Murin Islet İzolasyon ve subkapsüler Böbrek Nakli Bir Yöntem

Adacık transplantasyonu, tip 1 diyabet için potansiyel bir tedavi olarak önerilmiştir. Ancak, iki temel kısıtlama bunun yaygın bir klinik gerçeklik haline gelmesini engellemektedir. Birincisi, alıcı başına çok sayıda adacığa ihtiyaç duyulmasıdır.

Adacıklar organ donörlerinden elde edildiği için potansiyel alıcı sayısı oldukça sınırlıdır. İkinci transplantasyon, hastayı ve özellikle pediatrik popülasyonu malignite, enfeksiyon ve böbrek yetmezliği riskine maruz bırakan ömür boyu güçlü immünsüpresan tedavisi gerektirir. Klinik transplantasyon sonuçlarını iyileştirmeye yönelik stratejileri araştırmak amacıyla fare böbrek kapsülü altına adacık transplantasyonu gerçekleştirilir.

Sağlıklı donör farelerden izole edilen göz adacıkları gruplandırıldı ve transplantasyon için hazırlandı. Ardından göz adacıkları böbreğin subkapsüler boşluğuna nakledildi. Diyabetik alıcı farelerde göz adacığı grefti fonksiyonu, kan glukoz seviyelerinin izlenmesiyle değerlendirildi; bu izleme, 20 gramlık bir alıcı farede yaklaşık 250 ila 350 göz adacığının, transplantasyonu takiben 24 saat içinde glukoz seviyelerini normale döndürdüğünü (glisemi sağladığını) ortaya koymuştur.

Bu yöntemin görsel gösterimi, kanülasyon adımları açısından kritik öneme sahiptir. Ortak safra kanalının kanüle edilmesi ve gözlelerin böbreğin subkapsüler boşluğuna aktarılması zor öğrenilen işlemlerdir. Bu adımlar, doku yapılarının tanımlanmasını, sabit elleri ve doku hasarını en aza indiren tekniklerin kullanılmasını gerektirir.

Ötanazi uygulanmış bir fareyi, diseksiyon mikroskobunun altındaki bir kağıt havlu üzerine sırtüstü pozisyonda yerleştirin ve karnını %70 ethanol ile püskürtün. Kasık bölgesinden her iki ön bacağa doğru V şeklinde bir insizyon yaparak karnı açmak için makas kullanın. Fare, diseksiyon mikroskobunun altındadır.

Baş kısmı gözlemciye bakacak şekilde konumlandırın. Ortak safra kanalının duodenum girişini, yani ortak safra kanalının duodenum ağzını bir hemostatik klemple belirleyin. Hemostat, sıkıştırıldığında tam olarak pankreas-bağırsak sınırı boyunca ilerleyecek şekilde konumlandırılmalıdır.

Burada safra kanalının kanülasyonu için iki yöntem gösterilecektir. Safra kanalını kanüle etmek için serbest el yöntemi ve forseps destekli yöntem. Serbest el yöntemini kullanarak, ortak safra kanalı gergin hale gelene kadar duodenum üzerine kenetlenmiş hemostatı farenin başından kuyruğuna doğru çekin.

Safra kesesinden boşalan safra ile karaciğerden gelen enzimlerin birleştiği, karaciğere yakın bir safra kanalı konfluensi bulunur. Bağırsaklara girmeden önce, V pozisyonunun iç kısmını açığa çıkarmak için safra kanalını gergin tutun. Beş mililitrelik bir şırıngaya takılı, bükülmüş 27 gauge iğneyi, iğnenin V arasından kayarak geçmesini sağlayacak şekilde yerleştirin ve kanalın alt kısmını doğrudan kanüle edin. Karaciğere ve safra kesesine geri akışı önlemek için iğneyi, eğim ucunun birkaç milimetre ötesine itin.

Kanülasyon başarılı olduktan sonra, şırıngadan iki mililitre liase vererek pankreası perfüze edin. Optimal kanülasyonun bir göstergesi olarak pankreasın mide üzerinden genişlemesini gözlemleyin. Alternatif olarak, safra kanalı da kanüle edilebilir.

