Retina Pigment Epitel Fizyoloji ve Patofizyoloji Çalışma Deneysel Modeller

Bu prosedürün genel amacı, model olarak kullanılabilecek insan fetal retinal pigment epiteli veya RPE kültürleri oluşturmaktır. İnsan göz hastalıkları araştırmalarında, dokular donörlerden bütün göz küreleri şeklinde alınır. Prosedürün ilk adımı, fazla kas ve bağ dokusunu temizlemek ve ardından kornea ile lensi çıkararak gözü açmaktır.

Göz, dispaz ile işlenip düzleştirilir ve ardından RPE tek tabakası koroidden soyularak ayrılır. Disseke edilen RPE hücreleri flasklara ekilir ve konfluent tek tabakalar oluşturup pigment geliştirene kadar birkaç hafta boyunca büyütülür. Hücre kültürleri, in vitro fonksiyonel deneylerde kullanılır.

Başarılı in vitro deneyler, RPE yanıtlarının daha karmaşık sinyalizasyon ortamlarında daha iyi değerlendirilebildiği preklinik deneme hayvan modellerinde tekrarlanır. Burada gösterilen model, RPE fizyolojisinin daha iyi anlaşılmasını sağlayacak ve oküler hastalıkların tedavisine yönelik yeni terapötik müdahalelere yol açacaktır. Merhaba, benim adım Sheldon Miller.

Laboratuvarım, Bethesda Maryland kampüsündeki Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin bir parçası olan Ulusal Göz Enstitüsü'nde yer almaktadır. Merhaba, ben Miller Laboratuvarı'ndan Arki. Bugün size insan fetal retinal pigment epitelyal hücrelerinin primer kültürlerinin hazırlanması prosedürünü göstereceğiz.

Bu hücreler, modifiye edilmiş tekli odacıklara yerleştirilebilen konfluen tek tabakalar halinde hazırlanacaktır. Ayrıca, bu izole insan RPE hücrelerini biyokimya ve genetik çalışmalarında da kullanacağız. Laboratuvarımızda bu prosedürü, fizyolojik ve patofizyolojik süreçlerin işlevini ve düzenlenmesini incelemek ve hastalıkların klinik hayvan modellerini geliştirmek amacıyla epitel hücrelerinin primer kültürlerini oluşturmak için kullanmaktayız.

Gözün arka kısmında yer alan, nöral retina ile koroid kan akımını birbirinden ayıran retinal pigment epiteline veya RPE'ye odaklanıyoruz. Gözün bu şematik diyagramı, RPE tabakasının gözün arka kısmında, fotoreseptörlerin hemen bitişiğinde olan konumunu göstermektedir. Ek görsel, retinadaki hücreleri, sağda fotoreseptörler ve solda ganglion hücreleri olacak şekilde göstermektedir.

Bu epitelyum metabolik olarak son derece aktiftir. Fotoreseptörleri günlük olarak sürekli fagosite eder; görsel pigment vitamin A'yı depolar, yeniden sentezler ve fotoreseptörlere taşır. Görme döngüsünde, çevredeki hücre dışı boşlukların kimyasal bileşimini ve hacmini korumak için homeostatik bir rol oynar.

Epitel hücrelerin kritik bir özelliği polariteleridir. Proteinlerin apikal ve bazal lateral membranlara sürekli asimetrik iletimi, epitelin metabolitlerin, iyonların ve sıvıların bir hücre dışı alandan diğerine vektörel taşınımını gerçekleştirmesini sağlayan düzenlenmiş bir süreçtir. Bu aktivite, epitelin nöral retinanın sağlığını ve bütünlüğünü korumasına yardımcı olur.

Burada tarif ettiğimiz in vitro hazırlık, diseksiyona başlamadan önce epitelyal polariteyi ve fonksiyonu belirleyen transport proteinlerinin, reseptörlerin ve sinyal yolaklarının analiz edilmesine olanak tanır. Oda sıcaklığındaki çözeltileri kullanarak laminer akışlı kabinde 12 kuyucuklu bir plaka hazırlayın. Her göz için 10 x antibiyotik antimikotik çözeltisi içeren bir kuyucuk, bir X PBS içeren iki kuyucuk ve serumlu %5 RPE ortamında mililitre başına iki ünite disk alanı ile seyreltilmiş bir kuyucuk gereklidir. Silikon pedli bir diseksiyon kabını bir X-H-B-S-S ile doldurun, sıvıyı boşaltın ve her bir gözü antibiyotik antimikotik çözeltisi içeren bir kuyucuğa aktarın.

