Izoform özel Gen Hedefler Belirlemek için ChIP kullanarak genom analizi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bir KDM5A/KDM5B/KDM5C histone demetilaz olan KDM5A'nın genomik hedeflerini belirlemektir. Bu işlem, ilk olarak çapraz bağlanmış kromatin hazırlanması ve ikinci adım olarak uygun boyutta DNA fragmanları üretmek için sonikasyon uygulanmasıyla gerçekleştirilir. KDM5A'ya bağlı DNA fragmanları, KDM5A antikorları kullanılarak immünopresipite edilir.

Ardından, geri kazanılan genomik DNA, sekanslama için PCR ile çoğaltılır. Son olarak, Illumina ile sekanslanan kısa okumalar insan genomuna özgün şekilde hizalanır; anlamlı pikler belirlenerek en yakın genlerle ilişkilendirilir. Rbbb iki hedef genini tanımlamak amacıyla, genom genelindeki Rbbb iki zenginleşmiş bölgelerin belirlenmesine dayanarak Rrb B iki hedef geni ile ilişkili moleküler fonksiyonları gösteren sonuçlar elde edilir.

Merhaba, ben Mike. Chicago'daki Illinois Üniversitesi Biyokimya ve Moleküler Genetik Bölümü'nde Dr. Elizabeth Bencia'nın laboratuvarından geliyorum. Ben de BARCEL Biyomedikal Araştırma Parkı Üniversitesi'nde Dr. NGA liderliğindeki Biyomedikal Genomik laboratuvarından Ala.

Ben Danielle Dal. Ben de William Richter. İkimiz de Benevolence Beceri Laboratuvarı'ndayız.

Bugün sizlere kromatin immünopresipitasyon ve sekanslama prosedürünü göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarımızda histon demetilazların bağlanma bölgelerini incelemek için kullanıyoruz. Hadi başlayalım.

Bu prosedüre başlamak için, her bir immünopresipitasyon veya ip için yaklaşık 10⁸ hücre büyütün. Burada, diffüz osteolitik lenfoma kullanılmıştır.

U 9 37 hücreleri kullanılır ve hücre büyümesini takiben 96 saat boyunca TPA ile monositik farklılaşma için indüklenir; formaldehit çözeltisi doğrudan besiyerine %1 nihai konsantrasyona gelecek şekilde eklenir. Ardından balonu kısa bir süre çalkalayın ve oda sıcaklığında 10 dakika bekletin. Sonrasında besiyerini aspire edin ve hücreleri 15 mililitre buz gibi soğuk PBS ile durulayın. Bu yıkama işlemini bir kez daha tekrarlayın.

Ardından, buz üzerindeki her bir erlene altı mililitre lizis tamponu bir ekleyin. Sonra erlenleri dört santigrat derecede 20 dakika boyunca sallayın. Son olarak, hücreleri bir hücre kazıyıcı kullanarak toplayın ve 15 mililitrelik konik tüplere aktarın.

Bu noktada hücreler -80 °C'de saklanabilir. Hücreler dondurulmuşsa, onları çözdürün. Çözdürme işlemi tamamlandıktan sonra hücreleri santrifüjleyin ve süpernatantı atın.

Ardından hücreleri altı mililitre lizis tamponu iki içerisinde tekrar süspanse edin ve tüpleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hafifçe sallayın. Santrifüj işlemini tekrarlayın ve hücreleri 2,5 mililitre lizis tamponu üç içerisinde tekrar süspanse edin. Sonrasında, süspansiyonu buzlu su dolu bir behere yerleştirerek sonikasyona hazırlayın ve genliği %50 ile %60 arasında ayarlanmış bir Branson 450 sonikatörün mikro ucunu kullanın.

Çözeltiyi 32 saniyelik sabit bir patlama şeklinde sonike edin ve buz üzerinde soğutun. Bu darbeleri bir dakika boyunca 10 ila 15 kez tekrarlayın, ardından tüpün içeriğini pipetle yukarı aşağı çekerek yeni bir tüpe aktarın. Çözeltiyi darbeli sonikasyon ve soğutma işlemine devam ettirin.

Sonikasyondan sonra beş kez daha, çözelti hacminin onda birine %10 Triton X 100 ekleyin. Ardından lizatları 1,5 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın ve kromatin immünopresipitasyon veya chip öncesinde kalıntıları mikro santrifüjle çöktürün. Hücre lizatının 50 mikrolitresini girdi örneği olarak saklayın.