Forsep kisti yöntemini kullanarak; duodenum üzerinde kenetlenmiş olan hemostat C'yi, farenin başından kuyruk kısmına doğru çekerek ortak safra kanalının kıvrılmasını sağlayın. Ardından, beş mililitrelik bir şırıngaya takılı eğilmiş 27 gauge bir iğne kullanarak, karaciğere yakın bölgede ortak safra kanalının altındaki fasyayı delin.

İğne yerindeyken, iğneyi kullanarak fasya tabakasını kanal üzerinden temizleyin. Hemostatı bırakıp bir forseps alın. İğnenin fasyayı temizlediği bölgede safra kanalını desteklemek için açık forsepsin bir kolunu kullanırken, kanalı ve forsepsi öne doğru çekin.

Penseti destek olarak kullanarak iğneyi duktusun içine kaydırın. Başarılı bir kanülasyon, midenin üzerindeki pankreas bölgesinin eşit şekilde genişlemesiyle anlaşılır. Pankreas perfüze edildikten sonra, hemostatı duodenumdan çıkarın.

Ardından, duodenumu kaldırmak için pensi kullanın ve pankreası bağırsaklardan ayırmak için ikinci bir pens çifti kullanın. Daha sonra, pankreası midenin üst kısmından ve dalaktan ayırarak çekin. Son olarak, pankreası karnın dışına kaldırın ve bağırsak, mide ve dalakla olan geri kalan fasya bağlantılarını keserek serbest bırakın.

Pankreası 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin ve buz üzerine koyun. Pankreası, beraberindeki yazılı protokoldeki talimatlara göre 37 degrees Celsius sıcaklıkta inkübe edin. İnkübasyon sonrası tüplere 20 mililitre besiyeri ekleyin ve tüpleri 10 saniye boyunca 40 kez şiddetli bir şekilde çalkalayarak dokuyu disosiye edin.

Bu adım, menekşelerin optimum düzeyde geri kazanımı için kritiktir. Hücreleri dakikada 800 devirle santrifüjleyin. Çökelekleri 15 mililitre besiyerinde resüspande edin ve örnekleri yoğunlaştırın.

Yeniden süspande edilen bulamacı 0,419 milimetrelik bir tel süzgeçten geçirerek yeni bir 50 mililitrelik konik tüpe aktarın. İlk tüpü, %10 fetal bovine serum içeren ek 10 mililitre besiyeri ile durulayın ve tel süzgeçten geçirin; hücreleri santrifüj ile çöktürün. Pelleti beş mililitre oda sıcaklığındaki hisopaque 1077 ile yeniden süspande edin. Ardından birkaç saniye boyunca nazikçe vorteksleyin, tüpün iç çeperindeki hücreleri yıkamak için ek beş mililitre hisopaque ekleyin; 10 mililitre serumsuz RPMI'ı tüpün kenarından, 10 saniyede bir mililitre hızla yavaşça pipetleyerek üst tabakaya ekleyin.

Keskin bir ara yüz belirgin olmalıdır. Ardından örnekleri, sallanan kovalı bir santrifüjde, 20 °C'de ve 900 ×g'de, çok düşük hızlanma ile 20 dakika boyunca santrifüjleyin; santrifüjleme sonrası frenleme yapmayın, ardından adacıklar tek kullanımlık 10 mL serolojik pipet kullanılarak ekzokrin hücrelerden ayrılacaktır. Adacıkları histo Paque medya ara yüzünden yeni bir 50 mL konik tüpe aktarın.

Adacık kalıntılarını uzaklaştırmak için bu noktada birkaç tüp birleştirilebilir; ardından tüpler serum içeren besiyeri ile doldurulur ve tüpler dakikada 800 devirde iki dakika boyunca santrifüj edilerek adacıklar çöktürülür. Daha sonra adacıklar taze besiyerinde yeniden süspanse edilir. Bu adımı en az iki kez tekrarlayın.

Pelleti beş mililitre besiyerinde süspande edin. 15 mililitrelik konik bir tüpün üzerine 0,1 milimetrelik naylon hücre süzgecini ters şekilde yerleştirin. Gözlemleri toplamak için yeniden süspande edilen hücre bulamacını pipetle süzgeçten geçirin.

