Embriyo sırasında Fonksiyonel Artıklık Test Ters Genetik Yaklaşım

Bu prosedürün genel amacı, iki genin belirli bir hücre soyunun spesifikasyonu için fonksiyonel olarak yedekli olup olmadığını belirlemektir. Bu, öncelikle gelişmekte olan zebrafish embriyolarına enjekte edilen gene özgü morfolinolar kullanılarak her bir bireysel genin fonksiyon kaybı fenotipinin tanımlanmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, hücre soyu spesifikasyonunu veya farklılaşmasını niceliksel olarak belirlemek için bir analiz yöntemi geliştirmektir.

Örneğin, burada göstereceğimiz gibi, bir raporlayıcı balık suşu kullanarak. Prosedürün üçüncü adımı, her iki genin fonksiyon kaybını eş zamanlı olarak hedeflemek için iki morph FENO'yu birleştirmektir. Prosedürün son adımı ise çift knockdown'ın neden olduğu fenotipi değerlendirmektir.

Nihayetinde, soy hattı raporerinin incelenmesi veya soy hattına özgü belirteçlerin ekspresyon analizleri yoluyla, belirli bir soy hattındaki hücreler için fonksiyon kaybı veya kazancı gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu tekniğin, fare modelinde nakavtların birleştirilmesi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, balık modelinde doğrulanmış morfolinoların tek bir deneyde birleştirilmesiyle iki hatta üç genin kolayca hedeflenebilmesidir. 100'den fazla embriyo enjekte edilebilir ve fenotipler birkaç gün boyunca değerlendirilebilir.

Bu yöntem, temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Hücre kaderini kontrol eden transkripsiyonel yolakların belirlenmesi gibi gelişimsel biyoloji çalışmalarında, temel düzenleyici yolaklar genellikle fonksiyonel olarak yedekli olan, birbiriyle ilişkili küçük gen aileleri tarafından temsil edilir. Bu nedenle, kardeş genlerden gelen kompanzasyon nedeniyle, bu genlerin rolleri fare nakavt çalışmalarından açıkça anlaşılamamaktadır.

Bu model zebrafish embriyogenezi hakkında bilgi sağlayabilse de, aynı genetik programlar evrim boyunca genellikle iyi korunduğundan, sonuçlar fare gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Embriyolara enjeksiyon yapmadan önce mikroenjeksiyon plakalarını hazırlayın. Balık tankı sisteminden doğrudan alınan temiz su olan sistem suyunda hazırlanmış yaklaşık 12 mililitre %2 agros'u, 100 milimetrelik bir Petri kabının ters çevrilmiş kapağına dökün.

İki mikroskop lamını, kapağın iki yanına yaklaşık 45 derecelik açılarla yerleştirin. Agroz katılaştığında, lamları nazikçe kapaktan çekerek embriyoların enjeksiyon sırasında dinleneceği oluklar oluşturun. Morpholino stokları, enjeksiyondan önce oda sıcaklığında 1 mM konsantrasyonda ve steril distile deiyonize su içerisinde saklanır. Morpholino stoklarının tamamen çözündüğünden emin olmak için 65 °C'de beş dakika inkübe edin.

Stokların oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Yeni tasarlanan her morpho, aktivite ve embriyo toleransı açısından ampirik olarak doğrulanmalıdır. Mikro santrifüj tüplerinde, distile deiyonize su ile stok morpho'nun bir ila iki seri dilüsyonunu gerçekleştirerek 1 millimolar, 0.5 millimolar, 0.25 millimolar ve 0.125 millimolar çalışma konsantrasyonları elde edin.

Diseksiyon mikroskobu altında, mikromanipülatöre takılmış ve uygun şekilde konumlandırılmış kalibre edilmiş bir enjeksiyon iğnesini vakum yardımıyla önden doldurun. İğneye, en düşük konsantrasyonlu morpho solüsyonundan yaklaşık bir µL doldurun. Fertilize edilmiş tek hücreli embriyoları mikroenjeksiyon plakasının oluklarına taşımak için bir transfer pipeti kullanın.

