Transgenik Zebra balığı Multicolor Time-lapse Görüntüleme: Hedefli Nöronal Hücre Ablasyon aktifleşir görselleştirme Retina Kök Hücreler

Transgenik hayvanlarda floresan raporlayıcıların ekspresyonu, canlı hastalık modellerinde deneysel manipülasyonlara verilen hücresel yanıtların izlenmesini mümkün kılar. Burada, zebra balıklarında seçici hücre kaybı farmakolojik olarak indüklenmiş; hedeflenen hücrelerin ve yakın komşularının yüksek çözünürlüklü çok renkli konfokal görüntüleri ilaç uygulamasından hemen önce, hemen sonra ve takip eden belirli aralıklarla elde edilmiştir. Görüntü analizi, iyileşme evresi boyunca endojen kök hücre popülasyonlarının aktivasyonunu ve ardından hedeflenen hücrelerin yerine konulduğunu göstermektedir.

Bu yöntem, rejeneratif biyoloji alanındaki "ayrı hücre tiplerini rejenerasyon için kullanılan hücresel ve moleküler mekanizmalar nelerdir" gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Döllenmeden sonraki 16. saatte, çiftleşmelerden toplanan transgenik yumurtaları 0.3 x danio çözeltisi içeren bir Petri kabına aktararak başlayın. Hedef dokuda herhangi bir pigmentasyon belirtisi görülmeden önce tirozinaz aktivitesini inhibe etmek için PTU ekleyin. Embriyo albino değilse, embriyoları 28.5 °C'de inkübe edin.

Raporlayıcılar belirgin hale geldiğinde, Petri kabını floresan stereo zoom mikroskobunun altına yerleştirin ve istenen transgen ekspresyonuna göre ayıklama yapın. Görüntüleme öncesinde, embriyo ortamında %0,5 düşük erime noktalı aeros montaj çözeltisi hazırlayın ve bunu 40 °C'de saklayın.

Gerekirse trica ve PTU ekleyin. Nazikçe karıştırın ve tekrar 40 °C'ye getirin. Balıkları, trica içeren embriyo ortamına yerleştirerek anestezi altına alın.

Balıklar yaklaşık üç dakika boyunca tepkisiz hale gelecektir. Mikropipet kullanarak dokunmak için, münferit balıkları yaklaşık 30 µL anestezik çözelti hacmindeki budanmış bir pipet ucuna çekin. Ardından, pipeti ters çevirin ve balığın dibe çökmesini sağlayın.

Ucu montaj solüsyonuna dokundurun ve yerleşimin yerçekimi ile gerçekleşmesini sağlayın. Tekrar kullanılabilmesi için agarın seyreltilmemesine dikkat edin. Mikropipette kalan anestezik solüsyonu atın.

Ardından aynı uçla balığı bir Petri kabına aktarın. Yaklaşık 30 µL mount çözeltisi içerisinde, ilgi alanı aeros damlacığının merkezine gelecek şekilde balığı nazikçe konumlandırın. Aeros katılaşana kadar balığın istenen konumda kaldığından emin olun.

İstenirse, tek bir Petri kabına birden fazla balık yerleştirilebilir. Aeros katılaştıktan sonra balıkları konfokal mikroskop tablasına taşıyın ve balıklar tamamen suya gömülene kadar kaba PTU içeren veya içermeyen trica içeren embriyo medyumu yavaşça ekleyin. Görüntüleme yazılımını açın ve hücresel ve/veya moleküler detayların optimal görüntülemesi için ilgilenilen bölgeye odaklanın.

Yazılımda, yüksek sayısal açıklığa sahip uzun çalışma mesafeli objektifler kullanın. Çevirme listesinden uygun flora kanallarını seçin. Spektral ayarlar kısmına tıklayın ve emisyon aralıklarında düzenlemeler yapın.

Raporlayıcı sinyallerin temiz bir şekilde ayrılmasını sağlamak ve sinyal-gürültü oranlarını maksimize etmek için, yazılım tarafından tanımlanan ön ayarların doğru şekilde düzenlendiğinden emin olmak adına açılır menüden uygun objektifi seçin. Lazerleri odaklamak ve güç seviyelerini ayarlamak için, her kanal için piksel doygunluğunu gösteren bir çıkışı arama tablosundan seçin.

