Çifte rezonans Tutarlı Anti-Stokes Raman saçılımı (CARS) Biyolojik Yapıların Diferansiyel Görüntüleme

Bu video, koherent ramen saçılma sinyallerine sahip biyolojik yapılarla ilişkili iki ramen rezonansının diferansiyel görüntülemesinin gerçekleştirilmesine yönelik bir prosedürü göstermektedir. İlk olarak, senkronize edilmiş üç kısa darbeli lazer zaman ve mekanda üst üste bindirilir. Üst üste bindirilen darbeler daha sonra, mikroskobik nesnelerden koherent ramen sinyallerinin üretilmesine olanak tanıyan standart bir ters mikroskoba gönderilir.

Üretilen farklı Raman sinyallerini karşılaştırmak amacıyla, sinyaller ticari bir yazılım kullanılarak görüntülere dönüştürülür. Sonuçlar, çift rezonanslı ve tek rezonanslı Raman sinyallerinden elde edilen görüntüler arasındaki farkın, zayıf Raman sinyalleri için artırılmış hassasiyet sağladığını göstermektedir. Merhaba, ben California Üniversitesi Davis'teki Biyofotonik Merkezi'nden Tyler Weeks.

Ben California Davis Üniversitesi Biyo Fotonik Merkezi ve İç Hastalıkları Bölümü'nden Thomas ER. Bugün size, hücrelerin kimyasal olarak spesifik görüntülerini üretmek için çift rezonanslı koherent antis Stokes Raman saçılması kullanma prosedürünü göstereceğiz. Bu prosedürü, yalnızca koherent antis Stokes Raman spektroskopisi ile doğrudan tespit edilemeyecek kadar zayıf olan moleküllerden gelen sinyalleri saptamak için kullanıyoruz.

Öyleyse başlayalım. CARS ve Dr CARS sinyallerini eş zamanlı olarak üretmek için üç adet ayarlanabilir ve senkronize kısa darbeli lazer kaynağı gereklidir. Bu senkronize darbeleri elde etmek için, 10 watt çıkış gücüne sahip tek bir kısa darbeli lazer ile başlayın. Sabit dalga boyu 1064 nanometre, sabit darbe süresi yedi pikosaniye ve sabit tekrarlama oranı 76 megahertz'dir.

Bir dizi yarım dalga plakası ve polarize ışın ayırıcı küpler kullanılarak, ışın üç parçaya ayrılır. Bir yarım dalga plakası ile polarize ışın ayırıcı kübün kombinasyonu, ışının yönünü değiştirmeden her bir bileşendeki güç miktarının ayarlanmasına olanak tanır. Tipik olarak, iki ışın yaklaşık olarak her biri 4,5 watt olacak şekilde ayarlanır ve üçüncü ışın geri kalan bir watt'ı içerir.

Ardından iki yüksek güçlü ışın, iki bağımsız optik parametrik osilatöre veya OPO'ya yönlendirilir. OPO'lar, yüksek enerjili bir fotonu farklı dalga boylarına sahip iki düşük enerjili fotona dönüştürmek için farklı frekans üretimi kullanır. Bu etkiyi elde etmek için kullanılan kristalin sıcaklığı kontrol edilerek, ortaya çıkan fotonların dalga boyları 0.1 nanometre hassasiyetle kontrol edilebilir.

Bu sinyallerin frekansının iki katına çıkarılmasıyla, 1064 nanometre sabit dalga boyuna sahip bir lazer, aynı 1064 nanometre kaynağıyla iki ayrı OPO'nun pompalanması sayesinde 780 nanometre ile 910 nanometre arasında herhangi bir değere ayarlanabilen bir lazer ışınına dönüştürülebilir. Orijinal pompa lazerimizle otomatik olarak senkronize olan, birbirinden bağımsız olarak ayarlanabilen iki lazer kaynağı elde edilir. 1064 nanometre pompa lazerinden gelen üçüncü ışın, dielektrik aynalar yardımıyla OPO'ların etrafından yönlendirilerek üç ışının da daha sonra yeniden birleştirilmesi sağlanır.

