Karşılaştırmalı In vivo Eğitim Xenopus laevis

Bu prosedürün genel amacı, ısı şok proteini GP96'nın kurbağa *Xenopus laevis*'te antijene özgü CD8 T hücresi yanıtlarını teşvik etme konusundaki evrimsel korunum yeteneğini incelemektir. Bu işlem, öncelikle peritoneal lavaj yoluyla peritoneal lökositlerin toplanmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, inkübasyon ve yıkama işlemlerinin ardından, peritoneal lökositlerin, minör ve tümör antijenlerine şaperonluk yapan tümör kaynaklı GP96 ile pulse edilmesidir.

Tümör veya minör histokompatibilite antijenlerine karşı bu kurbağaları duyarlı hale getirmek amacıyla, peritoneal lökositler intraperitoneal enjeksiyon yoluyla naif kurbağalara adaptif olarak transfer edilir. Prosedürün üçüncü adımı, duyarlı hale getirilmiş kurbağalara ya deri grefti uygulamak ya da tümör ile challenge etmek ve deri grefti reddinin başlangıcını veya tümör oluşumunu izlemektir. Prosedürün son adımı, deri reddi ve anti-tümör yanıtlarında yer alan T hücrelerini karakterize etmek için periferik kan örneği almaktır.

Nihayetinde, deri greftleme ve tümör meydan okuma deneyleri aracılığıyla, sırasıyla GP 96 ile ön işlem görmüş kurbağalarda deri grefti reddinin önemli ölçüde hızlandığı ve tümör ortaya çıkışının geciktiği sonuçlar elde edilebilir. Merhaba, ben Rochester Tıp Merkezi Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Bölümü'nde Dr. Jacque Robert'in laboratuvarından Christina Koska. Ben de Dr. River'ın laboratuvarından Tanya Cruz.

Bugün size, peritoneal lökositlerin adoptif transferi ile klon kurbağaların priming işlemini, ardından deri grefti ve tümör transplantasyon analizlerini gerçekleştireceğiniz bir prosedür göstereceğiz. Ek olarak, bu hayvanlardan periferik kanın nasıl alınacağını da göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, ısı şok proteini GP 96'nın Xenopus laevis'te antijen spesifik CD8+ T hücrelerini teşvik etme yeteneğini ve sürece dahil olan hücre tiplerini incelemek için kullanıyoruz.

Pekala, başlayalım. Deneylerimizde kullanılan kurbağalar, Rochester Üniversitesi'ndeki üretim kolonimizden alınan izojenik klonlardır. Hasat için peritonal lökositleri veya PL'leri uyarmak için, anestezi uygulanmış kurbağanın intraperitoneal bölgesine ısı ile öldürülmüş E. coli preparatı enjekte etmek üzere 25 gauge 5/8 iğne kullanın. Enjeksiyondan üç gün sonra PL'ler intraperitoneal lavaj ile hasat edilir.

Bu prosedüre başlamak için, anestezi altındaki kurbağanın karnını az miktarda %70 etanol ile dezenfekte edin. Ardından, periton boşluğuna beş mililitre steril amfibi fosfat tamponlu salin veya oda sıcaklığında önceden ısıtılmış PBS enjekte etmek için 18 gauge 1.5 iğne kullanın. İğneyi çıkarın ve enjekte edilen tamponun vücut boşluğundaki sıvı ile eşitlendiğinden emin olmak için kurbağa bir dakika boyunca nazikçe masaj yapın.

Ardından, şırıngasız yeni bir 18 gauge 1.5 iğneyi kurbağanın abdomenine yerleştirin. Kan damarlarına dikkat ederek, iğnenin arkasından damlayacak olan periton sıvısını temiz bir 50 milliliter konik tüpe toplayın. pls toplandıktan sonra, başlangıçta enjekte edilen hacmin mümkün olduğunca fazlasının geri alındığından emin olun.

Kurbağayı, uyanana kadar sığ sulu bir kaba koyun; uyandıktan sonra tekrar kafesine yerleştirilebilir. pls hasat edildikten sonra, 4 °C'de 10 dakika boyunca 1000 RPM'de santrifüjleyin, sup, natant ve resus kısımlarını uzaklaştırın. pls'leri soğuk A PBS içinde süspande edin.

SÜSPANDE edilmiş plazmayı 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. PLS'yi GP 96 ile pulse etmek için, plazmaya uygun miktarda GP 96 ekleyin ve pipetleme yoluyla karıştırın; buz üzerinde bir saat boyunca inkübe edin, bir saat sonra.

Hücreleri 14,000 RPM'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Bağlanmamış GP 96'yı uzaklaştırmak için süpernatanı çekin. Soğuk A PBS ekleyin ve resüspande edin.

PLS santrifüjlemesini tekrar gerçekleştirin. Son yıkamadan sonra hiçbir kalıntı G 96 kalmadığından emin olmak için S'yi soğuk A-P-B-S-A ile toplam üç kez yıkayın. Naif LG six alıcılarına adaptif transfer yapmak üzere, puls uygulanmış pls'leri 300 µL PBS içerisinde 5 × 10⁵ pls konsantrasyonunda yeniden süspande edin.

Hayvan başına 300 µL pulsed pls intraperitonal olarak enjekte edin. Kurbağaların, bir sonraki bölümde gösterilecek olan deri grefti veya tümör challenge deneylerinden en az üç gün önce hazırlanması gerekir. Greftleme için kullanılacak deri, anestezi uygulanmış bir LG 15 donör kurbağadan alınır.

Gümüşümsü görünen karın derisi olan ventral deriden küçük bir parçayı kesip çıkarmak için makas kullanın. Grefti hazırlarken ARI varlığı nedeniyle dört pigmente hücreye dikkat edin. Dokunun mümkün olduğunca az manipüle edilmesi kritik önem taşır, çünkü bu durum greft hasarına yol açacaktır.

