Tümleşik Optik ve Atomik Kuvvet Mikroskobu eğitimi Mekanik Uyarım Canlı Hücre Tepki
4 Ekim 2010
Bu kağıt kültürü canlı hücreleri mekanik uyarılması için entegre bir atom operasyon okuyucu kuvvet optik görüntüleme mikroskop öğretmeyi hedefliyor. Bir adım-adım protokol sunulmuştur. Mekanik stimülasyonu canlı hücre yanıtı gösteren bir temsilci veri seti sunulmaktadır.
Mekanik stimülasyona karşı hücrelerin gerçek zamanlı yanıtlarının incelenmesi, öncelikle GFP füzyon proteinleri eksprese eden hücrelerin cam tabanlı kaplarda 24 saat boyunca büyütülmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, AFM ucunun biyotinillenmiş fibronektin ile kaplanmasıdır. Ardından, fonksiyonelleştirilmiş AFM ucu hücre yüzeyi ile temas ettirilerek AFM ucunun etrafında güçlü bir fokal adezyon oluşması sağlanır; böylece fibronektin kaplı uç ile hücre arasındaki matris integrin aktin bağlantısı aracılığıyla aktin sitoskeletinin doğrudan manipülasyonuna olanak tanınır.
Son adım, güçlü fokal adezyonu bozmadan, dikey kuvvetin hücre temas noktasında uygulanmasını sağlayacak şekilde AFM ucunun kontrollü yukarı yönlü hareketiyle canlı hücreyi mekanik olarak uyarmaktır. Sonuçlar, gerçek zamanlı floresan optik görüntüleme ile kaydedildiği üzere, hücrelerin substrata tutunmalarını güçlendirerek ve aktin hücre iskeleti reorganizasyonunu tetikleyerek mekanik stimülasyona yanıt verdiğini göstermektedir. Merhaba, ben Andrea Trake, Texas A&M Health Science Center Sistem Biyolojisi ve Translasyonel Tıp Bölümü'nde yardımcı profesörüm.
Merhaba, ben Sum Lim. Texas A&M Health Science Center Sistem Biyolojisi ve Translasyonel Tıp Bölümü'nde doktora sonrası araştırmacıyım. Bugün size, mekanik stimülasyona karşı adaptif hücresel yeniden şekillenmeyi incelemek için kullanılan bir prosedürü göstereceğiz.
Laboratuvarımızda, canlı vasküler düz kas hücrelerindeki gerçek zamanlı hücre iskeleti yeniden şekillenmesini incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Bu çalışmalar için, CSU 22 Yokogawa tarama kafası ile kombine edilmiş, toplam internal yansıma floresan veya TIRF eklentisine sahip ters bir Olympus IX 81 mikroskobu kullanılmaktadır.
Bir bio scope SZ atomik kuvvet mikroskobu, ters optik mikroskobun üzerine monte edilmiştir. Tüm sistem araştırma düzeyinde bir optik masa üzerine kurulmuştur ve daha önce ayrıntılı olarak tanımlanmıştır. Bu entegre mikroskop, iki adet quant EM elektron çarpan yüklü cihaz veya E-M-C-C-D kamera kullanmaktadır.
Biri yüzey görüntüleme, diğeri ise konfokal görüntüleme içindir. Dönen disk tarayıcı harici filtre tekerleği ve bir E-M-C-C-D kameradan oluşan konfokal düzenek, titreşim sönümleme için gerekli olan bir silikon ped üzerine yerleştirilmiş alüminyum bir taban plakasına monte edilmiştir. Tüm konfokal düzenek, dişli bir manşon içeren bir flanş aracılığıyla mikroskoba bağlanır.
Böylece, dönen disk tarayıcıdan kaynaklanan titreşimleri önlemek için düzenek, atomik kuvvet mikroskopisi veya FM ölçümleri sırasında mikroskoptan ayrılabilir. Hem turf hem de konfokal görüntüleme modları için bir argon kripton lazer uyarım kaynağı olarak kullanılır. Lazer, lazeri turf aparatına veya konfokal tarama kafasına ileten iki optik fiberden herhangi birine bağlanabilir.
Sistem iki bilgisayar tarafından kontrol edilir. Bilgisayarlardan biri optik görüntülemeyi kontrol eden slide book yazılımını, diğeri ise AFM'yi kontrol eden nano scope yazılımını kullanır. Mekanik stimülasyon deneyinden 24 saat önce, belirli proteinleri hedefleyen GFP konstrüktlerini eksprese eden canlı hücreler, cam tabanlı bir hücre kültürü kabına yerleştirilir. Deney günü, hücre kültürü besiyeri fenol kırmızısı içermeyen besiyeri ile değiştirilir.
a FM deneyi gürültüye karşı çok hassas olduğundan, gürültüyü en aza indirmek için deney sırasında konuşmaktan veya optik masaya veya mikroskoba dokunmaktan kaçının. a FM ölçümlerinde, dönen disk konfokalı mikroskoptan ayırın. Deney, hücre kültür kabının, kabı manyetik mikroskop tablasına sabitlemek için kullanılan manyetik bir halka ile a FM tablasına yerleştirilmesiyle başlar.