Ardından, istenen görüntü kalitesini elde etmek için dedektör hassasiyetini ayarlayın ve görüntü yoğunluğu kabul edilebilir düzeye gelene kadar lazer çıkışını kademeli olarak artırın. İlgi bölgesinde piksel doygunluğundan kaçının ve fotobleyklendirme ile fototoksisite sorunlarını azaltmak için lazer seviyelerini mümkün olduğunca düşük tutun.

Tüm görüntüleme kanallarını izlerken lazerleri manuel olarak açıp kapatarak, her bir lazer hattının yalnızca uygun kanalda tespit edilebilir sinyal ürettiğinden emin olun. Herhangi bir çapraz etkileşim (crosstalk) görülmüyorsa, tüm kanallar eş zamanlı olarak elde edilebilir. Ardından, zoom ve döndürme fonksiyonlarını kullanarak ilgilenilen alanı çerçeveleyin.

Ardından, daha hızlı tarama hızları kullanarak lazer bekleme süresini minimize eden ve zamansal çözünürlüğü artıran tarama hızını ve görüntü boyutunu ayarlayın. Z boyutu adım boyutunu deneysel ihtiyaçlara göre belirleyin. Burada, retinal dokunun yedi optik kesitini görüntülemek için 10 mikronluk bir adım boyutu kullanılmıştır.

Uygun ayarlar belirlendikten sonra Zack görüntülerini edinin ve kaydedin. Ardından bir sonraki balığa geçin. Hücresel değişimleri ardışık günler boyunca izlemek için, beraberindeki yazılı belgede yer alan talimatlara göre seri yakala-bırak görüntüleme işlemi gerçekleştirilebilir.

Çoklu raporlayıcı görüntüleme deneyi gerçekleştirilirken, spektral olarak iyi ayrışmış floresanların kullanılması en iyisidir; ancak bu her zaman pratik olmayabilir. Burada, örtüşen eksitasyon ve emisyon profillerine sahip floresanları ayırmak için açık kaynaklı ImageJ yazılımını kullanan basit bir görüntü çıkarma yöntemini gösteriyoruz. Bizim örneğimizde bunlar GFP ve YFP'dir.

Bu videoda açıklanan zaman ayarlı görüntüleme teknikleri, retinal bipolar nöronların ablasyonu ve rejenerasyonu sırasında GFP etiketli retinal kök hücreleri izlemek için kullanılmıştır. Spektral ayırımı gerçekleştirmek için, örtüşen floresanların sırasıyla bağımsız olarak elde edilmesini ve kısmen ayrıştırılmasını sağlayan ardışık görüntüleme modlarını ve değişken bariyer filtre ayarlarını kullanarak görüntüler toplayın. Görüntüler elde edildikten sonra, görüntü dosyalarını açmak için ImageJ loci bio formas import aracını kullanın ve içe aktarma aracını başlatın. İlgili dosyayı ImageJ penceresine sürükleyin.

Align three TP eklentisini başlatmak için içe aktarma penceresindeki kanalları ayır (split channels) onay kutusunu kullanarak kanalları ayrı yığınlara bölün. Eklentiler (plugins) sekmesine, ardından yığınları hizala (align stacks) seçeneğine tıklayın. Sonrasında align three tp seçeneğini seçin.

Doğru çıkarma işleminin sağlanması için yığınlar hizalanmalıdır. İlk açılır kutudan referans yığını, ikincisinden ise hizalanmamış yığını seçin. "use XY relative origin" ve "use Z relative origin" kutucuklarını işaretleyin ve tamam'a tıklayın.

Hizalama işlemini başlatmak için hacim kaydı butonuna tıklayın. Hizalama parametrelerini içeren yeni bir pencere açılacaktır. Tamam'a tıklayın.

Bu bölüm, eklentinin dağıtıcısı tarafından optimize edildiğinden herhangi bir modifikasyona gerek yoktur. İşlem tamamlandığında, hizalanmış yığınlar penceresi görünecektir. Çıktı penceresini açmak için hizalanmış pencereden çıktıyı seçin.

