Kronik Salmonella Infected Fare Modeli

Bu prosedürün genel amacı, kronik salmonella enfeksiyonu olan bir fare modeli oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle bir salmonella solüsyonu hazırlanarak gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı ise farelere streptomisin ardından salmonella veya sadece streptomisin şeklinde gavage uygulanmasıdır.

Prosedürün üçüncü adımı, fare dışkısından salmonella izole etmek ve BL chroma plakları kullanarak fare bağırsağındaki salmonella enfeksiyonunu tespit etmektir. Prosedürün son adımı ise farenin vücut kütlesini gözlemleyip kaydetmek ve salmonella enfeksiyonu sonrası canlılıktaki değişiklikleri not etmektir. Nihayetinde, salmonella gavajı yapılan farelerin bağırsağında salmonella enfeksiyonunun oluşabildiğini gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Merhaba, ben Rochester Üniversitesi Tıp Bölümü'ndeki Dr. Johnson'ın laboratuvarından Michelle P. Ben de Sun Laboratuvarı'ndanım ve ben de Sun Laboratuvarı'ndan Y. Bugün size Alytic Lennar enfekte kütle modelinin oluşturulması prosedürünü göstereceğiz.

Laboratuvarımızda konak bakteri etkileşimi sinyal iletimini ve tümör oluşumunu incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Deneyden önce, her Salmonella suşu için ve deney boyunca kullanmak üzere yeterli miktarda luria, berti veya LB besiyeri plakları hazırlayın.

Plakalar soğutulabilir ve birkaç ay boyunca saklanabilir. Ardından, salmonella kültürü hazırlayın. -80 °C'de dondurulmuş bir stok salmonella tüpünü çıkarın ve salmonella ekimi yapabilmek için tezgah üzerinde çözülmeye bırakın.

Bir ekim özesini bek ve bek burner'da sterilize edin ve çözülmüş bakteri stokuna daldırın. Özeyle LB plağının üst üçte birlik kısmına zig-zaglar çizerek ekim yapın. Özeyle tekrar alevle sterilizasyon yapın ve plağı döndürün.

Önceki çizgileri kesecek şekilde özi döngüsel hareketlerle (zigzag çizerek) bakteri kolonilerini plağın ikinci üçte birlik kısmına yayın. İşlemi bir kez daha tekrarlayın. Öziyi tekrar alevle sterilize edin.

Özen ekinin agara batmamasına dikkat edin. Plakaları bir gece boyunca 37 °C'lik bir inkübatörde saklayarak kolonilerin büyümesini sağlayın. İşlem doğru yapıldıysa, salmonella plağının en az bir bölümünde tekil koloniler oluşmalıdır.

Ertesi gün. Steril bir kürdan veya bakteri özesi kullanarak LB plakasından bir klon seçin ve 12 ml'lik bir tüp içindeki 7 ml LB'ye aktarın. Tüpü 37 °C'de yaklaşık beş saat boyunca çalkalayın.

İnokülasyon için bu kültürden 0.05 milliliters kullanın. Bir Falcon tüpündeki 50 milliliters LB'ye ekleyin. Yaklaşık 18 saat boyunca 37 degrees Celsius'ta çalkalamadan inkübe edin.

50 mililitre bakteriyel gece boyu kültürü oda sıcaklığında 5.000 RPM'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatantı atın. Ardından, bakterileri yeniden süspanse etmek için tüpe 1,5 mililitre Hank's tamponlu tuz çözeltisi veya HBSS ekleyin ya da 100 birim LB'ye 3 birim HBSS ekleyin. Daha sonra, HBSS ile toplam hacmi 15 mililitreye tamamlayın veya LB ile HBSS oranını 1'e 10 yapın.

Her bir fare için, gavage işlemine başlamadan önce 100 µL seyreltilmiş salmonella kültürü veya 1 × 10⁶ ile 1 × 10⁸ arası koloni oluşturan birim gereklidir; farelerin su ve yem erişimi deneyden dört saat önce kesilmelidir. Ardından, 7,5 mg toz streptomisini 100 µL HBSS içinde seyrelterek gavage işleminden hemen önce bir streptomisin çözeltisi hazırlayın. Enjekte edilen her fare için, gavage öncesindeki kayıpları telafi etmek amacıyla bir miktar fazla hacim hazırladığınızdan emin olun.

İlk olarak, bir besleme iğnesini 100 µL streptomisin çözeltisi ile hazırlayın. Sondaj yapılacak ilk fareyi kafesten çıkarın ve fareyi tezgah üstüne doğru bakacak şekilde tutun. Fare omuz üzerindeki deriyi baş ve boyun bölgesini işaret parmağıyla gererek, özofagusu düzleştirmek için baş ve orta parmakla sıkıca kavrayın.

Besleme iğnesinin küresel ucunu ağız tavanı boyunca farinksin arka kısmının sağ tarafına doğru yönlendirin. Ardından, ucu nazikçe özofagusa indirin ve 100 µL streptomisin solüsyonunu enjekte edin. Herhangi bir direnç hissedilmemelidir.

