Rastgele bir DNA Kütüphane Kullanımı Primer-Aptamer Seçimi

Bu prosedürün genel amacı, bu durumda S 100 B proteini olan bir hedef proteine spesifik olarak bağlanan aberleri rastgele bir kütüphaneden tanımlamaktır. Bu işlem, öncelikle rastgele dizileri çevreleyen sabit primer dizilerinden ayırmak için kütüphanenin restriksiyon endonükleaz ile sindirilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, rastgele kütüphane dizilerini saflaştırılmış S 100 B proteinine bağlamak ve bunları geri kazanmaktır.

Prosedürün üçüncü adımı, bağlanmış sekansların hibridizasyon ve ligasyon yoluyla sabitlenmiş primer sekanslarla yeniden birleştirilmesidir. Prosedürün son adımı, bağlanmış aday aber havuzunun R-T-P-C-R ile yeniden amplifikasyonuna izin vermek için ligasyon ürünlerinin transkribe edilmesidir; bunu, bu seçilim prosedürünün ek turları izler. Nihayetinde, seçilen aberlerin S 100 B proteinine spesifik olarak bağlandığını gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Örneğin burada, mikro diziler kullanılarak sandviç bağlama analizleri gerçekleştirilmekte ve aynı zamanda fonksiyonelleştirilmiş nanoteller ile 15 nanometer altın nanoparçacıklara bağlanmış ikinci antikorlar kullanılarak floresan işaretli ikinci antikor analizleri yapılmaktadır. Bugün, rastgele bir D sekans kütüphanesinden S hundred B proteinine bağlanan optimal seçimler için bir prosedür göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, kanserin erken teşhisi için bir sensör platformu geliştirmek de dahil olmak üzere çeşitli amaçlarla kullanmaktayız.

Hadi başlayalım. Bu prosedüre başlamak için, daha önce açıklandığı şekilde primer içermeyen (primer free) veya PF DNA kütüphanesi oluşturun. Çift sarmallı DNA kütüphanesinin kesilmesini takiben %10 denatüre poliakrilamid jel ile jel saflaştırması yapılması, 30 cc'de beş prime fosfatlı 32 nükleotidlik bir fragman ve 30'da beş prime fosfatlı 30 nükleotidlik bir fragmanla sonuçlanacaktır; bunlar sırasıyla 32 artı ve 30 artı fragman olarak adlandırılır.

32 artı fragmanı, 3' ucunda CC minimal yan dizisine sahip 30 nükleotidlik rastgele alanı içerirken, 30 artı fragmanı yalnızca 30 nükleotidlik rastgele alan dizisinden oluşur. PF kütüphanesi DNA fragmanlarını aptamer seçimi için hazırlamak için, her bir 32 artı ve 30 artı fragmanını 40 µL 20 mM tris, HCl pH 7.4 içerisinde yeniden süspande edin. Ardından numuneleri inkübasyonu takiben 85 °C'de üç dakika boyunca ısıtın.

Numuneleri 37 °C'lik bir su banyosu inkübatöründe üç dakika boyunca soğutun, ardından 760 µL seleksiyon tamponu ekleyin ve 37 °C'de üç dakika boyunca inkübe edin. Üç dakika sonra numuneyi 10 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin. İnkübasyonun ardından, çözeltiyi seleksiyon tamponu ile önceden yıkanmış nikel NTA agaroz boncuklar içeren bir kolondan geçirin.

Spesifik olmayan DNA'yı uzaklaştırmak için, kolona bağlanmayan PF kütüphanesi DNA fragmanlarını toplayın ve daha sonra kullanmak üzere kenara ayırın. S 100 B bağlı boncukları hazırlamak için öncelikle 400 microliters nikel NDA boncuklarını bir mikrosantrifüjde üç saniye boyunca döndürün ve süpernatanı atın. Ardından, beş kez hafifçe pipetleyerek boncukları 400 microliters bağlanma tamponu ile yıkayın.

