Göç İnsan T Lenfosit İzolasyon, Kültür ve Analiz In Vitro

T lenfosit göçü; lenfoid organlara yönelim, damar sisteminden çıkış ve periferik dokulara giriş sırasında gerçekleşir. Bu süreç, T hücresi yüzeyinin diğer hücrelerle olan adeziv etkileşimini içerir. Bu fenomeni in vitro ortamda incelemek için insan T lenfositleri izole edilir, kültüre alınır ve adeziv proteinle kaplanmış doku kültürü plaklarına yerleştirilir.

ICAM 1 ve kemokin SDF 1. Ardından T lenfosit migrasyonunun görüntüleri elde edilebilir ve analiz edilebilir. Merhaba, ben Craig LeFort; Rochester Üniversitesi Aşı Biyolojisi ve İmmünoloji Merkezi'ndeki Minsu Kim laboratuvarındayım.

Bugün size insan T lenfositlerinin izolasyonu ve kültürü ile in vitro göçlerinin analizi için bir prosedür göstereceğiz. Bu analizi, laboratuvarımızda integrinlerin rolünü ve T hücresi göçünü incelemek için kullanıyoruz. T hücresindeki temel integrin, lenfosit fonksiyonu ile ilişkili antijen bir veya LFA-1'dir.

LFA-1 için spesifik ligandlar, ICAM-1 gibi ICAM'lerdir. Ek olarak, T hücresi göçü için hem yönlendirici bir sinyal sağlamak hem de integrinleri aktive etmek amacıyla bir kemokin sinyali gereklidir. Deneyimizde, T hücresi göçü için substrat olarak insan ICAM-1 ve CXCL12 veya SDF-1 kullanıyoruz.

Hadi başlayalım. Sağlıklı bir donörden insan kanı temin ettikten sonra, kanın oda sıcaklığına gelmesini bekleyin. Bu işlem yaklaşık 30 dakika sürer.

Kan soğutulduktan sonra, sekiz mililitrelik yuvarlak tabanlı polistiren bir tüpe, oda sıcaklığındaki polimorf yoğunluk gradyan medyasından üç mililitre nazikçe pipetleyin. Ardından, üzerine üç mililitre tam kanı yavaşça ekleyin. Herhangi bir karışımın önlenmesi önemlidir.

Tüpleri bir santrifüje yerleştirin ve 500 G'de 45 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüjleme işlemini takiben, oda sıcaklığında, periferik kan mononükleer hücreleri veya PBMC'ler diğer kan bileşenlerinden ayrılmış olur. PBMC tabakası, üstten itibaren ilk bulanık bant olarak görünür.

Steril koşullar altında, şeffaf sarı renkli üst fazı dikkatlice uzaklaştırın ve atın. Ardından, PBMC tabakasını yeni bir konik tüpe aktarmak için bir P 1000 mikro pipet kullanın. PBMC'leri, hücreleri 500 G'de beş dakika santrifüj ederek PBS ile iki kez yıkayın.

Her yıkama işleminden sonra süpernatan bir miktar bulanık olacaktır. Hücreleri %10 FBS, %1 penisilinle streptomisin ve mililitre başına bir mikrogram fitohemaglutinin veya PHA içeren 20 mililitre RPMI 1640 medyumu içinde yeniden süspanse edin. PHA varlığında inkübasyon, T lenfosit aktivasyonu ve ekspansiyonunu indükler.

Bir pipet kullanarak PBMC'leri T 75 kültür balonuna aktarın. Ardından 37 °C ve %5 karbondioksit altında 1 ila 24 saat boyunca inkübe edin. Bu adım, balon yüzeyine yapışacak olan monositlerin, süspansiyonda kalan lenfositlerden ayrılmasını sağlar.

İnkübasyonun ardından, ağırlıklı olarak lenfositler içeren tüm medyumun dikkatlice uzaklaştırın ve 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. 500 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Hücre peletini RPMI 1640 ile yeniden süspande edin ve hücreleri; FBS, penisilin, streptomisin ve PHA içeren, 37 °C'de inkübe edilmiş 25 mililitre RPMI 1640 içeren yeni bir T 75 flaska aktarın.

