Kinesin Powered Moleküler minibüsleri üzerine Kargo Yükleniyor

Bu prosedürün genel amacı, kinesin motorları ile kaplanmış bir yüzey üzerinde kayan mikrotübüllere nanoküreler yüklemektir. Bu işlem, öncelikle bir cam akış hücresinin yüzeyinin kazein solüsyonu ile kaplanmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, kinesin motor proteinlerinin akış hücresi yüzeyine absorbe edilmesidir.

Prosedürün üçüncü adımı mikrotübüllerin eklenmesidir. Prosedürün son adımı, mikrotübüllere bağlanacak olan streptavidin moleküllerini eklemek ve ardından nanokürecikleri eklemektir. Nanokürecikler, mikrotübüller tarafından yakalanabilecekleri akış hücresi yüzeyine bağlanır.

Sonuç olarak, nanosferlerin mikrotübüller tarafından nasıl yakalandığı ve yüzey boyunca nasıl taşındığı floresan mikroskobu kullanılarak gözlemlenebilir. Merhaba, ben Dr. Henry Hess'in laboratuvarından ve Florida Üniversitesi Malzeme Bilimi ve Mühendisliği Bölümü'nden Elaine Jen Smith. Bugün size ters motilite analizi prosedürünü göstereceğiz.

Laboratuvarımızda, kargonun mikrotübüllere yüklenmesini ve moleküler mekiklerin hareketini incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Bu prosedüre başlamadan önce, tüm stok çözeltileri bu videonun yazılı kısmında açıklandığı şekilde taze olarak hazırlayın.

Stok çözeltiler hazırlandıktan sonra, 0,65 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne 25 mikrolitre büyüme çözeltisi pipetleyerek mikro tübül hazırlığına başlayın. Ardından, 20 mikrogram liyofilize biotinillenmiş tübuline 6,25 mikrolitre büyüme çözeltisi ekleyin. Çözeltiyi vorteksleyin ve polimerizasyon için 37 derece Celsius sıcaklıktaki bir ısı banyosunda 30 dakika bekletin; inkübasyonun ardından çözeltiyi Taxol Tamponu ile 100 kat seyreltin ve hafifçe vorteksleyin.

Bu solüsyon mikrotübülleri stabilize etmeye yarar. Solüsyonu MT 100 olarak etiketleyin ve oda sıcaklığında saklayın. Ardından, anti-fade tamponu içerisinde MT 100'ün on katlık bir dilüsyonunu hazırlayın ve bu solüsyonu MT 1000 olarak etiketleyin.

Ardından, kinesin çözeltisini TP tamponu içerisinde 20 kat seyrelterek Kinesin motorlarını hazırlayın. Çözeltiyi "kinase in 20" olarak etiketleyin ve buz üzerinde saklayın. Son olarak, streptavidin ve nanoküre çözeltilerini hazırlayın.

İlk olarak, Antifa Buffer içerisine 100 nano molars konsantrasyona gelecek şekilde Alexa Fluor 5 6 8 işaretli streptavidin ekleyin. Çözeltiyi STV 100 olarak etiketleyin, ardından nanoküreleri Antifa Buffer ile 5, 000 kat seyreltin ve bu karışımı NS 5, 000 olarak etiketleyin. Her iki çözeltiyi de buz üzerinde saklayın.

Kargo yükleme analizi için çözelti hazırlığının ardından, çift taraflı bantla birbirinden ayrılmış bir lamel ve cam örtü lameli kullanarak bir akış hücresi oluşturun. İlk olarak, iki şerit çift taraflı bandı, şeritler arasında yaklaşık bir santimetrelik bir boşluk bırakacak şekilde bir lamelin kenarlarına yapıştırın. Ardından, bir örtü lamelini bandın üzerine yerleştirin.

Sızdırmazlık sağlamak için bir cımbızın düz kenarını kullanarak lamel üzerine baskı uygulayın. Oluşturulan akış hücresi yaklaşık iki santimetre uzunluğunda, bir santimetre genişliğinde ve 100 mikron yüksekliğindedir ve yaklaşık 20 mikrolitrelik bir hacme sahiptir. Ters analiz düzeneğinin kurulumuna başlamak için.