Ardından 50 mililitrelik tüpü altı mililitre daha besiyeri ile durulayın ve süzgeçten geçirin. 10 santimetrelik bir Petri kabına üç mililitre besiyeri damlatın. Hücre süzgecini ters çevirip gözletleri toplamak için besiyeri damlasına daldırın; süzgeçten geçirerek Petri kabına beş ila yedi mililitre daha kültür besiyeri pipetleyin.

Süzgeçte kalan eyelet'leri 4x objektif altında toplamak için, eyelet'leri P 200 pipet ile tek tek seçin ve 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Bu görüntüler, 12 haftalık C 57 black six farelerinden izole edilen eyelet'leri göstermektedir. İzolasyon prosedürü tamamlandığında, eyelet'lerin saflığı ve kalitesi mikroskobik olarak tahmin edilebilir.

Örneğin, burada gösterilen iki görüntü, debris ve ekzokrin hücre kontaminasyonunun bulunduğu temsili bir alanı göstermektedir. Bir deney için eyelet seçerken, kontamine olmuş ekzokrin hücreleri veya sağlıksız görünen eyeletleri seçmekten kaçının. İzolasyondan 24 saat sonra çekilen bu şekilde gösterildiği üzere, nekrotik merkezli eyeletler sağlıksızdır; nekrotik merkezler izolasyonun hemen ardından görünür olmayacaktır.

Hücre dökülmesi gösteren adacıklar kaçınılmazdır ve adacıkların yer aldığı bu 24 saatlik zaman atlamalı videoda, adacık transplantasyonunda kullanılabilirler. İzolasyonu takiben, birçok adacığın içinde nekrotik merkezler gelişir. Adacıklar seçilirken, bu nekrotik merkezlerin kaydın sonuna doğru adacıktan atıldığı görülmektedir.

Her tüpte kuşgözü kalitesinin ve boyutunun eşit dağıldığından emin olacak şekilde gruplandırın. Örneğin, 15 kuşgözünden oluşan her grup; dört adet büyük boyutlu kuşgözü, altı adet orta boyutlu kuşgözü ve beş adet küçük kuşgözü içerebilir. Tüpü buz üzerine yerleştirin; kuşgözleri nakil için hemen kullanılabilir veya manipüle edilebilir.

Kullanımdan önce. Steril bir jel yükleme ucunu, ucun dar kısmında U şekli oluşturacak hafif bir bükülme meydana gelecek şekilde 1,5 mililitrelik bir mikro füzyon tüpünün ağzına yerleştirin. Ucun her iki ağzı da mikro füzyon tüpünden doğrudan yukarıya bakmalıdır.

Bir tüp kuşgözünü buzdan yavaşça çıkarın. Tüm kuşgözlerinin tüpün dibine çöktüğünden emin olun. P 200 pipeti kullanarak kuşgözlerini tüpün dibinden minimum hacimde nazikçe toplayın ve hazırlanan eğri uca aktarın.

Adacıklar çöktükten sonra, adacık içeren jel yükleme ucunun geniş açıklığından medyayı aspire ederek ucun ucundaki medyanın mümkün olduğunca fazlasını uzaklaştırın. P 200 pipete yeni bir jel yükleme ucu takın. Tüpün eğimsiz ucunu, adacık içeren jel yükleme ucunun dar açıklığına takın. Ardından ucu bir P 200 pipete takın ve adacıkları nazikçe tüpün içine itin.

Ardından, PE 50 tüpünün eğimli olmayan ucunu 25 mikrolitrelik bir Hamilton şırıngasının iğnesine bağlayın. Pistonu geri çekmiş haldeyken, halkalar eğimli açıklıktan yaklaşık 0,5 santimetre uzağa gelene kadar şırınga pistonuna basın. Böbrek halkaları almaya hazırlandığı sırada, halkaların tüpün eğimli açıklığının yakınında tek bir kütle halinde toplanması için şırıngayı kenara ayırın.

Tüyleri kırparak ve cildi sırasıyla üç kez Betadine ve %70 izopropil alkol ile ovarak temizleyerek cerrahi bölgeyi hazırlayın. Alıcı farede anesteziyi doğrulamak için ayak ucunu sıkarak gözlet transplantasyon prosedürüne başlayın. Bir cam çubuğun gövdesini, farenin doğrudan altına ve böbreğin altına, omuriliğe dik olacak şekilde yerleştirin.

