İki Boyutlu Gabor Filtreler dayanarak Optik Scatter Mikroskopi

Bu videoda, apoptoz sırasında mitokondriyal fragmantasyonu nicelleştirmek için optik saçılım mikroskopisi kullanılmaktadır. Bu protokolde optik saçılım mikroskopisi normalde floresan gerektirmese de, doğrulama amacıyla floresan görüntüler alınacaktır. Görüntüleme sisteminin kurulumunun ardından, hücreler MIT tracker green ile işaretlenecek ve apoptozu tetiklemek için staurosporin ile işlem görecektir.

Hücresel organellerin oryantasyonundaki değişimleri iki saat içinde tespit etmek için optik veriler elde edilir. Mitokondriyal fragmantasyonun başlangıcı, hücre altı partiküllerin oryantasyon derecesindeki azalmayı gösteren optik saçılma verileri kullanılarak ölçülebilir. Ardından, optik saçılma verileri ile mitokondrileri içeren floresan bölgeler ilişkilendirilerek veriler doğrulanır.

Merhaba, ben Rutgers Üniversitesi Biyomedikal Mühendisliği Bölümü Biyo Optik Laboratuvarı'ndan Nada Bustani. Ben Biyo Optik Laboratuvarı'ndan Rob Pak ve ben de Biyo Laboratuvarı'ndan Deen. Bugün size, floresan boyalara dayanmayan bir yöntem kullanarak hücre altı morfolojik dinamiklerin nicelleştirilmesine yönelik bir prosedür göstereceğiz.

Laboratuvarımızda bu tekniği, apoptoz veya programlı hücre ölümü sırasındaki sübseküler yapıdaki dinamik değişiklikleri incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Bu prosedüre, eldivenli elleri %70 ethanol ile sterilize ederek başlayın.

Ardından, hazırlanan 100 nano molar miot tracker green stok çözeltisini ve önceden ısıtılmış BAEC hücre kültür ortamını, ışıklar kapalıyken çeker ocağa yerleştirin ve tüm yüzeyleri sterilize edin. Daha sonra, üzerindeki lamel camlara hücreler ekilmiş altı kuyucuklu bir kültür kabını çeker ocağa yerleştirin. Vakum hattına bağlı bir pasta pipeti kullanın.

Kuyucuklardaki hücre besiyerini uzaklaştırın. Ardından hücreleri etiketlemek için her kuyucuğa derhal iki mililitre etiketli besiyeri ekleyin. Mitokondri. Oda ışığına doğrudan maruz kalmayı önlemek için doku kültürü plağının üzerini kapatın ve hücreleri hızla inkübatöre geri yerleştirin.

Hücreler inkübe edilirken 45 dakika boyunca 37 °C'de inkübe edin. Optik düzeneği hazırlamak için önce cıva ark lambasını açın. Ardından bilgisayarı, mikroskop kameralarını ve lazeri açarak dijital mikro ayna cihazını veya DMD'yi döner difüzöre bağlayın.

Ardından, optik lansmanın hizalanıp hizalanmadığını görmek için mikroskop okülerinden bakın. Görüş alanı lazer ışığıyla parlak bir şekilde aydınlatılmış olmalıdır. Numuneyi yüklemek için, 63 x yağ daldırma objektifi tamamen aşağıdayken üzerine bir ila iki küçük damla imersiyon yağı damlatın.

Ardından sahneye, gradi adı verilen ve 10 µm düzenli aralıklarla çizgilere sahip bir ızgaradan oluşan bir lam yerleştirin ve objektifi, yağ odağı yakalayana kadar yükseltin. Sonra, kondansatör alanının altıgen kenarına odaklayın. Merkezi Kohler aydınlatmasıyla hizalandığında durun.

Altıgen kenar, okülerde merkezlenmiş ve net bir şekilde odaklanmış olmalıdır. Ardından, kondansatör alan durdurucu konum düğmelerini kullanarak kondansatör alanını görüş alanına göre merkezleyin. IP lab uygulamasını başlatın ve kamerayı çalıştırmak için ayarları girin.

Kameranın kare aktarım moduna ayarlandığını doğrulayın. Canlı önizlemeyi başlatmak için odaklama edinimi komutunu çalıştırın. Ardından, indeks ön ekini ve görüntülerin kaydedileceği dosya konumunu belirleyin.

