Embriyonik Kök Hücreler farklılaşma oligodendrosit Öncüleri

Aşağıdaki deneyin genel amacı, 30 gün boyunca süren bir dizi kültürleme aşaması aracılığıyla embriyonik kök hücrelerden oligodendrosit öncüllerini üretmektir. Bu işlem, öncelikle hücre farklılaşmasını başlatmak için fare ES hücrelerinden embriyo gövdeleri oluşturularak gerçekleştirilir. İkinci adım olarak, embriyo gövdeleri, hücrelerin yönlendirilmiş farklılaşmasını bir liganden şeklinde indükleyen retinoik asit ve saf morfin küçük molekülleri ile işleme tabi tutulur.

Sit prekürsörleri. Üçüncü adım olarak, embriyo gövdeleri 22 gün sonra tek hücrelere ayrıştırılır. Kültürde, hücrelerin yaklaşık %80'i OPC'lerdir.

Ardından, spiking OPC'ler oluşturmak amacıyla, MESC türevli OPC'ler NAV 1.2 alt birimi taşıyan bao virüsleri ile transdüse edilir; immünofloresan mikroskopi ve elektrofizyolojik kayıtlar temel alınarak, bu MESC türevli OBC'lerin OPC markör ekspresyonunu ve spiking özelliklerini gösteren sonuçlar elde edilir. Merhaba, ben Kaliforniya Üniversitesi Davis, Hücre Biyolojisi ve İnsan Anatomisi Bölümü'ndeki Dr. Ing laboratuvarından Pong Chiang. Aynı zamanda Kuzey Kaliforniya Shriners Çocuk Hastanesi ile de bağlantılıyız.

Merhaba, ben de Deng laboratuvarından Vial Raj. Bugün size mouse embriyonik kök hücrelerinin oligodendrosit öncül hücrelerine farklılaştırılması prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, daha iyi terapötik potansiyele sahip hücreler üretmek amacıyla embriyonik kök hücre kaynaklı oligodendrosit öncüllerinin özelliklerini incelemek için kullanıyoruz.

Hadi başlayalım. Bugün, OG2 GFP fare embriyonik kök hücre hattından oligodendrosit öncül hücreleri veya OPC'ler üretilecektir. Bu embriyonik kök hücrelerin, sağlıklı kalmaları, optimum yoğunlukta tutulmaları ve spontan farklılaşmanın önlenmesi için her üç günde bir pasajlanması gerekir. Pasajlama.

ESS hücreleri, laminar akışlı kabin altında %70 konfluense ulaştığında. Kültür üzerindeki besiyerini uzaklaştırın. PBS ile durulayın ve önceden ısıtılmış iki mililitre tripsin ile tripsinizasyon yapın.

37 °C'de beş dakika boyunca bir kez LE ekspres işlemi uygulayın. Reaksiyonu durdurun ve hücreleri dört mililitre MES hücre ortamında yeniden süspanse edin. Hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve 1000 RP'de beş dakika boyunca pelletleyin.

Hücrelerin onda birini, MES hücre besiyeri içindeki ışınlanmış meth feeder'ların konfluen tabakası üzerine, MESL besiyeri plağına yeniden süspande edin. Üç gün sonra ES hücreleri yaklaşık %70 konfluen hale gelir ve pasajlanmaya veya embriyo gövdeleri oluşturmak üzere süspande edilmeye hazır olur. Embriyo gövdelerini indüklemek ve diferansiyasyonu başlatmak için, fare ES hücre kolonilerini daha önce olduğu gibi tripsinleyin ve ardından hücreleri knockout serum replacement veya KSR besiyerinde yeniden süspande edin. Hücreleri bir hemositometrede sayın ve süspansiyonu KSR ile seyreltin.

Mililitrede 15.000 hücre yoğunluğundaki ortamdan, ultra düşük yapışma özellikli altı kuyucuklu bir kültür plağının her kuyucuğuna üç mililitre ekleyin. Süspansiyon halindeki hücreleri 37 °C'de dört gün boyunca kültüre edin. Besiyerini her iki günde bir tamamen değiştirin.

