen kontrol hücreleri, fenotip gelişiminin hücre kültürü koşullarından değil, artan protein konsantrasyonunun bir fonksiyonu olduğunu göstermektedir. Son olarak, nth two aşırı ekspresyonu sonrası fenotip gelişimi, zaman ayarlı video mikroskopisi ile kaydedilmiştir.

Dört saatlik nth sonrası, iki aşırı ekspresyon hücresi hafif bir morfolojik hücre bölünmesi fenotipi göstermektedir. Video ilerledikçe, çok uzamış tomurcuklara yol açan, anormal ve uzamış apikal tomurcuk büyüme dönemleri görülmektedir. Ayrıca, bir hücre ayrılma olayı gerçekleşmeden önce yeni tomurcuk oluşumu olayları da gözlemlenmektedir.

Ek olarak, ana hücrenin birkaç bölgesinden tomurcukların çıktığı ve bunun dallanmış bir görünüme yol açtığı gözlemlenmektedir. Tomurcuklanma listesinde, bir morfolojik fenotipin gelişiminin protein konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak nasıl karakterize edileceğini ve analiz edileceğini göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, hücreleri önerilen santrifüj hızlarında döndürmeyi hatırlamak önemlidir; çünkü daha yüksek hızlar hücrelere zarar verebilir.

Methylene blue ve klorürün ışığa duyarlı hücreler için toksik olması nedeniyle, bunları görüntülemeden hemen önce eklemeyi hatırlamak da önemlidir. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.