Tutarlı ramen sinyal fotonlarını verimli bir şekilde üretmek için, birleştirilen darbelerin hem zamansal hem de mekansal olarak üst üste gelmesi gerekir; çünkü OPO'lar, her lazer darbesinin kristalden birden fazla kez geçmesine izin veren halka boşluklar içerir ve OPO'lar üzerinden gönderilen ışın, orijinal pompa ışınına kıyasla önemli bir gecikmeye neden olan ekstra bir mesafe kat eder. Bu mesafe, yol uzunluğunun hassas ayarının sağlanması amacıyla dikroik aynalar kullanılarak yeniden birleştirilmeden önce, bu ışını diğer iki ışınla aynı mesafeyi kat etmeye zorlayan ek aynaların yerleştirildiği üçüncü bir ışın ile telafi edilmelidir. Her bir ışın, farklı lazer darbelerinin zamansal örtüşmesinin ayarlanmasına olanak tanıyan ayarlanabilir geciktirme kademeleri üzerinden gönderilir.

Her bir ışının lazer gücünün bağımsız olarak ayarlanabilmesi için her bir ışına birer set yarım dalga plakası ve polarizasyon ışın ayırıcı küpler eklenir. Önce iki OPO'dan gelen ışınları, ardından 1064 nanometre ışını birleştirmek için dikroik aynalar kullanılır; ışınların uzayda tam olarak üst üste gelmesini sağlamaya özen gösterilmelidir. Bu durum, ışınların dikroik aynanın birkaç santimetre yakınındaki örtüşmesi ile dikroik aynadan yaklaşık bir metre uzaklıktaki örtüşmesinin karşılaştırılmasıyla doğrulanabilir.

Yüksek ortalama güce sahip lazer ışınlarına maruz kalmak numuneye zarar verebileceği için, birleştirilen üç ışın, darbe seçici (pulse picker) olarak işlev gören bir elektrikli optik modülatörden geçirilir; bu modülatör, numuneye ulaşan darbelerin tekrarlanma hızının ve dolayısıyla ortalama gücün ayarlanmasına olanak tanır. Birleştirilmiş lazer ışınları daha sonra, yüksek sayısal açıklığa (numerical aperture veya na) sahip bir objektif lensli ters mikroskoba kenetlenir. Yüksek NA'lı objektif lensin sağladığı sık odaklama, mikroskobik uzunluk ölçeklerinde koherent raman sinyallerinin en verimli şekilde üretilmesini sağlar.

Mikroskobun objektif lensi, ticari demet taramalı konfokal mikroskoplara benzer şekilde demetlerin numune üzerinde raster tarama yapılarak görüntülerin elde edilmesini sağlayan bir X, Y, Z pizo tablası üzerine monte edilmiştir. Şimdi CARS ve D-R-F-W-M sinyallerinin nasıl oluşturulduğuna bakalım; üç kısa darbeli lazer demetinin numunedeki etkileşimi, iki lazerin çeşitli kombinasyonlarından kaynaklanan CARS gibi birçok dört dalga karıştırma sinyalinin yanı sıra, her üç lazerin kombinasyonundan kaynaklanan üç renkli CARS ve DR CARS sinyallerinin oluşmasıyla sonuçlanır. Sinyaller dalga boyu açısından birbirine nispeten yakın olduğunda, onları analiz için ayırmak zor olabilir.

Bu nedenle sinyaller, farklı dalga boylarındaki sinyalleri mekansal olarak ayırmak için bir monokromatör veya bant geçiren filtre görevi gören bir görüntüleme spektrometresine aktarılır. Spektrometre içerisindeki, indirilmiş konumdaki elektronik olarak tahrik edilen bir çevirme aynası, sinyali tüm sinyal aralığında spektroskopik bilgi sağlayan ve görüntülemek için seçilecek çeşitli koherent robin sinyallerini tanımlamamıza ve optimize etmemize olanak tanıyan arka aydınlatmalı derin boşaltımlı şarj coupled cihazına veya CCD kameraya gönderir. İlgilenilen piki CCD kameranın merkezine getirmek için, üretici tarafından sağlanan kontrol ve veri toplama yazılımını kullanarak spektrometre içindeki ızgarayı döndürmeniz yeterlidir.