Pipet ucunu lamel ile lam arasına yerleştirin. Ardından, akış hücresine 0.5 mg/mL kazein çözeltisi enjekte edin. Akış hücresindeki bu kaplama, kinesinin absorpsiyon sonrası işlevselliğini korumasını sağlayacaktır.

Kazein solüsyonunun kaplama yapması için beş dakika bekleyin. Ardından, pipet ucunu lam ve lamel arasına yerleştirerek 20 solüsyon çözeltileri halindeki kinazı akış hücresine aktarın ve Kinezin'in akış hücresine absorbe olmasını sağlayın. Daha sonra solüsyon akış hücresine bir taraftan enjekte edilirken, eş zamanlı olarak diğer taraftan emilerek dışarı çıkarılır.

Filtre kağıdı kullanarak, kinazın emilmesi için beş dakika bekleyin. Ardından, MT 1000 solüsyonunu akış hücresine pipetleyerek mikrotübülleri akış hücresine aktarın. Mikrotübüllerin kinaz motorlarına tutunmasının ardından, mikrotübüllerin çökmesi ve kinaz motorlarına bağlanması için beş dakika bekleyin.

STV 100 çözeltisini akış hücresine ekleyerek mikrotübülleri floresan işaretli strep TTR ile kaplayın. Strep TTR moleküllerinin mikrotübüllere bağlanması için beş dakika bekleyin. Akış hücresine üç kez 30 µL Antifa çözeltisi ile yıkama yaparak fazla strep TTR'yi uzaklaştırın.

Son olarak, NS 5,000 çözeltisini akış hücresine pipetleyerek biyotinlenmiş polistiren floresein nanokürelerini ekleyin. Yüzey sabitleyici olarak emilim yapar. Nanoküreler hareket halindeki mikrotübüllerle çarpışacak ve onların üzerine yüklenecektir.

Bu deneyde, 100 x yağlı objektif, X site, tek bir 20 lamba ve bir exon E-M-C-C-D kamera ile donatılmış bir eclipse TE 2000 U floresan mikroskobu kullanılmıştır. Öncelikle, objektifin üzerine bir damla immersiyon yağı damlatın. Ardından, trixy filtre küpünü kullanarak akış hücresini mikroskop tablasına yerleştirin.

Mikrotübülleri odağa getirin, ardından nanoküreleri görüntülemek için fitzy filtre küpüne geçin. Sonrasında, and veya I exon programını açın ve kazanım modunu kinetik olarak ayarlayın. 0,5 saniyelik bir pozlama süresi, 20'lik bir kinetik seri uzunluğu ve altı saniyelik bir kinetik döngü süresi kullanın.

Mikroskobu okülerden kameraya geçirin ve görüntüleri almaya başlayın. İlk dört görüntü için mikrotübülleri görüntülemek üzere trixi küpünü kullanın. Sonraki 12 görüntü için nanokürelerin görüntülerini almak amacıyla Fitz filtre küpüne geçiş yapın.

Ardından tekrar trixi filtre küpüne geçiniz. Mikrotübülleri görüntülemek için çekilen son dört görüntüde, mikrotübüller Trissy filtre küpü kullanılarak gözlemlenmiş, filtre küpü fite konumuna getirilmiştir. Buradaki nanoküreleri görselleştirmek için, mikrotübüller tarafından taşınan nanoküreler oklarla belirtilmiştir. Tüm nanoküreler mikrotübüller tarafından yakalanmamıştır.

Şimdi, nanokürelerin konumunun 36 saniye sonraki görünümü, nanokürelerin yer değiştirdiğini ortaya koymaktadır. Mikrotübüller tekrar görüntülendiğinde, mikrotübüllerin de görüş alanı boyunca hareket ettiği açıkça görülmektedir. Bu görüntüler, nanokürelerin mikrotübüler taşıma nedeniyle yer değiştirdiğini kanıtlamaktadır.

Ters hareketlilik analizinin nasıl gerçekleştirileceğini size göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, görüntüler alınırken hem mikrotübüllerin hem de nanokürelerin görülebilmesi için filtre küplerinin değiştirilmesinin önemli olduğunu unutmayın. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.