Enterik Sinir Sistemi Alpha-sinüklein İçermelerin bir sonda ve Görüntü Analizi kullanarak Rotenone Oral İdaresi

Motor ve konuşma fonksiyon bozuklukları da dahil olmak üzere Parkinson hastalığının semptomları, beyindeki dopamin salgılayan hücrelerin aktivitesinin azalmasından kaynaklanır. Enterik sinir sistemi ve olfaktör bulb, en çok maruz kalan sinir yapılarıdır ve ilk etkilenen bölgelerdir. Parkinson hastalığı, pestisit maruziyeti ile ilişkilendirilmiştir.

Pestisitlerin enterik sinir sistemi üzerindeki etkilerini analiz etmek amacıyla, farelere oral gavaj yoluyla roone pestisiti uygulanır. Ardından farelere, beyin ve enterik sinir sistemini sabitlemek için %4 paraformaldehit ile intrakardiyak perfüzyon yapılır. Dokular çıkarılır, hazırlanır ve PD ile ilişkili proteinler için immünboyama işlemine tabi tutulur.

Konfokal mikroskopi ile elde edilen Beta three tubulin ve alpha synuclein görüntüleri, pestisite maruz kalan hayvanlarda enterik sinir sistemi nöronlarının içinde alpha synuclein birikimini göstermektedir. Bu tekniğin rotenonun sistemik uygulaması gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, bu teknik kullanıldığında rotenonun etkisinin enterik sinir sistemi ile sınırlandırılmasının sağlanmasıdır. Bu yöntem, Parkinson hastalığının etiyolojisi ve ilerlemesinin altında yatan mekanizmalar gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin etkileri, yeni terapötik hedeflerin ve tanı yöntemlerinin geliştirilmesine olanak tanıyacağı için Parkinson hastalığının tedavisine ve teşhisine kadar uzanmaktadır. Bu yöntem, Parkinson hastalığının patofizyolojisine dair içgörü sağlayabileceğinin yanı sıra; diğer çevresel toksinlerin enterik, sempatik ve parasempatik sinir sistemleri ile bağırsak duvarı üzerindeki etkilerinin incelenmesi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Genel olarak, bu yöntemlere yeni başlayan kişiler, gavage işlemini ustalıkla gerçekleştirmek zaman aldığı için zorluk yaşayabilirler.

Bu yöntemlerle ilgili fikrim ilk kez, pestisitler ile Parkinson hastalığı arasındaki bağlantı hakkında okuduğumda oluştu. Ayrıca 2005 yılında Berlin'de düzenlenen Dünya Parkinson Kongresi'ndeki yüksek CORA konferansını görmek de faydalı oldu. Bu yöntemin barışçıl bir şekilde gösterilmesi gereklidir.

Farelerin anatomisi insanlardan farklı olduğu için ol maddesinin gavage ile uygulanma yöntemi zordur; öte yandan, görüntü analizi bu görüntülere özel özelleştirilmiş adımlarla gerçekleştirilmiştir. Protokole hayvanı tartarak başlayın. Uygun rotenone hacmini hesaplayın.

Hayvan ağırlığının gramı başına 0,01 mililitre gereklidir, bu da kilogram başına beş miligramlık bir roone dozuna tekabül eder. Bir mililitrelik bir şırıngayı roone çözeltisiyle, ardından ikinci bir şırıngayı taşıyıcı çözeltiyle doldurun. Fareyi tutun ve farenin kuyruğunu bir elinizle kavrayın.

Diğer elin ilk iki parmağıyla çekerek boyun derisini gerin. Baş iki parmak arasında sabitlendiğinde, avuç içine yaslayın ve ters çevirin. Kuyruğu sabitleyin.

Dördüncü ve beşinci parmakları kullanarak, başı arkaya doğru tutarken farenin ağzını açmak için damağa bastırın. Gavage sondasını nazikçe ağza yerleştirin. Sondanın tüm uzunluğu yerleşene kadar, mide yönünde yavaşça ilerletin.

Materyalin akciğerlere kaçmasını önlemek için, embolusla nazikçe bastırarak roone çözeltisini veya taşıyıcıyı uygulayın. İşlem tamamlandığında gavage'ı yavaşça çıkarın ve tek bir kafesteki tüm hayvanların işlemleri bitene kadar hayvanı başka bir kafese geri yerleştirin. Tedavinin ardından farelere %4 paraformaldehit ile intrakardiyak perfüzyon uygulanır.