Ardından, sinyali tek foton sayım avalanche foto DDE veya bir PD'nin bağlı olduğu ikinci bir çıkış portuna yönlendirmek için çevirme aynasının konumunu değiştirin. Objektif lensi raster şeklinde tarayın ve ardından veri toplama yazılımıyla her piksel için foton sayım hızını görüntüleyerek bir görüntü oluşturmak için A PD'de kaydedilen sinyalleri kullanın. Sinyallerin veri işleme aşamasında karşılaştırılabilmesi için bu görüntüleme prosedürünü istenen her bir koherent ramen sinyali için tekrarlayın.

Şimdi, net ve tekrarlanabilir görüntüler elde etmek için bir örneğin nasıl uygun şekilde hazırlanacağını görelim. Örneklerin hazırlanmasında bazı önlemler alınmalıdır. Örnekler tipik olarak yaklaşık 150 micron kalınlığındaki cam lameller üzerinde hazırlanır.

Bu lamel camlar, bu deneylerde kullanılan yüksek NA'lı su veya yağ immersiyon objektif lensleri ile yüksek çözünürlüklü görüntüleme yapmaya izin verecek kadar incedir. Tipik bir numune hazırlığını göstermek için, mikroskop lamına sabitlenmiş yaklaşık 20 mikron kalınlığında fare kas dokusu kesitleri hazırlıyoruz. Numuneye 20 µL beş molar döteryumlanmış glikoz çözeltisi damlası eklenir.

Döteryumlanmış glukoz çözeltisi, benzersiz ve güçlü bir Raman arka plan imzası sağlar. Örneklerin üzerine bir cam lamella yerleştirilir ve hücreler ile kültürler için oje ile sabitlenir. Hücrelerin, hücre kültürü yetiştirme kaplarından ayrılmasına gerek kalmadan görüntüleme yapılmasına olanak tanıyan cam tabanlı kültür kapları kullanılabilir.

Şimdi Dr car'lar için uygun Raman ve piklerin nasıl belirleneceğini görelim. Çift rezonanslı güçlendirme etkisinden uygun şekilde yararlanabilmek için, her iki Raman rezonanslı maddenin Raman spektrumları bilinmelidir. Bunlar tipik olarak, lipidlerle ilişkili 2.845 cm⁻¹ ve döteryumlanmış glikozla ilişkili CD gerilme modu için 2.121 cm⁻¹'dir.

İki lazer arasındaki frekans farkı bir moleküler titreşimin frekansıyla eşleştiğinde koherent Raman saçılması gerçekleşir. Bir OPO'nun 817 nanometreye ayarlanması, 1064 nanometre lazer ışını ile birleştirildiğinde 2.845 cm⁻¹ C modunu probe etmesini sağlar; diğer OPO'nun 868 nanometreye ayarlanması ise 1064 nanometre ışın ile birleştirildiğinde 2.121 cm⁻¹ değerini probe etmesini sağlar. Spektroskopik modda, CAR mikroskobu, ilgi çeken üç koherent Raman sinyalini gözlemlememize olanak tanır: CH germe titreşimini probe eden bir CAR sinyali, CD germe modunu probe eden bir CAR sinyali ve burada gösterilen diyagramda her ikisini de probe eden bir DR CAR sinyali; kesikli oklar OPO'lardaki lazerden gelen fotonları, düz oklar ise ortaya çıkan sinyali göstermektedir.