AFM probundaki V şeklinde konsol, iki mikronluk biyotinize cam boncuk ile özelleştirilmiştir. Konsol, mikroskop kullanılarak kolayca görülebilir. Boncuk, konsolun tam ucuna yapıştırılmıştır ve kaplama solüsyonu damla damla buraya uygulanmalıdır.
Deney için bir FM probu hazırlamak amacıyla, önce ucu cam tutucuya monte edin ve ardından ucu kaplamak için cam tutucuyu masa aparatına yerleştirin. Ucun tam uç kısmına 10 µL dokoz fosfat tamponlu salin veya DPBS dikkatlice damlatarak ucu yıkayın ve ardından ucu kurulamak için bir kim wipe kullanın. 1 mg/mL DPBS ile yıkadıktan sonra bu prosedürü beş kez tekrarlayın.
Çözelti içinde avid. Ucun üzerine damla damla uygulayın. Avid kaplamasının ardından ucun beş dakika boyunca inkübe edilmesine izin verin.
Ucu beş kez daha DPBS ile yıkayın. Ardından, bir mg/mL'lik bir çözeltiyi ucun üzerine damla damla ekleyip beş dakika inkübe ederek biotinillenmiş fibronectin'i avadon üzerine çapraz bağlayın.
Son olarak, ucu tekrar beş kez DPBS ile yıkayın ve uçta son damlanın kalmasını sağlayın. Uç hazırlandığında, ucu bir AFM tarayıcıya monte edin. AFM ucunu monte ettikten sonra, tutucunun etrafına koruyucu bir silikon etek yerleştirin.
Ardından, video görüntüleme için mikroskobu hazırlayın. Sonra, FM ucunu görüş alanının merkezine hizalayın. Lazer ışınını konsolun tam ucuna yerleştirerek optik kaldıracı ayarlayın.
Ardından objektifi, tek hücre görüntüleme için uygun olan yüksek büyütmeli objektifle değiştirin. Daha sonra, mekanik olarak uyarılacak hücreyi görüş alanına getirin ve AFM ucunun hücre yüzeyine konumlanacağı yeri seçin. Son olarak, AFM ucunu söz konusu hücreye temas edene kadar indirin.
Ucu hücre ile temas ettirdikten sonra yaklaşık 20 dakika bekleyin. Bu süre, hücre yüzeyindeki FM temas noktasında güçlü bir fokal adezyon oluşmasını sağlar. Bekleme süresinin ardından, mekanik stimülasyon deneyine hazırlanmak için mekanik stimülasyon prosedürü başlatılabilir.
Görüntüleme için floresan hücrelerin izlenebilmesi amacıyla video kameradan E-M-C-C-D kameraya geçiş yapın. Ardından, hücrenin dinlenme halindeki başlangıç görüntüsünü alın. Hücre gövdesi boyunca aktin hücre iskeletinin görselleştirilmesi için dönen diskli ve konfokal mikroskopi kullanın.
Aksine, hücreyi uyarmak için odak adhezyonlarını görselleştirmek amacıyla turf kullanın. Ayrık adımlar halinde her üç ila beş dakikada bir kontrollü bir yukarı yönlü hareket uygulamak için konsolu (cantilever) kullanın. AFM verileri elde edilirken, operatörün dikey kutup için uygun zamanlamayı belirlemek amacıyla Z piso konumunun voltajını sürekli olarak izlemesi önemlidir.
FM veri kazanımıyla eş zamanlı olarak, slide book yazılımını kullanarak her bir dikey çekme işleminden sonra hücrenin konfokal veya turf görüntüsünü kaydedin. Son olarak, stimülasyon deneyi tamamlandığında AFM ucunu hücreden geri çekin. Actin MRFP ve vcul ile transfekte edilmiş bir vasküler düz kas hücresi.
Apikal hücre yüzeyinde bir FM kullanılarak GFP görüntülemesi yapıldı. Aynı hücrenin bazal hücre yüzeyinde turf kullanılarak görüntülemesi yapıldı. Burada iki görüntü üst üste getirilmiştir.
Aynı hücrenin görüntüsü, hücre gövdesi boyunca dönen disk konfokal mikroskopi kullanılarak da elde edilmiş ve 3D yığınının maksimum projeksiyonu olarak gösterilmiştir. A FM ve dönen disk Konfokal görüntüleri arasında iyi örtüşmeler olduğu görülmektedir. Aktin MRFP ile transfekte edilmiş vasküler düz kas hücresi, A FM ile mekanik olarak uyarılmış ve dönen disk konfokal mikroskopi ile görüntülenmiştir.