Deriyi pensle çok nazikçe tutun ve soğuk A PBS içeren bir Petri kabına yerleştirin. Petri kabını bekletin. Deriyi temiz bir lam üzerine yerleştirin ve bireysel greftleri beş milimetreye beş milimetre boyutunda parçalar halinde kesmek için bir jilet kullanın.

Deri parçalarını, LG altı alıcı kurbağasına greftlemek amacıyla buz üzerinde PBS içinde tutun. İlk olarak, anestezi altındaki alıcının dorsal derisi üzerinde küçük bir insizyon yapın. Ardından, beş milimetrelik ve beş milimetrelik grefti, gümüş renkli tarafı yukarı bakacak şekilde derinin altına yerleştirin.

Graftlar üzerindeki makas ve pens işaretlerini not ettiğinizden emin olun, çünkü bunlar graft reddi olarak sayılmaz. 24 saat sonra skorlama başladığında, graftın üzerindeki konakçı derisinin bir kısmının kaldırılması gerekir. Graftın rahatça görüntülenebilmesi için makas kullanarak graftın etrafında pencere şeklinde bir kesi yapın.

Donör deriye dokunmamaya ve kanamaya yol açmamaya dikkat edin. Bir taslak çizerek greftin işaretlenmesine hemen başlayın. Deri grefti.

Reddetme, greftlenen deri üzerindeki aridol'ün yok edilme yüzdesi ile belirlenir. Greft, her iki ila üç günde bir stereo mikroskop altında kontrol edilmelidir. Tümör hücrelerini, 300 microliter başına beş kez 10⁵ hücre yoğunluğunda tümör kültür ortamında süspanse ederek transplantasyon için hazırlayın.

Hücreleri, hayvanın dorsal tarafının bir yanına subkutan enjeksiyon yoluyla nakledin. Kurbağa başına 300 µL hacimde 5 × 10⁵ hücre enjekte edilir. Tümör büyümesi, tümör challenge işleminden iki ila üç hafta sonra başlayacaktır.

Tümörün başlangıç görünümünü not edin. Kurbağadan kan lökositleri toplanmadan önce, iki ila üç günde bir kumpas kullanarak tümör boyutlarını ölçün ve hacmini kaydedin. Pasta peppes'leri alev üzerinde çekerek cam iğneler hazırlayın.

Pipetin ince ucu stereo mikroskop altında sivriltildikten sonra, pipeti bir aspirasyon plastik tüpüne bağlayın. Kan toplamaya başlamak için, anestezi altındaki kurbağanın arka ayağının üzerindeki deriyi keserek dorsal tarsus venini açığa çıkarın. Cam iğneyi bir ila iki mililitre buz gibi soğuk A PBS artı heparin çözeltisi ile doldurun.

Ardından cam iğneyi vene yerleştirin ve ağızla yavaşça aspire ederek kan toplamaya başlayın. Ortalama büyüklükteki bir kurbağadan bir ila iki mililitre kan elde edilebilir. Kurbağanın bacağındaki küçük kesinin dikilmesine gerek yoktur.

Yara bir hafta içinde iyileşecektir. Transplantasyondan 12 gün sonra yapılan deri grefti reddinin stereo mikroskobik analiz sonuçları burada gösterilmektedir. MHC açısından özdeş bir LG six donörden deri grefti alan bir LG six klonlanmış kurbağada red görülmemiştir.

Yıldız işareti, reddedilme kaynaklı olmayan marker pensini belirtmektedir. Buna karşılık, MHC uyumsuz, rastgele çiftleştirilmiş bir donörden deri grefti alan bir LG altı klonlanmış kurbağada %80 reddedilme görülmektedir. Her iki görüntüde de oklar, reddedilmemiş sağlıklı greft dokusunu işaretleyen gümüşümsü iridofor pigmente hücrelerini göstermektedir.

Bir sonraki deneyde, LG 15 plazmaları negatif kontrol olarak PBS ile veya bir e coli kültüründen saflaştırılmış rekombinant GP 96 ya da 15 zero tümör doku hücrelerinden saflaştırılmış GP 96 ile pulse edildi; ardından bunlar LG 15 yetişkin alıcılara adoptif olarak transfer edildi ve üç gün sonra canlı 15 zero tümör hücreleri subkütan enjeksiyonla transplant edildi. Challenge sonrası günler içinde ilk kez ortaya çıkan tümörler izlendi ve tümör boyutu periyodik olarak ölçüldü; bu grafiklerde her eğri, bir kurbağadaki tümör büyüme kinetiğini temsil etmektedir. Sonuçlar, 0.5 veya bir mikrogram GP 96 ile prime edilen hayvanlarda, kontrol gruplarına kıyasla tümör ortaya çıkışının anlamlı derecede geciktiğini göstermektedir. Bu nedenle, GP 96, Xenopus'ta tümör antijenlerinin cross-prezentasyonunu kolaylaştırmaktadır.

Böylece, deri greftleme ve tümör transplantasyonu deneyleri aracılığıyla, kurbağa *Xenopus laevis*'te GP 96'nın hem minör hem de tümör antijenlerini sunma yeteneğinin nasıl inceleneceğini göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, bir kan damarı hasar görmüşse peritoneal lavaj toplamaktan kaçınmak önemlidir; çünkü bu durumda hücrelerin çoğunluğu makrofajlar değil, eritrositlerdir. Ayrıca, deri greftini manipüle ederken dokuya zarar vermemek için pensle dokuyu sıkmamaya dikkat edilmelidir.

İşte bu kadar. Yıkama işlemini gerçekleştirdiğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.