Video Biyoinformatik İnsan Embriyonik Kök Hücre Colony Büyüme Analizi

Bu protokol, video görüntüleme için bir kamera ile donatılmış bir icon bio station CT inkübatöründe toplanan time-lapse videoların analiz edilmesi yoluyla, insan embriyonik kök hücre koloni büyümesini ölçmek için kullanılan video biyoinformatik yöntemini göstermektedir. İnsan embriyonik kök hücre veya HESC kolonileri %70 konfluens seviyesine kadar kültüre edilir, yeniden ekilir ve 48 saat boyunca inkübe edilir; ardından HESC kolonileri Biot ct içerisinde ek 48 saat boyunca filme alınır. Büyüme hızı, CL quant yazılımı ile geliştirilen segmentasyon iyileştirme ve ölçüm tarifleri kullanılarak belirlenir.

Tarifler, her bir koloniye hassas manuel maske uyumluluğu sağlayan bir görüntü analiz aracı olan Adobe Photoshop ile karşılaştırılarak doğrulanmıştır. Gelişmekte olan video biyoinformatiği alanı, mikroskobik videolardan elde edilen biyolojik verilerin işlenmesini, analizini ve madenciliğini otomatize etmek için kullanılabilir. Merhaba, ben California Üniversitesi Riverside, Hücre Biyolojisi ve Nörobilim Bölümü'ndeki Dr. Prou Talbot'un laboratuvarından Serena Lin.

Merhaba, ben de Talbot Laboratuvarı'ndan Sean Fino. Merhaba, ben Hücre, Moleküler ve Gelişim Biyolojisi Lisansüstü Programı'ndan TI Satish. Bugün size video biyoinformatik araçlarını kullanarak insan embriyonik kök hücre kolonisi büyümesinin nasıl ölçüleceğini göstereceğiz.

Laboratuvarımızda, çevresel toksik maddelerin insan embriyonik kök hücre davranışı üzerindeki etkilerini ölçmek için bu prosedürü kullanıyoruz. Bu prosedürü yeni kök hücre merkez tesisimizde göstereceğiz. Öyleyse başlayalım.

HESC'leri video analizine hazırlamak için, HESC'leri matrigel kaplı altı kuyucuklu plaklarda %70 konfluens düzeyine ulaşana kadar büyütün; HESC içeren bir kuyucuktaki besiyerini aspire edin ve bir mililitre PBS ile iki kez durulayın. Bir mililitre Accutane ekleyin ve 37 °C'de %5 karbondioksit içeren ortamda bir dakika inkübe edin. Ardından, kuyucuğa 10 ila 12 adet cam boncuk ekleyin ve koloniler tamamen ayrılana kadar plağı nazikçe sallayın.

Bir mililitre insan embriyonik kök hücre bakım ortamı veya fare embriyonik fibroblast koşullandırılmış ortam kullanarak Accutane'ı nötralize edin. Boncuklar dışındaki ayrılmış hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpe toplayın ve 200 G'de üç dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı dökün ve peleti 500 mikrolitre taze insan embriyonik kök hücre bakım ortamı veya M-T-E-S-R ile çözün. HESC süspansiyonunun 100 mikrolitresini, matrigel kaplı 12 kuyucuklu bir plağın çok sayıda kuyucuğuna damla damla ekleyin.

Plakayı nazikçe ileri geri sallayın ve hücre kümelerinin kuyucuklara eşit şekilde dağıldığından emin olmak için kültürleri bir ışık mikroskobu altında gözlemleyin. Hücrelerin düz bir şekilde yapıştığından ve kolayca görselleştirilebilecek kadar büyüdüğünden emin olmak için plağı 37 °C ve %5 karbon dioksit içeren bir inkübatöre 48 saat süreyle yerleştirin. 48 saat sonra, besiyerini aspire edin ve yapışmamış hücreleri uzaklaştırmak için kuyucukları 500 µL PBS ile yıkayın, ardından her birine 500 µL M-T-E-S-R besiyeri ekleyin.

Plakayı hemen Biot CT cihazına yerleştirin ve zaman ayarlı görüntüler toplamaya başlayın. Diğer kolonilerle birleşme ihtimali düşük olan, ayrı tekil kolonilerin bulunduğu alanları seçmeye çalışın. Bu protokolde hücreler, yedi dakikalık aralıklarla kareler alınarak ek 48 saat boyunca video ile kaydedilir.

Segmentasyon tarifini oluşturmak için öncelikle, kayıt süresi boyunca odaklanmış durumda kalan tek bir koloni içerdiğini doğrulamak amacıyla videonun tamamını manuel olarak tarayın. Bundan sonra, CL quants yazılımındaki segmentasyon sihirbazını açın ve sonraki butonuna tıklayın. Doğru görüntü kanalını seçin ve sonraki butonuna tıklayın.