Embriyoların oluğun dibine çökmesi için pipeti kullanarak plaktaki fazla suyu alın. Enjeksiyon plakasını mikroskobun altına yerleştirin, iğneyi koriondan geçirerek vitellusa indirin. İğneyi çıkarmadan önce her bir embriyoya enjeksiyon yapın ve bir sonraki embriyoya erişmek için enjeksiyon plakasını yeniden konumlandırın.

Enjeksiyon yapmayı öğrenirken, burada gösterildiği gibi hücreye yapılan enjeksiyonu görselleştirmek için canlı bir boya kullanmak faydalı olabilir; embriyoları 100 milimetrelik bir Petri kabına geri aktarın, sistem suyu ile 28.5 °C'de kültüre edin. İğnede kalan tüm morpho solüsyonunu dışarı atın ve gelişiminin uygun aşamasındaki bir sonraki embriyo grubunu enjekte etmek için iğneyi bir sonraki en yüksek konsantrasyonlu morpho ile doldurun. Her enjekte edilen morpho konsantrasyonunda embriyoları fenotipler açısından inceleyin.

Her bir morpho için eşik doz, tanımlanmış güvenilir bir fenotipin görüldüğü en düşük dozdur. Hatalı eşiği belirlemek için birden fazla titrasyon döngüsü gerekebilir. İki farklı gen arasındaki genetik etkileşimi araştırmak için.

İlgilenilen iki morphonun her birini kendi eşik konsantrasyonunda olacak şekilde bir karışım halinde hazırlayın. Embriyoların enjeksiyon başına 20 nanogramdan fazla toplam morphoyu tolere edemeyebileceğini unutmamak önemlidir. Embriyolara daha önce olduğu gibi enjeksiyon yapın.

Enjeksiyon hacimlerini, her bir morpho'nun tek başına enjekte edildiği setleri de içerecek şekilde, deneysel ve kontrol grupları arasında sabit tutun; bu işlem stereo mikroskop altında gerçekleştirilmelidir. Enjekte edilen embriyoları enjeksiyondan hemen sonra ve gün boyunca birkaç kez izleyin; ölü veya ölmekte olan embriyoları uzaklaştırmak için bir transfer pipeti kullanın. Bunlar kalan embriyoların canlılığını tehlikeye atabileceğinden, sedate edilmiş veya ötanazi uygulanmış embriyoları herhangi bir zamanda transfer pipeti ile taşıyın.

Gözlem için bir çukur lamı işaretleyin. Fotoğraflama için. Gerekirse koriyonu çıkarmak için ince uçlu pens kullanın.

Embriyoyu %3'lük metil selüloz damlası içinde sabitleyin ve tekli morfolinoların fenotipinin daha yüksek penetransına kıyasla, morfolino kombinasyonuna özgü belirgin bir fenotip için embriyoları tarayın. Burada, eşik değerde morfolinolar enjekte edilmiş birkaç yabani tip embriyo görülmektedir. gata5 için tipik fenotip, öncül hücrelerin orta hatta birleşememesi nedeniyle cardio bifida veya çift kalp oluşumudur.

Oklarla belirtilen GFP pozitif kardiyomiyositlere dikkat edin. Altı morfin için fenotip, düzgün şekilde kıvrılamayan şekil bozukluğu olan kalpleri içerir. Bu embriyolarda da GFP pozitif kardiyomiyositler gelişir.

Buna karşın, burada gösterilen, hem gata five hem de gata six morpholarının kombinasyonu ile enjekte edilen embriyolar, kardiyomiyosit gelişiminin tamamen kaybolduğunu sergilemektedir; bu durum, kardiyomiyositlerin gelişebilmesi için gata five veya gata six genlerinden birinin eksprese edilmesi gerektiğini göstermektedir. Bu iki gen, kardiyomiyosit spesifikasyonu açısından fonksiyonel olarak redundandır.

Bu prosedürü uygularken, önce morfo velelerinizi tam olarak doğrulamanız ve bu prosedürün ardından bunların tek bir hedef genin gerçek knockdown'ını temsil ettiğinden mümkün olduğunca emin olmanız önemlidir. Aynı genlerin memelilerde de benzer şekilde işlev gördüğünü göstermek için koşullu fare null alellerini birleştirmek gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Videoyu izledikten sonra, iki genin embriyogenez sırasında fonksiyonel olarak yedekli olup olmadığını nasıl belirleyeceğiniz konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.