24 saatlik büyümenin ardından, 15 ila 20 mililitre taze besiyeri eklemek ve daha büyük bir T 175 flaskına aktarmak gerekebilir. İnkübasyona üç veya iki gün daha devam edin. Eğer PBMC'lerin ilk inkübasyonu üç gün sonra gece boyu yapıldıysa, süspansiyon halindeki lenfositleri içeren besiyerini bir pipetle çekip 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve 500 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Reese, hücre peletini almış ve hücreleri, 25 mililitre RPMI 1640 içeren yeni bir T 75 şişesine aktarmıştır. FBS, penisilin, streptomisin ve insan IL 2 veya IL 15 ile birlikte hücreleri inkübatöre yerleştirin. Bir T 75 şişesiyle başlanıyorsa, kültürün genişletilmesi ve bir T 1 75 şişesine aktarılması gerekecektir.

Bir ila iki gün sonra, lenfositleri toplam dört ila yedi gün boyunca büyütün. Migrasyon analizinden bir gün önce, cam tabanlı 0,17 milimetre boyutundaki bir kabı, PBS içinde 20 µg/mL protein A veya G ile kaplayın ve gece boyunca 4 °C'de inkübe edin. Ertesi gün, kabı PBS ile kapsamlı bir şekilde yıkayın, ardından kaba PBS çözeltisi içinde ICAM-1 FC ve insan SDF-1 ekleyin.

Molekülleri immobilize etmek için oda sıcaklığında dört saat boyunca inkübe edin. Kültürlenen hücrelerin yoğunluğunu bir hemositometre kullanarak belirleyin. Ardından lenfositleri PBS ile iki kez yıkayın ve inkübasyonun ardından D glikoz içeren bir mililitre L 15 ortamında yeniden süspande edin; kaplanmış plakayı ICAM-1 FC ve SDF-1 ile PBS kullanarak kapsamlı bir şekilde yıkayın, bir mililitre ortamdaki T lenfositlerini plakaya aktarın, migrasyon analizi için uygun bir hücre yoğunluğu elde etmek amacıyla plaka başına yaklaşık 2-5 × 10⁵ hücre kullanılmalıdır.

Hücre göçü görüntüleri elde etmek için, kabı 37 °C'lik ısıtmalı bir hazne gibi sıcaklık kontrollü bir ortamda mikroskop tablasına yerleştirin. Görüntü ayarları menüsünde NIS elements yazılımını açın. Hem canlı görüntüleme hem de görüntü yakalama modu için ikiye iki binleme seçeneğini belirleyin.

Uygulamalar menüsüne gidin ve define, run, experiment seçeneğini belirleyin. Görüntüler arasındaki süre uzunluğunu ve toplam süreyi seçin. Görüntü yakalama dizisi için, görüntüleme işlemini başlatmak üzere run düğmesine basın.

Hız, yol uzunluğu ve yer değiştirme gibi migrasyon parametreleri, Image J Auto Quant veya veloc gibi bir yazılım paketi kullanılarak nicelleştirilebilir. Bir örümcek ağı (spider web) grafiği oluşturmak için, her hücre ve zaman noktası için XY koordinatlarını toplayın ve bunları, her hücre için orijinde ortak bir başlangıç noktası olacak şekilde bir grafik üzerine yansıtın. Burada gösterilen T lenfositleri, ICAM ve SDF one üzerine ekilerek kültüre edilmiş ve 30 dakika boyunca her 10 saniyede bir görüntülenmiştir.

Bu film, her bir hücre için XYT koordinatları kullanılarak T lenfositlerinin dakikada yaklaşık 15 mikron hızla gerçekleştirdiği rastgele göçü göstermektedir. Rastgele seçilen 15 hücre, başlangıç noktası orijin olacak şekilde grafiğe dökülmüştür. Örümcek ağı grafiklerinin karşılaştırılması, farklı deneysel koşullar arasındaki göç farklılıklarının hızlı bir görsel betimlemesini sağlar.

Kontrol koşulları altında T lenfosit migrasyonuna ait grafikler solda, anti LFA-1 ligand bloklayıcı antikor varlığındaki T lenfosit migrasyonuna ait grafikler ise sağda gösterilmiştir. Bu veriler, T lenfositlerinin bir ICAM-1 substratı üzerinde migrasyon için integrin LFA-1'i kullandıklarını kanıtlamaktadır. Prosedür boyunca, kültürlenmiş insan T lenfositleri kullanılarak bir migrasyon analizinin nasıl yapılacağını göstermiş olduk.

Hücre izlemenin ve migrasyon analizinin kolaylaştırılması için ICAM-1 kaplı kaba uygun sayıda hücre eklemeyi hatırlamak önemlidir. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.