Kollajen, Modüller kullanarak Micro-dokuların Fabrikasyon İçeren Hücreleri Jel

Bu prosedürün genel amacı, doku mühendisliği deneylerinde kullanılabilecek modüler mikro dokular üretmektir. Bu işlem, önce bir şırınga yardımıyla kolajen çözeltisinin bir polietilen tüp içine çekilmesi ve ardından kolajenin jelleştirilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda ise, mikro doku modüllerini oluşturmak için polietilen tüp iki milimetrelik uzunluklarda kesilir.

Prosedürün üçüncü adımı modüllerin tüplerden ayrılmasıdır ve son olarak modüller endotel hücreleri ile kaplanır. Nihayetinde, elde edilen mikro dokular, bir mikroakışkan bölme aracılığıyla hücrelerin etkileşimini incelemek için in vitro hücresel analizlerde kullanılabilir. Ek olarak, mikro dokuların in vivo ortamdaki etkileşimini ve yeniden yapılanmasını incelemek amacıyla doku üretmek için bu mikro dokular implante edilebilir.

Merhaba, ben Toronto Üniversitesi'ndeki Sepan Laboratuvarı'ndan Brendan Long. Büyük boyutlu 3D doku ikamelerinin oluşturulmasındaki temel engellerden biri, implantasyon sonrası hızlı vaskülarizasyonun eksikliğidir. Bu videoda, bu sınırlamanın aşılmasına yardımcı olmak için endotel hücreleri ile kaplanmış modüler dokuların nasıl oluşturulacağını göstereceğiz.

Prosedürü, Septin laboratuvarından ameliyat sonrası dönem uzmanı Chamberlain gerçekleştirecektir. Nötralize edilecek kolajen miktarı, polietilen tüpün uzunluğuna bağlı olacaktır. Bu gösterimde, 0.76 milimetre iç çaplı ve 1.22 milimetre dış çaplı, iki metre uzunluğunda bir polietilen tüp kullanacağız.

Tüpleri hazırlamak için, bir adet 20 G iğneyi tüpün bir ucundan geçirin ve ardından tüpü gaz sterilizasyonu için bir konvertör kendi kendini onaran poşete yerleştirin. Bir mililitre kolajen yaklaşık iki metre polietilen tüpü doldurduğundan, bir mililitre kolajeni nötralize edeceğiz. Kolajeni 15 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin ve tüpü buz üzerinde tutun.

Tüpe, mililitre başına 128 µL 10 x alpha-MEM kolajen ekleyin ve çözeltiyi tekrarlayan pipetleme işlemiyle karıştırın. Kabarcık oluşumunu minimize etmeye dikkat edin; alpha-MEM asitlenmiş kolajene karıştıkça çözelti sarı renge dönecektir. Ardından, 0,8 M sodyum bikarbonat ekleyerek kolajeni nötralize edin. pH hakkında genel bir tahmin yürütmek için, sarı kolajen çözeltisi açık pembe renge dönene kadar sodyum bikarbonat ekleyin.

7,4 pH değerine ulaşmak için genellikle mililitre başına 30 ila 60 µL kolajen kullanılır. Nötralize edilmiş kolajenin jelleşmesini önlemek için, kullanılmaya hazır olana kadar buz üzerinde tutun. Kolajen jelleştirme işlemine başlamak için, sterilize edilmiş polietilen tüpü içeren torbayı bir biyolojik güvenlik kabinine götürün ve tüp torbanın içinde kalacak şekilde torbanın kapalı ucunu kesin.

Sterilize edilmiş cımbız kullanarak, önceden tüpün bir ucuna takılmış olan 20 gauge iğneye üç mililitrelik bir şırınga takın. Tüpün diğer ucunu, buz üzerinde tutulan konik tüpün dibine ulaşana kadar nötralize edilmiş kolajenin içine yerleştirin. Bir sonraki adımı yavaşça gerçekleştirmeniz gerekir; aksi takdirde kolajenin içine hava kabarcıkları girecektir.

Kolajeni polietilen tüpün içine çekmek için şırınga pistonunu yavaşça geri çekin. Kolajen tüp boyunca çekildiğinde, 20 gauge iğneyi çıkarın ve tüpün her iki ucunu tekrar torbanın içine yerleştirin. Torbayı bantla kapattıktan sonra, 37 °C'de 60 dakika boyunca inkübe edin.