Ardından, RS görüntüsünü başlatın. Coolsnap kamerayı çalıştırmak için gerekli ayarları belirleyin. Saatleme modu "normal" olarak ayarlanmalıdır.

DMD yazılımını başlatın. Koyu alan diyaframını script menüsüne yerleştirin. Ardından yükle (load) ve sıfırla (reset) seçeneklerine tıklayın.

Betiği manuel olarak çalıştırmak için viewport'taki mikroskop optik çubuğunu LSM olarak ayarlayın. Bu işlem, görüntüyü hizalanmış optikler içindeki DMD üzerinden gönderecektir. Karanlık alan görüntüsü, Cascade five 12 kameranın CCD'si üzerine yansıtılır.

Karanlık alan görüntüsü, IP laboratuvarındaki canlı önizlemede görünmelidir. Gerekiyorsa, canlı önizlemedeki görüntüyü odaklayın. Görüntüde en az 10.000 sinyal sayımı olduğundan emin olmak için pozlama süresini yeterince yüksek bir değere ayarlayın.

Ardından, görüntüleme sonrası tekil edinme komutunu kullanarak görüş alanının bir anlık görüntüsünü alın. Görüntüyü diske kaydetmek için dizinlenmiş olarak kaydet komutunu kullanın. GTI görüntüsü, görüş alanının boyutunu ölçer.

Şimdi GTI örneğini, görüş alanının dışında kalacak ve yalnızca arka planın görünecek şekilde hareket ettirin. En az 5.000 sayım elde etmeye yetecek bir pozlama süresiyle alanın bir arka plan görüntüsünü yakalayın. Bu görüntü, filtrelenmemiş görüntülerin arka plan çıkarma işlemine yardımcı olacaktır.

Şimdi arka planın Gabor filtreli görüntülerini elde etmek için, Gabor Filtre Bankası betiğini DMD kontrol yazılımına yükleyin. Filtrelerin DMD'nin yerleşik belleğine tamponlanması için betiğin tamamını çalıştırın. Tüm betik tamponlandıktan sonra bu işlem birkaç dakika sürebilir.

Her seferinde yalnızca bir Gabor benzeri filtreye karşılık gelen tek bir filtre setinin yüklendiğinden emin olmak için DMD yazılımındaki başlangıç ve bitiş işaretleyicilerini kullanın. Arka planın filtrelenmiş görüntülerini elde etmek için betiği çalıştırın. Canlı görüntü önizlemesi, karanlık alandan filtrelenmiş görüntüye dönüşmelidir.

Söz konusu filtre için, diskteki IP lab üzerinden görüntüleme betiğini açın. En az 2000 sayım elde edildiğinden emin olmak için pozlama süresini ayarlayın. DMD betiği çalışırken, IP lab'daki canlı önizlemeyi iptal edin ve görüntüleme betiğini çalıştırın.

Bu işlem, indeksi otomatik olarak alacak ve filtrelenmiş görüntüyü diske kaydedecektir. İlk görüntü alındığında, DMD'de çalışan betiği durdurun. Kullanılan komutları betikten silin.

Ardından, bir sonraki filtre setinin başındaki ve sonundaki başlangıç ve bitiş işaretlerini değiştirin. Tüm filtre bankası kullanılıp filtrelenmiş tüm görüntüler elde edilene ve kaydedilene kadar IP laboratuvarındaki veri toplama işlemini tekrarlayın. Laboratuvar tezgahındaki havyayı fişe takarak ve L 15 medyumunu 37 °C'ye ısıtarak hücreleri ekime hazırlayın.

Dökülen herhangi bir besiyerini absorbe etmek ve alanı temiz tutmak için kağıt havlu ve Kim wipe içeren bir çalışma istasyonu hazırlayın. Kim wipe'ları yırtıp döndürerek birkaç fitil hazırlayın. Bu fitiller, sıvıyı hücre plakası üzerinden çekmek için kullanılacaktır.

Ardından, bir hücre sandviç yapısı oluşturmak için metal numune tutucuyu kullanın. Bir şırınga yardımıyla, işlenmiş metal plaktaki deliğin üst çevresine, her iki taraftaki kanalların uçlarına yaklaşık yarıya kadar uzanacak şekilde ince bir vakum gresi şeridi sürün. Temiz bir bir numaralı lamel ile gresin üzerine nazikçe geçiş yapın.