PBS içerisinde, bağırsaklar ardından diseksiyon yoluyla çıkarılır ve gece boyunca %15 sükroza yerleştirilir. Ertesi gün, doku %30 sükroza aktarılır ve tekrar dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edilir. Doku daha sonra eksi 80 derece Celsius'luk bir dondurucuya yerleştirilir ve kullanıma kadar saklanır. Bir kriyostat kullanılarak bağırsaktan 20 mikronluk kesitler alınır.

Kesitler rost lamlarına aktarılır, bloklama ve immün boyama işlemleri uygulanır. Ardından anti beta three tubulin ve Antifa synuclein antikorları kullanılarak boyama yapılır. Verilerin kör analizinin dışarıdan bir kişi tarafından yapılması önerilir.

Analize başlamak için Fiji yazılımını açın. Konfokal görüntü dosyasını açın. Ardından, her bir kanal üzerinde bağımsız olarak çalışabilmek için kanalları ayırın.

Kullanılmayacak olan kanalları kapatın ve seçin, analiz edin, ayarlayın, ölçekleyin ve piksel boyutunu bir olarak belirleyin. Bilinen mesafeyi 0.13 olarak ayarlayın ve global seçeneğine tıklayın. Görüntünün boyutu artık mikron cinsinden gösterilecektir.

Alfa sinüklein kanalını seçin ve ganglionu seçin. Seçimin tüm kesitlerde ganglionu kapsadığından emin olun. Sadece ganglion seçiliyken görüntüyü çoğaltın; böylece yalnızca ganglion boyutundaki bir görüntü çoğaltılmış olacaktır.

Düzenle'ye basın; seçilen bölgenin dışındaki görüntü kısımları siyah olacaktır. İşlemin ne kadar başarılı olduğunu belirlemek için görüntüyü tekrar kopyalayın. Sinyal-arka plan gürültü oranı düşük olan görüntüler, görüntü analizi için kullanılmamalıdır.

Görüntü ayarla eşik değerini (image adjust threshold) seçin. Ardından maksimum entropiyi (max entropy) seçin. Sonrasında, işlemin başarılı olduğundan emin olmak için kırpılan görüntüdeki ve orijinal görüntüdeki kesitler üzerinde gezinin.

Tropik eşik, görüntü histogramına dayanarak bir yoğunluk sinyal seviyesi seçer ve sadece bu eşikten daha yüksek yoğunluğa sahip pikseller beyaz üzerine siyah görüntü seçim işleminde görüntülenir. Ardından smooth seçeneğine tıklayın. Bu adım, görüntülerin pikselli kenarlarını düzgün kenarlara dönüştürür seçme işlemi.

Ardından binary sekmesine tıklayın ve Make binary seçeneğini belirleyin. Görüntü, beyaz üzerine siyah bir görüntü olarak görüntülenecektir; sonraki adımı kopya görüntü üzerinde gerçekleştirmek için görüntüyü çoğaltın, analyze sekmesine tıklayın ve analyze particles seçeneğini belirleyin. Daha sonra show outlines seçeneğini işaretleyin ve summarize butonuna tıklayın.

Geri kalan ayarlar varsayılan değerlerde bırakılmalıdır. Bu fonksiyon, sinyal veren toplam piksel sayısını ve bir araya gruplanmış olanların toplam sinyalli piksel yüzeyini tanımlar. Ayrıca, piksel grup sayısı ve ortalama boyut rapor edilir.

İyi uyum sağlayan ve toplam alanı en büyük olan kesiti karşılaştırıp seçin. Kesit işaretlenecektir. Toplam alfa sinüklein yüzeyini, inklüzyon sayısını ve ortalama partikül boyutunu içeren veri tablosunu kopyalayın.

Verileri bir Excel hesap tablosuna yapıştırın veya başka bir yere not edin. Fiji'ye geri dönün. Beta tubulin kanalında daha önce seçilen kesiti bulun ve seçin.

Gangliyon alanını seçin ve analiz et'e tıklayın. Ardından ölç'ü seçin. Gangliyonun toplam yüzeyini gösteren başka bir tablo görünecektir.

Tablodaki verileri alfa sinüklein ölçümünün yanındaki bir Excel hesap tablosuna çıkarın veya Excel kullanarak başka bir yere kopyalayın. Enterik sinir sistemi üzerinde lokal olarak etkili olan rotenonun etkilerini analiz etmek için, 1 yaşındaki C 57 black six farelere oral gavaj yoluyla kilogram başına beş miligram pestisit rotenon uygulanmıştır; bu amaçla alfa sinüklein ölçümünde elde edilen farklı parametreleri ganglion yüzeyine bölerek, toplam alfa-sinüklein yüzeyini ve ganglion boyutuna göre normalize edilmiş inklüzyon sayısını elde edin. Burada gösterilen kromatogram, uygulamadan bir saat sonra rotenon pikinin varlığını göstermektedir; kontroller, kilogram başına 20 miligram rotenon ve kilogram başına beş miligram rotenon ile tedavi edilen farelerdir.