Ardından, berraklaştırılmış hücre lizatı, yazılı protokolde açıklandığı şekilde önceden hazırlanmış antikor bağlı dyna beadlerle birleştirildi. Karışımı, 50 µL girdi örneğiyle birlikte dört °C'de gece boyunca sallayarak inkübe edin. Boncukları bir mL yıkama tamponu ile yıkayın.

Ardından, boncukları toplamak için manyetik bir stant kullanın ve süpernatantı uzaklaştırın. Bu yıkama işlemini altı ila sekiz kez tekrarlayın. Son yıkamayı bir mililitre TE artı 50 millimolar sodyum klorür ile gerçekleştirin.

Santrifüj işleminin ardından boncukları bir mikro santrifüjde döndürün ve kalan TE tamponunu aspire edin. Ardından, örneklere hemen 100 µL elu tamponu ekleyin.

Numuneleri 65 °C'de 10 ila 15 dakika inkübe edin. Boncukların süspansiyon halinde kalmasını sağlamak için tüpleri her iki dakikada bir 1,5 mL tüp rafına sürterek hafifçe çalkalayın. Boncukları santrifüj ve manyetik stand kullanarak toplayın ve SNAT'ı bir PCR tüpüne aktarın.

Ardından, daha önce saklanan girdi örneğini geri alın ve üç hacim elüsyon tamponu ekleyin. Son olarak, IP ve girdi örneklerini gece boyunca 65 °C'de termal döngüleyiciye yerleştirin. Ertesi gün çapraz bağları geri çevirmek için örneklere bir hacim TE tamponu ekleyin.

Ardından, RNA A'yı 0.2 µg/µL nihai konsantrasyona gelecek şekilde ekleyin. Örnekleri termal döngüleyicide 37 °C'de bir ila iki saat inkübe edin. İnkübasyon sonrası, proteinaz K'yı 0.2 µg/µL nihai konsantrasyona gelecek şekilde ekleyin.

Ardından örnekleri termal döngüleyicide 55 °C'de iki saat boyunca inkübe edin. Sonrasında, örnekleri bir birim fenol ile bir kez ekstrakte edin. Örnekleri ikinci kez bir birim fenol kloroform izoamil alkol ile ekstrakte edin.

Son olarak, örnekleri bir hacim kloroform izoamil alkol ile bir kez daha ekstre edin. Ardından, her örneğe 30 µg glikojen ekleyin. Ayrıca, örneklere final konsantrasyonu 0.2 M olacak şekilde sodyum klorür ve iki hacim etanol ekleyin.

Bunları -80 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından örnekleri santrifüjleyin ve süpernatanı dökün. Peletleri 500 µL %75 etanol ile yıkayın, ardından peletleri kurutun ve 40 µL su içerisinde yeniden süspande edin.

SONİKASYON prosedürü ile üretilen DNA fragmanlarının boyutlarını kontrol etmek için, saflaştırılmış girdi örneğinden beş mikrogramı %1,8'lik agaroz jele yükleyin ve jeli çalıştırın. Sonikasyon prosedürü, 150 ile 350 baz çifti aralığında fragmanlar üretmelidir. Ancak, fragmanlar bu aralıkta değilse, genomik DNA amplifikasyonu öncesinde patlama sayısı ve amplitüd değiştirilerek sonikasyon prosedürü ayarlanmalıdır.

Yazılı protokolde açıklandığı şekilde örneklerin boyutunu, konsantrasyonunu ve zenginleşmesini kontrol edin. Genomik DNA amplifikasyonuna başlamak için, IP örneğinden 34 µL ve girdi örneğinden 200 ng alın. Yazılı protokolde açıklandığı şekilde, bir Illumina genomik DNA örnek hazırlama kiti kullanarak DNA fragmanlarına A-kuyruğu eklemesi ve adaptör ligasyonu gerçekleştirin ve onarın.

DNA'yı bir mini lut PCR saflaştırma kiti kullanarak saflaştırın ve ardından 50 °C'ye önceden ısıtılmış EB tamponu ile elüe edin. IP ve girdi DNA örnekleri için sırasıyla 23 µL ve 46 µL kullanın. PCR reaksiyonunu, adaptörlü 23 µL DNA ve kit içerisindeki füzyon DNA polimerazın 25 µL'si ile hazırlayın.