Plakayı ters çevirin ve deliğin etrafına gres uygulayın. Etanolle sterilize edilmiş NI deneme muayene eldivenleri giyerek oda ışıklarını kapatın. Hücreleri inkübatörden çıkarın.

Deneyde kullanılacak olan lameli altı kuyucuklu plakadan çıkarın. Lameli dikkatlice kurulayın. Ardından, lameli hücre tarafı aşağı gelecek şekilde, gözlem deliğinin üzerindeki yağlanmış metal plakaya bastırarak yerleştirin.

Hücreleri plaka içerisinde sandviç şeklinde hapsedin. Besiyerinin yüklenebilmesi için hiçbir hava boşluğu kalmadığından ve gresin su sızdırmaz bir conta oluşturduğundan emin olun. Şimdi plakayı tekrar ters çevirerek her seferinde 200 µL pipetleyin.

Önceden ısıtılmış L 15 medyumunu, sıvı diğer taraftaki oluğa neredeyse ulaşana kadar üst lam ile metal plaka arasındaki oluktan sandviç yapıya ekleyin. Ardından, karşı taraftaki oluğa bir fitil tutarak ve sandviç yapıya ek 200 µL medyum pipetleyerek hücreleri yıkayın. Fitil eski medyumu çektikçe, medyum bir taraftan diğerine akacaktır.

Bu adım sırasında sıvı içerisinde hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin. Her durulama için yeni bir fitil kullanarak bu işlemi iki ila üç kez tekrarlayın. Şimdi, sıvının hücre rezervuarında hapsolmasını sağlamak için plakayı kenarlarından destekleyerek bir kez daha ters çevirin.

Havya ucunu, bir miktar veap'ı hızlıca eritmek için veap beherine daldırın; böylece eriyen madde havya ucuna yapışacaktır. Havya ucunu kullanarak, erimiş veap'ı alt kapatma lamelinin kenarlarına dikkatlice uygulayın. Kapatma lamelinin çevresi boyunca daldırma ve uygulama işlemine devam ederek, lameli metal plakaya mühürleyin.

Bu işlem, ince örtü camının inceleme sırasında plakadan ayrılmaması için iyi bir mekanik sızdırmazlık sağlar. Alt kısımdaki tüm kalıntıları temizleyin. Bir Kimwipe'ı top haline getirerek örtü camı yüzeyini temizleyin.

Lamelin, incelenecek olan merkez kısmının en temiz kalmasını sağlamak için tek bir kaydırma hareketiyle yerleştirin. Altı kuyucuklu plakayı inkübatöre geri koyun. Plakadaki hücreleri optik laboratuvarına götürün ve objektife yerleştirin.

Daha önce yapıldığı gibi, sağlıklı görünümlü hücrelerin bulunduğu bir alan bulun ve bu görüş alanının karanlık alan görüntüsünü alın. Ardından mikroskobu DIC moduna getirin ve pozlama sürelerinin yeterli olduğundan emin olun. Bir kaskad kamera ile DIC görüntüsü alın.

Bu düzenekte, mikroskop hala DIC modunda hizalıyken floresan görüntüler cool SNAP kamera kullanılarak elde edilir. Mikroskop VAR değerini 1x'e ve viewport ayarını %100 binokülere getirin ve görüntüyü okülerden kameraya yönlendirin. Alanı aydınlatmak için kondansatörün üzerine mavi bir LED yerleştirin.

Ardından, görüş alanını RSS görüntüsünde önizleyin ve ince odağı ayarlayın. Gerekiyorsa, bir DIC görüntüsü edinin ve diske kaydedin. Görüş alanının kaskad kameradan elde edilenden nasıl farklı olduğuna dikkat edin.

Bu görüntüler, deneyin analiz aşamasında kaydedilmelidir. Ardından, floresan filtre küpünü konumuna getirin ve mikroskop kepenklerini kullanarak floresan eksitasyonu kısa süreliğine açıp bir floresan görüntüsü elde edin, ardından görüntüleme tamamlanır tamamlanmaz eksitasyonu kapatın. Fotobeyazlamayı (photobleaching) en aza indirmek için floresan görüntüsünü diske kaydedin.