Oda sıcaklığında üç ila beş dakika inkübe edin. Göz küresine aşırı basınç uygulamaktan kaçının. Fazla antibiyotiği uzaklaştırmak için gözü, XPBS içeren iki ardışık kuyucukta durulayın.

Ardından, bir diseksiyon stereo mikroskobu altında, örneği bir X-H-B-S-S ile doldurulmuş diseksiyon kabına aktarmak için pens kullanın. Göz çevresindeki fazla kas ve bağ dokusunu temizlemek için iris makası kullanın. Gözü, kornea yukarı bakacak şekilde hizalayın.

Sklera'ya zarar vermeden, gözü bağ dokusundan silikon ped üzerine sabitlemek için iki adet steril 27 gauge iğne kullanın. Bu konumlandırmada, sklera boyunca bir insizyon yapmak için yan port bıçağı kullanın. Kesik, göz ekvatorundan ön yüzeye olan mesafenin üçte biri kadar olmalıdır.

Retinal pigment epitelyumunun (kısaca RPE) vitreus retina çekintisi nedeniyle zarar görmesini önlemek için iris makası kullanarak kesim işlemine göz çevresinde dairesel olarak devam edin. Ön göz flebini göz çukurundan ayırmak için aynı makasla vitreus cismi boyunca kesin.

IOA'nın anterior kısmını kaldırın ve atın. Açık gözü dys kuyucuğuna aktarmak için pens kullanın. Gözün içinde hava kabarcığı kalmadığından emin olun.Kap.

%5 karbondioksit içeren 37 °C sıcaklıkta 40 ila 60 dakika inkübe edin. Gözü, taze oda sıcaklığındaki 1X HBSS ile doldurulmuş olan diseksiyon kabına geri aktarın. Gözü, çukur kısmı yukarı bakacak şekilde konumlandırın ve 2 adet 27 gauge iğne ile sabitleyin.

Diseksiyon mikroskobu altında, kısmen ayrılmış retinayı retinal makasıyla nazikçe kaldırmak için ince pensler kullanın. Retinayı optik sinirden kesin. Retinayı iris makasıyla uzaklaştırın.

Gözün çevresinden optik sinire doğru bir insizyon yapın. Gözü 5 adet 27 gauge iğne ile sabitleyerek açın. RPE tabakasını germek için, optik sinirin etrafında retinal makas kullanarak dairesel bir kesi yapın.

250x veya daha yüksek büyütmeye geçerek RPE tabakasını ayırın. İris makasıyla yapılan kesi boyunca ve optik sinire yakın bölgede RPE tabakasının kenarını bulun. RPE ve Bruch membranını koroid doku tabakasından ayırmak için iki çift pens kullanın.

RPE ile koroid arasındaki bağlantının en zayıf olduğu noktayı bulmak için kesim kenarı boyunca birkaç farklı bölgeyi deneyin. Membranı tamamen çıkarmak için nazikçe geriye doğru soyun. RPE tabakalarını, oda sıcaklığındaki Trypsin-EDTA ile doldurulmuş 15 mililitrelik konik tüpe yerleştirin.

Tüm tabakalar toplandığında tüpün kapağını kapatın ve tüpleri 37 °C'deki bir su banyosunda 10 dakika boyunca inkübe edin. RPE'yi küçük kümelere ayırmak için tüpü kuvvetlice çalkalayın. Koyu renkli hücre kümelerinin kalmaması, ayrışmanın tamamlandığı anlamına gelir.

Tüpü beş dakika daha su banyosuna geri yerleştirin. Sindirilmemiş doku kalıntılarını uzaklaştırmak için bir pastör, pipet ve hafif vakum kullanın. Hücreleri bir santrifüjde 280 5G hızında dört dakika boyunca çöktürün.

Süpernatantı uzaklaştırın. Resüspansiyon için hacmi %15 RPE medyum ile dokuz mililitreye tamamlayın. Hücre süspansiyonundan üç mililitreyi 25 santimetrekarelik bir flaska pipetleyin.

İki mililitre taze oda sıcaklığında, %15 RPE kültür ortamı ekleyin. Hücreleri 37 °C ve %5 karbondioksit altında gece boyunca bekletin. Kültürler olgunlaştıkça, üç ila dört hafta sonra pigmentasyonları artacaktır.

Başarılı kültürler konfluan ve tekdüze şekilde yoğun pigmentli olacaktır. Sizlere insan fetal RP primer kültürlerinin nasıl hazırlanacağını göstermiş olduk. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.