Yumuşak eşleşmeyi (soft matching) seçin ve İleri'ye tıklayın. Koloninin dış kenarından merkez bölgesine doğru bir daire çizerek bir veya iki hedef bölge seçin. Bu alan mümkün olduğunca küçük olmalı ancak koloninin tamamını temsil etmelidir.

Hatalı maske uygulamasına yol açabileceği için çok fazla bölge seçmeyin. Sonraki butonuna tıklayın. Koloninin parçası olmayan ve arka planın parçası olmayan bölgeleri daire içine alarak "Bölgeleri istemiyorum" seçeneğini belirleyin.

Bu bölgeler, döküntüler ve ölü hücreler gibi baskılanması gereken paternlere sahiptir. Sonrakine tıklayın. Koloni, döküntü veya ölü hücre olmayan bölgeleri daire içine alarak arka planı seçin.

Arka plan homojen olmalı ve muhtemelen her karede görünmelidir. Tipik olarak, koloni etrafındaki gri arka plan seçilir. Sonraki butonuna tıklayın.

Maske, ilgi bölgesini doğru şekilde kapatmıyorsa, ilgi bölgesinin üzerinde renkli bir maske görüntülenmelidir. Maskede bir değişiklik gerekiyorsa, ekranın sağ alt köşesindeki segmentasyon eşik aralığı artırılabilir veya azaltılabilir. Yumuşak eşleşme bölgelerini güncellemeyi seçin.

Bu işlem, istenen, istenmeyen veya arka plan alanlarının değiştirilmesine olanak tanır. Maske tatmin ediciyse, apply threshold seçeneğini belirleyin ve save my mask butonuna tıklayın. Ardından, next butonuna tıklayın.

Maske daha sonra farklı bir renkte görüntülenecektir. Bitir'i seçin. Tarif, yazılımın sağ üst köşesinde segmentasyon tarifi olarak görüntülenmelidir.

İsterseniz sağ tıklayıp yeni bir isim girerek reçeteyi yeniden adlandırın. Reçeteyi uygulamak için sağ tıklayın ve fareyi üzerine getirin.

Reçeteyi uygulayın. Kullanılacak kare sayısının seçilmesine olanak tanıyan bir menü görünecektir. Maske sadakatini sağlamak için kare aralığını her 20 kare olacak şekilde ayarlayın.

Döküntülerdeki istenmeyen bölgeleri ortadan kaldıran bir iyileştirme reçetesi oluşturmak için, maskenin uygulandığı karelerin %10'unu rastgele manuel olarak kontrol edin. İyileştirme reçetesi klasörüne sağ tıklayın ve ardından yeni seçeneğine tıklayın. Orijinal görüş alanından yeni bir iyileştirme reçetesi görüntülenmelidir.

Görüntünün sağında yer alan geliştirme modülünü açma/kapama düğmesini belirlemek için fareyi araç çubuğundaki simgelerin üzerinde gezdirin ve düğmeye tıklayın. Etiketleme açılır menüsünü seçin. Bağlantılı etiketleme seçeneğini seçin, ardından bağlantılı iki etiketleme seçeneğini seçin.

Yeni bir görev çubuğu görüntülenmelidir. Segmentasyon tarifinden başlangıç maskesini alın ve giriş kutusuna sürükleyin. Çubuk artık giriş maskesi numarasını görüntülemelidir.

Giriş maske numarasına sahip simgeyi sıfır maske simgesine sürükleyin. Görev çubuğunda minimum boyutu (min size) bulun ve yalnızca ilgi alanı (region of interest) görüntülenene kadar sayıyı ayarlayın. Her bir uyumlama denemesi için yürüt (execute) düğmesine tıkladığınızdan emin olun.

Minimum boyut ayarı tatmin edici olduğunda, ekranın altındaki önceki geliştirme reçetesine tıklayın ve reçeteye kaydet seçeneğini belirleyin. Yazılım şu anda seçilen reçetenin üzerine yazılmasını isteyecektir; evet seçeneğine tıklayın. Geliştirme reçetesini, segmentasyon nokta kontrolü ile aynı prosedürü kullanarak kontrol edin.

Segmentasyon ve iyileştirme tariflerinden memnun kalındıysa, ölçüm şablonunu oluşturma adımına geçin. Başlamak için sağ taraftaki araç çubuğundan "ölçüm şablonu oluştur"u seçin. Ölçüm penceresinde, imleci klipart hücre şeklinin üzerine getirin.

Kontrol tuşuna basılı tutun ve morfoloji bölümünün altındaki hücreyi seçin, varsayılan parametir seçeneğinin işaretini kaldırın ve alan parametresi seçeneğini işaretleyin. Ardından şablon penceresinden çıkın. Simgeyi seçin.