Ardından boncukları santrifüjleyip süpernatantı atın. Bu işlemi tekrarlayın. İki kez yıkayın.

Ardından, daha önce saflaştırılmış histidin etiketli proteini boncukların üzerine dökün. Burada, insan S 100 kalsiyum bağlayıcı protein B kullanılmıştır. Çözeltiyi her üç dakikada bir beş kez, toplam 15 dakika boyunca pipetle nazikçe aşağı yukarı çekin.

15 dakika sonra, boncukları santrifüjle çevirin ve süpernatantı atın. Son olarak, boncuğa bağlı S 100 B'yi 400 µL seçme tamponu ile üç kez nazikçe pipetleyerek yıkayın. Boncukları tekrar santrifüjle çöktürün ve süpernatantı atın.

S 100 B'ye bağlı abersleri seçmek için bu adımı, toplamda üç nihai yıkama olacak şekilde iki kez daha tekrarlayın. Daha önce kenara ayrılan 32 plus ve 30 plus fragmanlarını geri alın. Fragmanları boncuğa bağlı S 100 B'ye ekleyin. Ardından örneği 15 dakika boyunca inkübe edin.

15 dakika boyunca her üç dakikada bir hafifçe pipetleyerek karıştırın, boncukları kısa süreliğine santrifüjleyin, süpernatantı uzaklaştırın ve ardından S 100 BDNA kompleksini 800 µL seleksiyon tamponu ile hafifçe pipetleyerek yıkayın. Daha sonra boncukları santrifüjleyin ve süpernatantı uzaklaştırın. Bu yıkama adımını iki kez tekrarlayın.

S 100'ü geri kazanmak için, boncuklara 200 µL 20 mM Tris-HCl pH 7.4 ekleyin. Ardından süspansiyonu 85 °C'de üç dakika boyunca ısıtın. İnkübasyonu takiben.

Boncukları bir dakika boyunca vorteksleyin ve santrifüjle çöktürün. Ardından süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın ve süpernatanları birleştirin.

Son olarak, seçilen DNA fragmanlarını saflaştırın. PCR ürünlerini, eş hacimde fenil kloroform ve izopropil alkol ile iki kez ekstrakte edin. Bunları 250 millimolar sodyum klorür ve hacmin 2,5 katı %100 Ethanol ile minus 70 degrees Celsius sıcaklıkta 15 dakika boyunca çöktürün.

4 °C'de 15 dakika boyunca 21.000 GS'de santrifüjleyin. Ardından süpernatantı atın. Peleti %75 etanol ile etkili bir şekilde yıkayın.

4 °C'de 21,000 GS ile beş dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatantı atın. 10 tur seçimin ardından, peleti bir hız vakumunda üç dakika boyunca kurutun. Ortaya çıkan PCR amplifiye DNA fragmanlarını, Vitrogen core'dan temin edilen PCR 2.1 topo vektörüne klonlayın.

Ardından, seçilen N 30 cc ve N 30 fragmanlarının her biri için 40 ile 50 arası tek koloniyi M 13 forward primer ile sekanslayın. Seçilen sekansları infomax vector NTI yazılımını kullanarak hizalayın. Daha sonra hizalamalara dayanarak konsensüs sekansları belirleyin.

Konsensüs dizileri belirlendikten sonra, yazılı protokolde açıklandığı şekilde konsensüs aberleri satın alın. Beş prime Amin C altı grubuyla sentezlenen ilk aptameri, baskı tamponu içerisinde 15 micromolar son konsantrasyona gelecek şekilde süspanse edin. Ardından, aptamer çözeltisini bir apogen discoveries mikrogrid dizisi kullanarak code link aktive edilmiş lamlar üzerine damlatın.

Kod bağlantısındaki önerilen protokolleri takip edin. Her slaytı 12 dizi olacak şekilde yazdırın. İki kere sekiz formatını kullanın.