Bu işlemi, deneye tabi tutulan tüm deneysel ve kontrol fareleri için tekrarlayın. Streptomisin ve gentamisin gavajından yaklaşık 20 saat sonra ve salmonella gavajından dört saat önce, oral yolla salmonella gavajı yapılacak farelerin su ve yemini geri çekin. Her fareye, HBSS içinde 100 µL salmonella çözeltisi kullanarak daha önce olduğu şekilde gavaj uygulayın.

Gavage işleminden sonra, dışkı toplamaya başlamak için her fareyi yeni bir kafese aktarın. Gavage'dan yaklaşık sekiz saat sonra başlayarak, dışkı maddelerini kafese düştükleri anda hemen alın. Deneysel örnek olarak 100 mg fare dışkısı toplayın.

Fekal madde salmonella analizi için, çalışma süresine bağlı olarak günlük veya haftalık örnekler toplayın. Fekal örneği, 1 mL PBS içeren 1,5 mL'lik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve kuvvetlice vorteksledikten sonra 800 RPM'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı temiz bir 1,5 mL'lik tüpe aktarın ve 6.000 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Süpernatantı atın ve peletleri yeniden süspanse etmek için üzerine 200 µL PBS ekleyip vorteksleyin. Ardından, BB l roag plakası ile salmonella tespiti yapın. Bölüm ikide gösterildiği gibi, plaka başına 10 ile 100 µL dışkı çözeltisi kullanın ve plaka üzerine yayın.

Seçilmiş kromojenlerin varlığındaki metabolik farklılıklar nedeniyle salmonella türleri bordo renkte görünür. Bireysel fareler arasındaki enfeksiyon seviyesini karşılaştırmak için plaka üzerindeki salmonella kolonilerini sayın. Bu deneysel prosedürde, altı ila yedi haftalık, spesifik patojen içermeyen dişi C 57 black six fareler kullandık.

Fareler salmonella ve streptomycin artı HBSS ile enfekte edildi. Kontrol grubu farelere sadece streptomycin ile gavage uygulandı. Kullanılan salmonella suşları arasında salmonella typhimurium vahşi tip suşu, A TCC 1 4 0 2 8 S FP C, patojenik olmayan salmonella mutant suşu ve Dr. James Madera'nın laboratuvarından, düşük kopya plazmid olan PSKW 29 içinde virülansla ilişkili AAV R age geni taşıyan üç FPC suşu yer almaktadır. Bu protokol kullanılarak, fare bağırsağında salmonella tyrian kolonizasyonu tespit edilebilir.

Kronik salmonella enfeksiyonu, dışkı analizi ile ölçülmüş; immunofloresan boyama için vücut ağırlığı ve bağırsak doku örnekleri toplanmıştır. Genellikle enfeksiyon sonrası dört hafta içinde vücut ağırlığında kayıp ve ölüm meydana gelir. Enfeksiyon sonrası dördüncü haftadaki sağkalım oranları burada gösterilmiştir.

Fareler enfeksiyondan sonraki dört haftayı atlattıktan sonra vücut ağırlıkları artar ve kalan 23 hafta boyunca ölüm vakaları azalır. Genel olarak, salmonella suşları FSY fsy, A VRA null veya fsy. A VRA heterozigot ile enfekte olan farelerin %65'inden fazlası, bağırsakta kalıcı salmonella enfeksiyonu ile altı aydan fazla yaşayabilir.

Akut enfeksiyondan sonra, hayatta kalanlar halen salmonella taşıyordu ve bu durum, enfeksiyondan altı ay sonra bu protokolde açıklanan yöntem kullanılarak tespit edilebildi. Fare bağırsağından alınan doku örneklerinin immünofloresan analizi, enfeksiyondan 27 hafta sonra bağırsak mukozasında salmonella invazyonunu göstermektedir. Bu görüntüde, çekirdekler maviye boyanmış ve salmonella enfeksiyonu olan bölgeler yeşil renkte gösterilmiştir.

Kontrol grubunda görüldüğü üzere, salmonella kolonizasyonu olmadığını gösteren herhangi bir parlak yeşil boyanma yoktur. Buna karşın, enfeksiyondan 27 hafta sonra salmonella ile enfekte edilen farelerde, intestinal mukozada parlak yeşil boyanma mevcuttur. Bu durum, streptomisin ile ön işlem görmüş farede salmonella enfeksiyonunun kalıcılığını göstermektedir.

Fare modelinde kronik enfeksiyonun nasıl indükleneceğini size göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, bazı kültürlerin taze olarak hazırlanması gerektiğini, doğru pasajlama becerilerini kullanmayı ve deney modelinizin çalıştığından emin olmak için ANA varlığını tespit etmeyi hatırlamak önemlidir. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkür ederiz, deneylerinizde başarılar dileriz.