Hatalar, FM stimülasyonu üzerine dikkat çekici yeniden yapılanma gösteren aktin liflerine işaret etmektedir. Mekanik stimülasyon nedeniyle bazı aktin lifleri polimerize olurken diğerleri depolimerize olmakta, diğer aktin lifleri ise birbirleriyle demetlenmektedir. Aktin yeniden yapılanması nedeniyle, EFM kullanarak canlı hücre kültürünün nasıl mekanik olarak stimüle edileceğini ve aynı zamanda optik görüntüleme yöntemleri kullanılarak sitoplazmik yeniden düzenlenmenin nasıl kaydedileceğini göstermiş olduk.
Bu prosedürü gerçekleştirirken, FM deneyinin son derece gürültülü ve hassas olduğunu hatırlamak önemlidir. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve çalışmalarınızda başarılar dileriz.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, kültürdeki canlı hücreleri mekanik olarak uyarmak için entegre bir atomik kuvvet-optik görüntüleme mikroskobunun kullanımına yönelik bir protokol sunmaktadır. Metodoloji, adım adım bir kılavuz içermekte ve canlı hücrelerin mekanik stimülasyona verdiği tepkilere dair temsili verileri sergilemektedir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre biyolojisi
- Mekanik stimülasyon
- Canlı hücre görüntüleme
Arka Plan
- Hücrelerin mekanik uyarılara verdiği yanıtın anlaşılması, hücre biyolojisinde kritik bir öneme sahiptir.
- Atomik kuvvet mikroskobu, hücrelerin hassas bir şekilde manipüle edilmesine olanak tanır.
- Canlı hücre görüntüleme, hücresel süreçlere ilişkin gerçek zamanlı bilgiler sağlar.
- Fokal adezyon, hücre tutunması ve yanıtında kilit bir rol oynar.
Çalışmanın Amacı
- Canlı hücre çalışmaları için kullanılan özel bir mikroskobun işletimi hakkında bilgi vermek.
- Mekanik stimülasyonun canlı hücreler üzerindeki etkilerini göstermek.
- Araştırmacıların çalışmayı tekrarlayabilmeleri için ayrıntılı bir protokol sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- GFP füzyon proteinleri eksprese eden hücreler cam kaplarda kültüre edilir.
- AFM ucu biyotinillenmiş fibronektin ile kaplanır.
- Fonksiyonelleştirilmiş AFM ucu, hücre yüzeyi ile fokal yapışmalar oluşturmak için kullanılır.
- AFM ucunun kontrollü yukarı yönlü hareketiyle mekanik stimülasyon uygulanır.
Ana Sonuçlar
- Hücreler, stimülasyon üzerine substrata olan tutunmalarını güçlendirdiler.
- Mekanik kuvvetlere yanıt olarak aktin hücre iskeleti reorganizasyonu gözlemlendi.
- Gerçek zamanlı floresan görüntüleme ile dinamik hücresel yanıtlar yakalandı.
- Protokol, tekniğin etkinliğini başarıyla kanıtladı.
Sonuçlar
- Entegre mikroskop, canlı hücrelerin mekanik uyaranlara verdiği yanıtları etkili bir şekilde inceler.
- Bu yöntem, hücresel mekanik ve adezyon anlayışını geliştirebilir.
- Gelecekteki uygulamalar, çeşitli hücre tiplerinin ve koşulların araştırılmasını içerebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulanabilirlik Özeti
Canlı hücrelerin mekanik kuvvetleri nasıl algıladığını ve bunlara nasıl uyum sağladığını anlamak, mekanotransdüksiyon yolaklarındaki hedef doğrulamanın risklerini azaltmak açısından kritiktir. Bu entegre AFM-optik görüntüleme yaklaşımı, sitoskeletal ve adezyon dinamiklerinin gerçek zamanlı ve hücre altı çözünürlükte izlenmesine olanak tanıyarak mekanik uyarıları yapısal yeniden organizasyonla ilişkilendirir ve erken keşif aşamasında öngörülebilir bir güven sağlar. Bu yöntem, kuvvete bağlı aktin yeniden şekillenmesini ve fokal adezyon güçlenmesini doğrudan görselleştirerek mekanistik risk azaltmaya destek olur ve preklinik hedef seçimindeki devam/durdur kararlarına temel oluşturur.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Mekanik stimülasyonun aktin hücre iskeleti reorganizasyonunu ve fokal adezyon güçlenmesini nasıl tetiklediğini ortaya çıkararak terapötik hipotezleri sorgular.