Filtrelenmiş görüntüleri elde etmek için mikroskobu alana sıfırlayın ve ışığı LSM portundan gönderin. Hücreler hâlâ sahnedeyken ve görüş alanı bozulmadan, tek bir zaman noktası için veri toplama işlemini tamamlamak üzere tüm Gabor filtre bankası betiğini daha önce yaptığınız gibi çalıştırın. Standart L 15 besiyerini, 1 µM STS çözeltisi içeren aynı besiyeri ile değiştirmek için emme yöntemini kullanın.

Deney süresince, hücre plakasını sahneden kaldırmadan veya görüş alanını bozmadan, plakadaki kanala pipetle besiyeri ekleyerek kurumasını önleyin. Şimdi, deney tamamlanana kadar bu adımları sonraki zaman noktaları için tekrarlayın. Toplanan veriler, hücre altı yapısal verileri elde etmek için işlenmesi gereken çok sayıda filtrelenmiş görüntü içerecektir.

Burada iki örnek deney gösterilmiştir. Bu şekil, bir deniz diyatomu alg örneğinin sıralı görüntülerini göstermektedir. Yönelimli özellikler açıkça görülmektedir.

Karanlık alan görüntülemede, beş eşittir 0 dereceden beş eşittir 160 dereceye kadar etiketlenmiş optik olarak filtrelenmiş görüntüler, numunenin filtrelenmemiş görüntüsünün yanında gösterilmiştir. Karşılaştırma amacıyla, diyatomun dokuz Gabor filtrelenmiş görüntüsünden oluşan set, nesne yönelimi için piksel piksel işlenmiştir.

Her bir pikselde, maksimum sinyal, filtre yöneliminin bir fonksiyonu olarak ortalama sinyale bölünerek bir en-boy oranı değeri elde edilmiştir. Burada, mavi ile belirtilen bire yakın bir en-boy oranı, tercih edilen bir yanıt açısının bulunmadığı alanları gösterir. Kırmızı ile belirtilen daha yüksek değerler ise, daha yüksek bir tercih edilen açı yanıtının mevcut olduğu alanları gösterir.

Toplam GABOR filtre yanıtının parlaklığı ve kod anlamlılığı ile filtre yönelimi, her pikselde maksimum sinyalin verildiği yönün alt nesne yönelimine dik olduğu anlamına gelir. Alt yapı partikül yönelimi, her bir çizginin filtresiz karanlık alanda görünen yerel nesne yönelimiyle yakından örtüştüğü bir ok diyagramı (quiver plot) ile kodlanmıştır. Ok diyagramı, maksimumun %10'undan daha büyük yanıt yoğunluğuna sahip nesnelerin yönelimini göstermektedir.

Canlı sığır endotel hücreleri içeren bir alanın bu karanlık alan ve optik filtreli görüntülerinde, apoptosis indükleyicisi staurosporin ile işlem yapıldıktan sonra üç saatlik bir süre boyunca her 20 dakikada bir filtreli görüntüler elde edilmiştir. Burada, üst paneldeki görünüm oranı (aspect ratio) haritası ve alt paneldeki mitokondri floresan görüntülemesi zamanın bir fonksiyonu olarak gösterilmektedir. Renk tonu yönelim derecesini temsil eder; bu zaman grafikleri, staurosporin ile işlem görmüş endotel hücrelerindeki partikül görünüm oranının yönelim derecesindeki azalmayı karşılaştırmaktadır; münferit izler tekil hücrelerdeki zaman grafiklerini temsil eder.

Damla yönelimi, hücrelerin floresan bölgelerle eşleşen bölgeleriyle sınırlıdır. Böylece, floresanla doğrulama işlemi gerçekleştirilmiş oldu. Bu işlem arşivlenir.

Bu nedenle, sonraki deneylerde florösans görüntüleme adımları atlanarak doğrudan optik saçılma yöntemi kullanılarak mitokondriyal ölçümler yapılabilir. Gabor filtrelerine dayalı ışık saçılma imzalarını kullanarak apoptoz sırasında mitokondriyal fragmantasyonu nasıl izleyeceğinizi göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, iyi bir yaşam tarzı hazırlığına sahip olmak ve optik düzeneğin iyi hizalandığından ve kalibre edildiğinden emin olmak önemlidir.

Öyleyse, UI deneyleri ile izleme ve CoLab için mantığı kavrayalım.