Ölçüm tarifi oluşturun. Tarifi yeniden adlandırın. Şablon sekmesine geçiş yapın ve seçin. Sağ üst köşede, önceden oluşturulmuş ölçüm şablonunu sürükleyip ölçüm penceresine bırakın.

Ölçüm reçetesi penceresinde devam etmek için evet'e tıklayın, kanal eşlemelerini seçin. Ardından tüm hücre seçme maskesi eşlemelerini seçin. Daha sonra tüm hücre seçeneğini belirleyin. Geliştirilmiş maske için, reçete sekmesi altındaki ölçüm reçetesini seçin.

Ana pencerede, ölçüm reçetesi penceresi içindeki kaydet simgesini seçin. Ardından pencereyi kapatın. Daha sonra görüş alanını kapatıp yeniden açın. Reçete listesi klasörüne sağ tıklayın ve ardından yeni seçeneğine tıklayın; gerekli uygulama sırasına göre reçeteleri reçete listesine sürükleyin, reçete listesini kilitle seçeneğini belirleyin ve Adobe Photoshop kullanarak reçeteleri video verileri üzerinde sırayla çalıştırın.

Aynı kolonilerin her 20. karesi analiz edildi. Bir koloni görüntüsünün karesini Adobe Photoshop'ta manuel olarak açın. Araç çubuğundaki sihirli değnek aracına tıklayın.

Koloni bölgesini hariç tutacak şekilde, tüm alan kapsanana kadar koloninin etrafındaki alana tıklayın. Koloninin etrafındaki noktalı çizginin koloninin içinde değil, tam çevresine oturduğundan emin olun. Noktalı çizgi çevreyi sarmıyorsa, üst araç çubuğundaki tolerans değerini buna göre değiştirin.

Araç çubuğundaki hızlı maske modunda düzenle'ye tıklayın ve koloni seçilene kadar koloniye tıklayın. Pencere açılır menüsüne gidin ve histogram'a tıklayın. Önbellek bir olarak ayarlanmalıdır.

Önbellek iki ise, önbelleği bire değiştirmek için ünlem işaretli ifadeye tıklayın. Piksel değerini bir hesap çizelgesine kaydedin. Yukarıdaki işlemi her 20. kare için tekrarlayın.

Photoshop ve CL quant yazılımı kullanılarak toplanan veriler daha sonra birlikte grafiğe dökülebilir. HESC koloni büyümesini nicelleştirmeye yönelik protokolümüz, video biyoinformatiğinin biyolojik bir probleme uygulanışına bir örnek teşkil etmektedir. Burada, CL quant yazılımı ve Adobe Photoshop kullanılarak belirlenen, 48 saatlik süre boyunca koloni boyutundaki artışı karşılaştıran bir grafik sunmaktayız.

Grafik, her biri her iki yazılım paketiyle analiz edilmiş beş farklı koloniyi göstermektedir. Her koloni farklı bir renkle temsil edilmiştir. Düz çizgiler sail quant yazılımı kullanılarak elde edilirken, noktalı çizgiler Photoshop kullanılarak toplanmıştır.

Ham verilerin grafiği, kolonilerin farklı başlangıç boyutlarına sahip olduğu gerçeği göz önünde bulundurulduğunda, her iki ölçüm yönteminin birbiriyle uyumlu olduğunu göstermektedir. Bu şekil, verilerin koloni boyutundaki yüzde artış olarak yeniden grafiğe dökülmüş halini göstermektedir. Büyüme hızları, başlangıç koloni boyutuna bakılmaksızın benzerdir ve her iki analiz ölçümü de benzer sonuçlar vermektedir.

Aşağıdaki grafik, HESC koloni büyümesine ilişkin önceki yüzde değişim verilerinin ortalamalarını göstermektedir. Bu grafik, video biyoinformatiği ve Adobe Photoshop kullanılarak yapılan analizler arasında belirgin bir uyum olduğunu açıkça ortaya koymaktadır. İnsan embriyonik kök hücre koloni büyümesinin video biyoinformatik araçları kullanılarak nasıl ölçüleceğini göstermiş olduk.

Bu prosedür faz kontrast mikroskopisi kullanılarak gerçekleştirilirken, yazılım tarafından hassas koloni seçimi yapılabilmesi için koloninin etrafındaki halonun dahil edildiğinden emin olun. Ayrıca, gösterdiğimiz protokol yerine kültürleme, inkübasyon ve video toplama için diğer yöntemlerin de kullanılabileceğini unutmamak önemlidir. Reçeteler geliştirilip doğrulandığında, analizleri manuel analize göre çok daha hızlı ve daha az deneysel varyasyonla gerçekleştireceklerdir.

İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.