Bu pencere de optimize edilmiştir ve herhangi bir değişikliğe ihtiyaç duymaz. Tamam'a tıklayın. Çalışma alanında, dosya başlığının sonuna "aligned" ifadesi eklenmiş yeni bir yığın görünecektir.

Görüntü hesaplayıcıyı kullanarak çapraz etkileşimi gidermek için, işlem menüsüne ardından görüntü hesaplayıcıya tıklayın. Birinci görüntü açılır kutusundan çıkarılacak yığını ve çıkarma işleminde kullanılacak yığını seçin. İkinci görüntü açılır kutusunda, işlem açılır kutusundan çıkarma seçeneğini seçin ve tamam'a tıklayın.

Image J, yığının (stack) işlenmesini isteyecektir. Evet seçeneğini belirleyin. Üst üste binen kanallar arasındaki çapraz etkileşimin (crosstalk) giderildiği yeni bir yığın görünmelidir.

Hizalama ve çıkarma işlemlerinden önceki aynı görüntü yapısını yeniden oluşturmak için yığınları birleştirin. Kanal araçları penceresinde birleştirilmiş kanallar seçilerek, araç yardımıyla dört yığına kadar hiper yığın (hyper stack) halinde birleştirilebilir. Son olarak, kanalları renklendirin, parlaklık ve kontrast ayarlarını yapın ve nitro redüktazın hedeflenen kaybını ve rejenerasyonunu incelemek için dosyaları tiff olarak kaydedin.

M cherry ekspresyonu yapan retinal bipolar hücreler. Tedavi öncesinde tekil zebrafish'lerde konfokal görüntülerden oluşan bir zaman serisi alınmıştır. Kontrollü bipolar hücrelerde membran etiketli YFP raporerinin sarı renkte, hedeflenen bipolar hücrelerde ise nitro redüktaz cherry füzyon proteininin kırmızı renkte mozaik ekspresyonu görülmektedir.

Siyan renkte gösterilen membran etiketli CFP transgeni, daha fazla netlik sağlamak amacıyla diğer çoğu retinal hücre hakkında bağlamsal bilgi sunmaktadır. CFP sinyali olmayan aynı görüntü, metronidazol uygulaması sonrası gösterilmiştir. Kırmızı renkli nitroredüktaz eksprese eden bipolar hücreler kaybolurken, sarı renkli kontrol bipolar hücreleri korunmuştur.

Bu, söz konusu ablasyon metodolojisinin oldukça spesifik doğasını göstermektedir. Netlik sağlamak amacıyla, aynı görüntü tekrar CFP olmadan gösterilmiştir. metro NIAZ uzaklaştırıldığında, NTR eksprese eden hücreler burada yeniden görülür.

G-F-P-Y-F-P çıkarma yöntemine bir örnek, bu şekildeki GFP etiketli Mueller GL hücreleri ile gösterilmiştir. GL hücreleri yeşil, YFP etiketli bipolar hücreler ise mor renkte gösterilmiştir. Çıkarma işleminin gerçekleştirilmesi için iki rengin örtüşmesi sonucunda beyaz renk oluşur.

Önce GFP ve YFP görüntüleri hizalanmalıdır. Ardından çıkarma işlemi, YFP ile işaretlenmiş bipolar hücrelerin GFP görüntüsünden çıkarılmasını sağlayarak, GFP ile işaretlenmiş Mueller glia hücrelerinin net bir şekilde temsil edilmesine ve daha sönük Mueller hücrelerinin tespit edilmesine olanak tanır. Sönük Mueller glia hücreleri ile kırmızıyla gösterilen M cherry ile işaretlenmiş bipolar hücreler arasındaki örtüşme artık doğrulanabilir.

Burada gösterilen veriler, bipolar hücre ablasyonunun kaybolan hücrelerin yerini doldurması için müller glia hücrelerini tetiklediğini göstermektedir. Bu yorum, hem memelilerde hem de balıklarda Müller glia hücrelerini yaralanma kaynaklı progenitörler olarak tanımlayan güncel retina rejenerasyonu çalışmalarıyla uyumludur. Bu teknik, araştırmacıların zebra balıklarındaki kök hücreleri görselleştirerek belirli hücre tiplerinin rejenerasyonunu düzenleyen mekanizmaları incelemesine olanak tanır.