- Operasyonel Değer: Canlı aderent hücrelerde kuvvetle ilişkili hücre iskeleti dinamiklerinin doğrudan gözlemlenmesi yoluyla fonksiyonel hedef doğrulamasını sağlar.
- Öngörücü Değer: Mekanik girdileri yapısal çıktılarla ilişkilendirerek, mekanosensitif hedef etkileşimindeki belirsizliği azaltır ve portföy önceliklendirmesini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Mekanik stimülasyon ve gerçek zamanlı görüntüleme için tekrarlanabilir protokoller oluşturarak, onaylanmış biyolojik sistemleri sonraki iş akışlarına hazırlar.
- Operasyonel Değer: Kontrollü AFM uç hareketi ve senkronize floresan okumaları aracılığıyla analiz standardizasyonu ve kantitatif çıktıları sağlar.
- Ölçeklenebilirlik: Platformun farklı adherent hücre tiplerinde yeniden kullanımını vurgulayarak, mekanobiyoloji tarama kampanyalarında güvenilir bileşik değerlendirmesine olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasiyonel Süreklilik: Apikal stimülasyonun hücre gövdesi boyunca yeniden organizasyona yol açtığı apikalden bazale yapısal eşleşmeyi göstererek hastalıkla olan ilgiyi tartışır.
- Riski Ayarlanmış İlerleme: Mekanotransdüksiyon yolaklarındaki biyobelirteç uyumuna bilgi sağlayan dinamik yanıtları yakalayarak, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar olan sürekliliği tanımlar.
- Mekanistik Risk Azaltma: Kuvvet uygulamasının aktin polimerizasyonuna, depolimerizasyonuna ve demetlenmesine nasıl yol açtığını göstererek etki mekanizmasını netleştirir ve öngörücü risk azaltma değerine odaklanır.
İş Akışı ve Süreç Entegrasyonu
Bu yöntem, hipotez testinden öncü bileşik tanımlamaya kadar olan keşif sürecine entegre edilerek, bileşik taraması öncesinde mekanistik içgörü sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Yöntemin, kontrollü mekanik stimülasyon uygulayarak ve gerçek zamanlıle sitoskeletal yeniden yapılanmayı gözlemleyerek hipotez testlerini nasıl desteklediğini açıklar.
- Tarama: Tekrarlanabilir fokal adezyon oluşumu ve TIRF ile konfokal modaliteler kullanılarak aktin dinamiklerinin kantitatif görüntülemesi yoluyla assay hazırlığını tanımlar.
- Analitik: Stimüle edilmiş durumlar ile dinlenme durumlarının karşılaştırılmasına olanak tanıyan aktin polimerizasyonu/depolimerizasyonu olayları ve fokal adezyon yoğunluk değişimleri gibi ölçümleri vurgular.
- Translasyonel Araştırma: Apikal mekanik stimülasyonun yapısal değişiklikleri hücre gövdesi boyunca nasıl yaydığını göstererek, yöntemi doku düzeyindeki kuvvet iletimiyle ilgili preklinik sürekliliğe bağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Yöntemi, vasküler, epitel ve mezenşimal hücre modellerinde mekanosensitif hedefleri incelemek için yeniden kullanılabilir bir yetkinlik olarak çerçeveler.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hedef doğrulamada öngörülebilir güven, mekanotransdüksiyon yolaklarında mekanistik belirsizliğin azaltılması.
- Operasyonel Değer: Mekanik stimülasyonun ve çok modlu görüntülemenin standardizasyonu, tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği.
- Stratejik Değer: Mekanobiyoloji programlarında daha iyi git/gitme kararları, sermaye verimliliği ve azaltılmış geç evre biyolojik risk.
- Portföy Etkisi: Kuvvetle tetiklenen hücresel adaptasyonun doğrudan gözlemlenmesine dayalı, riske göre ayarlanmış önceliklendirme ve ilerleme kararları.
Uygulama Hususları
- AFM kullanımı, canlı hücre görüntüleme vele hücre iskeleti dinamikleri konusunda bilimsel uzmanlık gereklidir.
- Enstrümantasyon ihtiyaçları arasında titreşim sönümlemeli ve çift EM-CCD kameralı entegre AFM-TIRF-konfokal sistem yer almaktadır.
- Ekipler arası standardizasyon; uç fonksiyonelleştirmesi, fokal adezyon oluşumu ve stimülasyon zamanlaması için protokollere bağlı kalmayı gerektirir.
- Adaptasyon hususları; apikal stimülasyon spesifisitesini korurken farklı substrat sertlikleri, kaplama proteinleri ve hücre tiplerini içermektedir.
- Pratik kısıtlamalar arasında AFM ölçümleri sırasında gürültüye karşı duyarlılık ve kaymayı minimize etmek için kontrollü çevresel koşulların gerekliliği yer almaktadır.