Hibridizasyon için mikroarray hibridizasyon kaseti. S 100 B proteinini 70 µL PBS içinde uygun konsantrasyona seyreltin. Ardından solüsyonu mikroarray kasetinin kuyucuklarına uygulayın.

Buharlaşmayı önlemek için mikroarray kasetini nükleaz içermeyen yapışkan tavan folyosu ile mühürleyin. Proteinlerin kod bağlantısı üzerindeki basılı antikorlara bağlanması için oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübasyona bırakın.

Kasetin kuyucuklarını üç kez PBS beş milimolar magnezyum klorür veya PBSM ile yıkayın. Ardından, floresan işaretli ikincil antikorları 70 mikrolitre PBSM içerisinde 0,125 mikromolar olacak şekilde seyreltin. Karışımı 85 santigrat derece sıcaklıkta üç dakika boyunca ısıtın.

Ardından, işaretlenmiş ABERS'lerin buz üzerinde soğumasını bekleyin. ABERS'leri üç dakika boyunca mikroarray kasetinin kuyucuklarına uygulayın. Kaseti tekrar yapışkan folyo ile mühürleyin ve oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.

Yine, tek tek. Yıkama işleminin ardından kuyucukları üç kez PBSM ile yıkayın. Kaseti sökün ve tüm lamı PBSM ile durulayın.

Ardından lamı santrifüj ile iyice kurutun. Son olarak, lamı bir Packard Biosciences tarama dizisi kullanarak tarayın. Gamma P 32 A TP beş prime ucundan etiketlenmiş aptamerlerin S 100 B proteinine 4.000 XL bağlanması belirlenmiş ve KD tayini için konsantrasyona karşı grafiğe dökülmüştür.

Yaklaşık yedi seçilim turu sonrası temsili Kd değerleri genellikle 10⁻⁷ molar aralığındadır. Beş prime uçlu ilk aptamerler code-link mikro dizilere bağlandı; saflaştırılmış S100B proteini ilk aptamerlere bağlandı ve LOR 546 etiketli ikinci aptamerler, S100B kompleksleri üzerinden ilk aptamerlere bağlandı.

Floresans, bir tarama dizisi tarayıcı kullanılarak nicelleştirildi. Orta satır, üstteki ve alttaki satırlarda yer alan KD analizlerinde eklemeli bağlanma ile karakterize edilen sandviç bağlanmayı göstermektedir. Abers beş birim prime tiyol türevlendirilmiş ilk abers için sandviç bağlanma yoktur; bunlar standart tiyol kimyası kullanılarak altın nanotellere bağlandı.

İkinci aptamerler, aynı yöntemle 50 nM altın nanopartiküllere bağlandı. Ardından saflaştırılmış S 100 B proteini önce türetilmiş nanotellere, ardından 50 nM altın nanopartiküllü ikinci aptamerler ise birinci aptamer nanotel S 100 B komplekslerine bağlandı. Bağlanan sandviç kompleksleri FE-SEM kullanılarak görselleştirildi.

S 100 B proteini yerine HTRA one proteini ile gerçekleştirilen bir bağlanma deneyi için negatif bir kontrol görülebilir. Tamam, prosedürle ilgili en önemli konulardan biri, dizilerin kendilerinin rastgele bölgeye baskın gelerek yalancı pozitiflere ve yalancı negatiflere neden olabileceği sabit dizilerin bulunmadığı, primer içermeyen bir yaklaşım kullanıyor olmamızdır. Bu prosedür uygulanırken, her ters transkripsiyon reaksiyonundan önce DNA kalıbının yok edildiğinden emin olmak ve her yeniden amplifikasyondan sonra spesifik R-T-P-C-R ürününü izole etme konusunda dikkatli olmak önemlidir.

İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkür ederiz, deneylerinizde başarılar dileriz.