Rotenon seviyeleri, burada gösterildiği gibi HPLC ile kan, beyin ve beyin sapı ekstraksiyonları için belirlenmiştir. Kilogram başına beş miligram rotenonun oral gavaj yoluyla uygulanması, HPLC ile belirlendiği üzere, tedaviyi takip eden bir, iki veya üç saat içinde kanda ölçülebilir seviyelere yol açmaz. Bu grafik, tedavi edilen farelerin beyin ve beyin sapındaki rotenon seviyelerini göstermektedir.

Kilogram başına 10 miligram veya daha az rotenon ekstraksiyonu uygulandıktan bir saat sonra, beyin veya beyin sapı örneklerinde rotenon seviyeleri görülmemiştir. Uygulamadan bir saat sonra, 1,5 aylık tedavi edilmiş farelerin kas ve beyin örneklerinde mitokondriyal kompleks I aktivitesi değerlendirilmiştir. Gruplar arasında anlamlı bir fark görülmemiştir ve mitokondriyal kompleks I'de herhangi bir inhibisyon saptanmamıştır; bu durum, söz konusu bölgelerde rotenon bulunmadığını doğrulamaktadır.

Rone uygulamasının ardından Parkinson hastalığının Lewy cisimciği bileşeni olan alfa sinükleinin analizi; toplam yüzeydeki alfa sinüklein miktarının, alfa sinüklein inklüzyonlarının varlığının ve hücredeki alfa sinüklein paterninin güvenilir bir şekilde belirlenmesine olanak tanır. Bu şekil, burada görülebileceği üzere duodenum ve ileum kesitlerindeki anti beta üç tübülin, alfa sinüklein ve DAPI boyamalarını göstermektedir. Roach ile yapılan 1,5 aylık tedavinin, üç aylık kontrollere kıyasla, enterik sinir sistemi ganglionları içinde artmış bir alfa sinüklein punktat paternini indüklediği bilinmektedir.

Bu patern hem ileumda hem de duodenumda görülebilir. Üç aylık tedavinin ardından, anti alfa-sinüklein kullanarak yapılan immunofloresan boyama ile daha büyük alfa-sinüklein inklüzyonlarının oluşumu görülebilir; theof, flavin ve DPI kullanıldığında ise daha büyük alfa-sinüklein birikimlerinin agregasyonu yalnızca üç aylık süreçte görülmektedir. Bu deney, otomatik segmentasyon ve entropi tabanlı eşikleme yöntemleri kullanılarak analiz edilmiştir.

Soldaki grafikte her bir sütun, toplam alfa sinüklein yüzeyinin ganglion yüzeyine oranını temsil etmektedir. Sağdaki grafikte ise her bir sütun, alınan ganglion yüzeyi başına toplam alfa sinüklein inklüzyon sayısını temsil etmektedir. Bu veriler birlikte, rotenone'un lokal uygulamalarının enterik sinir sistemi ganglionlarında gliyozis ile birlikte alfa sinüklein fosforilasyonunu, akümülasyonunu ve agregasyonunu indüklediğini göstermektedir. Bu teknik uzmanlaşıldıktan sonra, doğru şekilde uygulandığında hayvan başına bir dakikada tamamlanabilir.

Bu prosedürü uygularken, gavage iğnesini nazikçe yerleştirmek önemlidir; herhangi bir engelle karşılaşıldığında, iğneyi geri çıkarıp bu prosedürleri takip ederek yeniden yerleştirmek daha uygundur. HPLC, immün boyama ve görüntü analizi gibi diğer yöntemler de uygulanabilir. Bu, diğer bölgelerin, maddenin etkilerinin ve hatta maddenin gelişimi sonrası kandaki varlığının analiz edilmesine olanak sağlayacaktır.

Bu teknik, sinirbilimcilerin çevresel nörotoksinlerin enterik sinir sistemi üzerindeki etkilerini araştırmasının önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, mastarı doğru şekilde uygulayabilmeli ve immünokimyadan elde edilen görüntüleri analiz edebilmelisiniz. Çürümüş örneklerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın.

Bu nedenle, bu prosedürü gerçekleştirirken eldiven ve maske kullanmanızı öneririz.