20 µM konsantrasyonunda 1 µL sole PCR bir ve 20 µM konsantrasyonunda 1 µL sole PCR iki ekleyin. PCR reaksiyonunu yazılı protokolde açıklandığı şekilde yürütün. PCR amplifikasyonunun ardından, DNA'yı Qiagen mini loop PCR saflaştırma kiti ile saflaştırın.

15 µL tampon EB'yi 50 °C'ye kadar ön ısıtmaya tabi tutun; DNA'yı seyreltmek için 0.5 µL örneği bire dört oranında seyreltin ve amplifiye edilen ürünleri saflaştırmak için NanoDrop okuması gerçekleştirin. HPLC kalite su kullanarak 50 mL'lik %1,8 AGROS jel hazırlayın; AGROS eridikten sonra TAE ve bromür ekleyin. Ardından jeli dökün ve jeli yükleyin.

Giriş ve IP örneklerine dört µL yükleme tamponu ekledikten sonra, jeli 120 voltta 45 dakika boyunca çalıştırın. Jel çalışması tamamlandıktan sonra analiz edin. Analiz sonucunda 150 ile 350 baz çifti aralığında fragmanların oluştuğu görülmelidir.

Bunlar, uzunlukları 50 ile 250 baz çifti arasında olan genomik DNA fragmanlarını temsil eder. Ve bir adaptör, 150 ile 350 baz çifti aralığındaki materyali içeren jel bölgesini bir neşter ile kesip çıkarır. Yaklaşık 120 baz çiftinde seyreden adaptör adaptör bandının kesilmemesine dikkat edin.

DNA'yı, üretici talimatlarına uygun olarak bir kayak hızlı jel ekstraksiyon kiti kullanarak geri kazanın. Örneği, ısı uygulamadan bir speed vac içerisinde tam olarak 11 µL kalana kadar kurutun. Örnekten 1 µL alın ve DNA konsantrasyonunu bir NanoDrop spektrofotometre kullanarak ölçün.

Son olarak, zenginleşmiş gen ürünlerini Illumina genom analizörü kullanarak tanımlayın ve bağlanma bölgeleri ile hedef genleri yazılı protokolde açıklandığı şekilde analiz edin. Tanımlanan zenginleşmiş RB bağlayıcı protein iki veya RBP iki bağlanma bölgelerinin genomik koordinatları kromozom bazlı bir formatta sunulmuştur. Kromozomlardaki ensemble genlerin doluluk oranları siyah VAR'lar şeklinde görselleştirilebilir.

Burada kromozom 10 dolulukları gösterilmektedir; RBP2 bağlanma bölgeleri dikey çizgiler olarak belirtilmiştir. Orta panel, kromozom 10 üzerindeki tüm RBP2 izoform bağlanma bölgelerini, alt panel ise RBP2 büyük izoform bağlanma bölgelerini göstermektedir. Bu bilgiler, kromozom 10 üzerindeki RBP2 izoformlarının örtüşen ve spesifik doluluklarına genel bir bakış sunar.

Burada, rbp tarafından bağlanan genler arasında, yanlış keşif oranı veya FDR ile düzeltilmiş, anlamlı şekilde zenginleşmiş gen ontolojisi veya go moleküler fonksiyon kategorilerinin yer aldığı bir ısı haritası gösterilmektedir. Kırmızıya yakın iki renk yüksek istatistiksel anlamlılığı, sarı düşük istatistiksel anlamlılığı ve gri ise istatistiksel anlamlılığın olmadığını belirtmektedir.

Zenginleştirme analizi, RBP2 hedef genlerinin örtüşen ve izoform spesifik moleküler fonksiyonlarını göstermektedir. Bu prosedür sırasında, transkripsiyon faktörü bağlanma bölgelerinin nasıl tanımlanacağını size göstermiş olduk. Uygun boyut aralığında ve verimde DNA fragmanları üretmek önemlidir.

Bu durum, SONİKASYON adımı sırasında kılavuzlarımızı takip ederek gerçekleştirilebilir. Hepsi bu kadar. Deneylerinizde başarılar dileriz ve izlediğiniz için teşekkür ederiz.