Dördüncü günden itibaren, dördüncü günde besiyerini günlük olarak değiştirin. Beşinci günde KSR'yi 0.2 µM retinoik asit ile takviye edin; altıncı ve yedinci günlerde ise hem retinoik asit hem de 1 µM primor famine ile takviye edin. Embriyo gövdelerini, 0.2 µM retinoik asit ve 1 µM primor famine ile takviye edilmiş iki besiyeri içinde besleyin. Kültürde sekiz gün geçtikten sonra, embriyo gövdelerinin çoğunluğu GFP eksprese eder ve tripsinize edilerek ayrıştırılmaya hazır hale gelir; hücreleri daha önce olduğu gibi sayın.

Ardından hücreleri mL başına 3,5 × 10⁵ hücre olacak şekilde süspande edin. OPC ortamında, süspansiyonun 3 mL'sini OPC ortamına yeniden aktarın. Poli-ornitin kaplı 60 mm'lik kaplar kullanarak, yaklaşık her hafta hücreler konfllü hale gelecek ve şu şekilde görünecektir; hücreleri daha önce olduğu gibi üç dakikalık tripsinizasyon ile pasajlayın.

Orijinal resus süspansiyonundan 30 gün sonra. KSR medyumunda hücreler, spiking OPC'ler oluşturmak için oligodendrosit öncül hücre karakteristikleri gösterir. %50 ile %70 arasında konflüent olan fare ESL kaynaklı OPC'ler kullanın.

Hücreleri durulamak için besiyerini XPBS ile değiştirin. Voltaj kapılı sodyum kanalı 1.2 alfa alt birimini tanıtmak için.

Back MAM sodyum kanalı kiti kullanıyoruz. Bir mililitre back MAM bileşen A'yı dört mililitre 1X PBS ile karıştırın. PBS durulama çözeltisini uzaklaştırın ve seyreltilmiş bileşeni ekleyin.

A'yı 37 °C'de iki saat boyunca inkübe edin. Arka bellek ajanını, kitte açıklandığı şekilde B ve C bileşenleri ile zenginleştirilmiş OPC medyumu ile değiştirin. Talimatlar, 37 °C'de iki saat daha inkübe edilmesini belirtmektedir.

İnkübasyonun ardından, zenginleştirilmiş besiyeri taze OPC besiyeri ile değiştirilir. 24 saatlik bir kültür süresinin daha ardından, ESL kaynaklı OPC'lerin bu zaman noktasında spiking analizi yapılabilir. EBS'ler herhangi bir GFP floresansı göstermez.

EBS'ler, orijinal resüspansiyon süspansiyonundan yaklaşık 30 gün sonra güçlü GFP ekspresyonu gösterir ve disagregasyon kültürü için hazır hale gelirler. KSR ortamında, hücrelerin çoğunluğu NG2 boyaması için immünopozitiftir ve bu durum GFP ekspresyonu ile uyumludur. Ancak, beyin OPC'lerinin aksine, bu MES hücre türevli OPC'ler, hücreler sıfır milivolta depolarize edildiğinde bile aksiyon potansiyeli oluşturamazlar.

Viral transdüksiyon ile NAV 1.2 alt birimi tanıtıldıktan sonra, bu MES hücre türevli OPC'ler uyarılır ve aksiyon potansiyelleri oluşturur. Fare embriyonik kök hücrelerinin OPC'lere nasıl farklılaştırılacağını ve viral transdüksiyon yoluyla spike yapan OPC'lerin nasıl üretileceğini göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, retinoik asidi, morfini ve FGF 2'yi uygun şekilde saklamayı, her zaman taze alikotlar kullanmayı ve kullanım sonrası fazla retinoik asidi atmayı hatırlamak önemlidir.

İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkür ederiz, deneylerinizde başarılar dileriz.