Ardından böbreği cilt üzerinden bulun ve steril bir cerrahi örtü yerleştirin. Böbrek bulunduğunda, hemen üzerindeki dermis üzerinden, omuriliğe dik olacak şekilde iki santimetrelik bir insizyon yapmak için McFerson banis makası kullanın. Bu insizyon, makas yardımıyla periton duvarını açığa çıkaracaktır.

Cam çubuğun gövdesini destek olarak kullanarak, dermal katmandaki kesikle aynı yönde periton duvarı boyunca bir santimetrelik bir insizyon yapın; komşu yüzeye aşağı doğru bastırarak böbreği periton açıklığından dışarı itin. Açığa çıkan böbrek yüzeyini, emdirilmiş pamuk uçlu bir aplikatör kullanarak buz gibi soğuk, steril PBS ile nemlendirin. Böbrek kapsülünün kurumasını önlemek için gerektiğinde bu adımı birkaç dakikada bir tekrarlayın.

27 gauge bir iğne kullanarak, böbreğin ön yüzeyi boyunca böbrek kapsülünde 0,2 santimetre boyutunda bir insizyon yapın. Sol lateral taraftan sağ lateral tarafa doğru hareket ederek, alevle çekilmiş bir cam kapiler tüp yerleştirin. Daha önce yapılan insizyon aracılığıyla sondaj yapın ve tüpü böbreğin dorsal lateral yüzeyi boyunca posterior yönde ilerletin.

Böbrek kapsülü ile böbrek parenkimi arasında bir cep oluşturmak için, hazırlanmış 25 milliliter Hamilton şırıngasındaki halkaları esnek tüpün eğimli açıklığının en uç kısmına kaydırın. Ardından, eğimli kenar yukarı bakacak şekilde subkapsüler cebe yerleştirin. Uzun kenar böbrek parenkimi ile temas halindedir.

Tüpü kapsülün en posterior ucuna taşıyın. Ardından, şırınganın pistonunu bastırarak eyelet'leri PE 50 tüpünden subkapsüler cebe yavaşça aktarın. Eyelet'ler cebi doldurdukça, daha fazla yer açmak için esnek tüpü yavaşça geri çekin.

Tüp poşetten çıkarıldıktan sonra, gözleri poşetin proksimal ucuna nazikçe yerleştirmek için cam probu böbreğin dış yüzeyi boyunca anteriordan posteriora doğru kaydırın. Dirsekli pens kullanarak, böbrek için açılan deliğin bitişiğindeki peritoneal astarı kaldırın. Ardından, PBS emdirilmiş pamuk uçlu bir aplikatör kullanarak böbreği nazikçe peritoneal kaviteye geri itin.

Periton duvarına sütür ve dermal tabakaya yara klipsleri uygulayarak fareyi kapatın. Fareyi kafesine geri koyun ve gözlemleyin. İyileşme süreci için farenin içme suyuna asetaminofen eklenmelidir.

İzole edilen C fare gözleri, bu videoda açıklanan yöntemler kullanılarak ve küratif bir dozda allojenik C 57 black six farelere nakledildi. Ameliyat sonrası birinci günden itibaren açlık dışı kan glikoz seviyeleri izlendi.

Burada, allojenik bir donörden 300 gözeyik alan 20 gramlık alıcı farelerde reddetme reaksiyonu 17. gün civarında görülmektedir. Syngenik donörlerden 150 veya 300 gözeyik alan farelerde iyileşme izlenmiştir. Gözeyikler syngenik donörlerden geldiği için bu transplantasyonlarda herhangi bir reddetme reaksiyonu görülmez.

Uygulanan adacık dozu, transplantasyonun hemen ardından adacıkların temel işlevini ölçer. 150 adacık ile marjinal bir iyileşme görülürken, 300 adacık transplantasyonu yapıldığında tam iyileşme görülmüştür. Bu videoyu izledikten sonra, fare adacıklarını izole etmek ve bu adacıkları böbreğin subkapsüler boşluğuna transplant etmek için gereken kritik adımları nasıl gerçekleştireceğiniz konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmanız gerekir.

Pratik yaptıkça, bu protokolün en zor adımı olan ana safra kanalının kanülasyonunu hızlıca gerçekleştirme becerisi geliştireceksiniz.