Katı yatay çizgiler, raman titreşiminin enerjisini belirtir ve DR araçlarında aynı üç giriş fotonunun karıştırılmasının aynı anda iki farklı raman titreşimini incelediğine dair görsel bir temsil sunar. Her bir pik için sinyal gücünün, bu pik konumlarının çevresinde ince adımlarla ayarlanarak optimize edilmesi gerekecektir. Burada her bir piki seçiyoruz ve derate edilmiş glukoz çözeltisindeki deniz solucanlarının görüntülerini alıyoruz; bu üç ayrı elde edilmiş görüntüye dayanarak ek bilgiler çıkarmak, oldukça basit bazı görüntü işleme süreçleri gerektirmektedir.

Öncelikle, görüntüler normalize edilmelidir. Normalizasyon için kullanılan pratik bir yöntem, lipidlerin hidrofobik olması gerçeğine dayanır. Bu, lipid yoğunluğunun yüksek olduğu bölgelerde, glikozdan gelen CD rezonansının çift rezonans sinyaline çok az katkıda bulunacağı anlamına gelir.

Aksine, saf glikoz çözeltisi bölgelerinde, lipidlerden gelen CH rezonanslarının da çok az katkıda bulunması gerekir. Bunu göz önünde bulundurarak, DR kanalının görüntüsünü ve döteryumlanmış glikoz çözeltisinin CD rezonansında elde edilen kanal görüntüsünü, CH rezonansı göstermemesi gereken, CL egan solucanının çok dışındaki bir bölgeye göre normalize edin. Ardından, CH rezonanslı kanal görüntüsündeki solucan içerisinde lipidlerce zengin bir bölge belirleyin ve burayı, normalize edilmiş DR kanal görüntüsündeki karşılık gelen bölgeye göre normalize edin.

Bu yöntemin düzgün çalışması için, bu bölgenin derinliklerinde döteryumlanmış glikozun bulunmadığı varsayılır. Lipidler hidrofobik olduğu ve solüsyonla karışmayacağı için bu güvenli bir varsayımdır. Artık, normalize edilmiş CH rezonans car görüntüsü normalize edilmiş DR car görüntüsünden çıkarılarak, sadece amplifiye edilmiş CD rezonans sinyali kalır; benzer şekilde, normalize edilmiş CD rezonans car görüntüsü normalize edilmiş Dr.FWM görüntüsünden çıkarılır.

Burada yalnızca yükseltilmiş CH rezonans sinyali gösterilmiştir; bu, alkin modifikasyonu içeren modifiye bir oleik asit için Raman spektrumudur. 2.845 cm⁻¹'deki güçlü CH rezonansları ve 2.121 cm⁻¹'deki alkin rezonansı, yoğun piklerin bulunduğu parmak izi bölgesinden iyi şekilde ayrılmıştır; bu da onları koheren Raman görüntüleme için ideal belirteçler haline getirir. Bu, üç kısa darbeli lazerin numune içinde örtüştürülmesiyle üretilen koheren Raman sinyallerinin tipik bir spektrumudur. Oklar, enerji diyagramları ile temsil edilen ve her bir sinyalden sorumlu olan süreçleri göstermektedir.

Bunlar, C. elegans solucanlarının DR CARS ve CARS kullanılarak görüntülenmesinden elde edilen tipik sonuçlardır. Üst satırda, düşük yoğunluklu glukoz çözeltisindeki bir solucanı görüntülemek için az önce gösterilen üç sinyal kullanılmıştır. İkinci satırda görüntüler uygun şekilde normalize edilmiş ve üçüncü satırda ise CARS görüntülerinin her biri DR CARS görüntüsünden çıkarılarak fark görüntüleri oluşturulmuştur. Böylece, çift rezonanslı koherent antis Raman mikroskobisine dayalı Raman fark görüntülemesinin nasıl gerçekleştirileceğini göstermiş olduk.

Bu prosedürü uygularken, ışınların uygun şekilde üst üste binmiş ve senkronize edilmiş olduğundan emin olmanın önemli olduğunu unutmayın. Ayrıca, farklı koherent sinyaller arasında geçiş yaparken, analizi etkileyeceği için numuneye çarpmamaya veya numuneyi hareket ettirmemeye dikkat edin. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.