Tüpleri kesmek için önceden monte edilmiş bir kesme cihazı kullanılacaktır. Bu prosedüre başlamak için, tüpleri kesme cihazının önündeki steril bir tepsiye yerleştirin ve tüpleri kesme cihazının çıkış kısmından cihaza yükleyin; 25 mililitre endotel hücre medyumu içeren 50 mililitrelik konik bir tüp hazırlayın. Kesilen modülleri toplamak için kesme cihazını iki milimetre uzunluğunda tüp kesecek şekilde ayarlayın ve ardından tüpleri kesin.

Kesilmiş modülleri 50 mL'lik konik tüp içerisinde 37 °C'de 60 dakika boyunca inkübe edin. Kollajen modülleri tüpten ayırmak için, modülleri içeren 50 mL'lik konik tüpü orta hızda 10 saniye boyunca vorteksleyin; modüllerin tüpün dibine çökmesi yaklaşık beş dakika sürer.

Tüpün dibinde gevşek bir modül peleti oluşurken, tüpler medyanın üzerinde bir tabaka oluşturacaktır. Modüller çöktükten sonra, onları 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için geniş ağızlı, 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanın. 15 mililitrelik konik tüpü vorteksleyin ve ardından modüllerin iki kez daha çökmesine izin verin.

İkinci ve üçüncü girdaptan çöken modüller de 15 mililitrelik tüpe aktarılır. Tüm modüller tüplerden çıkarılıp bir araya getirildikten sonra, tüpteki besiyeri hacmi beş mililitreye tamamlanır. Modüller artık endotel hücreleri ile kaplanmaya hazırdır; bir sonraki bölümde modülleri kaplamak için endotel hücrelerinin nasıl hazırlanacağı gösterilecektir.

İlk olarak, hücrelerdeki besiyerini uzaklaştırın ve PBS ile yıkayın. PBS'yi uzaklaştırdıktan sonra, üç mililitre tripsin EDTA ekleyin ve 37 °C'de beş dakika inkübe edin. Ardından, hücreleri yedi mililitre besiyeri içinde süspanse edin ve 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Hücreleri bir hemositometre kullanarak sayın; konik tüpün dibindeki paketlenmiş modüller için mililitre başına 5 × 10⁶ endotelyal hücreye ihtiyacınız olacaktır. Hücreleri 300 G'de beş dakika boyunca pelletleyin. Hücre pelletini beş mililitre endotelyal hücre besiyerinde yeniden süspande edin.

Şimdi modüllere endotel hücreleri içeren beş mililitre besiyeri ekleyin. Modüller, endotel hücreleri ile hem statik hem de dinamik olarak inkübe edilir; statik inkübasyon için endotel hücreli modüller ters çevrilerek karıştırılır ve ardından tüp 37 °C'de 15 dakika boyunca dik konumda bekletilir. 15 dakika sonra tüpü tekrar ters çevirin ve 37 °C'de 15 dakika daha inkübe edin.

Modülleri endotel hücreleri ile dinamik olarak inkübe etmek için, 15 mililitrelik tüpü 37 °C'de 60 dakika boyunca hafifçe sallayın. Endotel hücreleri ile inkübasyon tamamlandığında, modülleri doku kültürü işleminden geçmemiş bir plakaya aktarın ve gece boyunca 37 °C'de inkübe edin; ertesi gün, yapışmamış endotel hücrelerini uzaklaştırmak için modülleri taze medyum içeren yeni bir doku kültürü işleminden geçmemiş plakaya yerleştirin. Endotel hücreleri ile kaplanmış modülleri, hücreler modül yüzeyinin %100'ünü kaplayana kadar 37 °C'de inkübe edin.

Bu işlem genellikle yaklaşık yedi gün sürer. Modüller tüpten ilk çıkarıldıklarında silindirik görünecektir. Endotel hücreleri ile kaplandıkları takdirde, hacimce %50'ye kadar büzülebilir, oval bir şekil alabilir ve ışık mikroskobu altında bakıldığında daha yoğun ve daha opak hale gelebilirler.

Bu görüntülerde modüllerin çapı ve uzunluğu sırasıyla d ve l ile belirtilmiştir. Bir sonraki görüntü, üretim anında modüller içerisinde homojen olarak dağılmış gömülü Hep G two hücrelerini göstermektedir. Canlı hücrelerin yeşil renginden anlaşıldığı üzere, hücreler yüksek canlılıklarını korumuştur.

Endotel hücreler konfluent hale geldiğinde, ölü hücreler kırmızı renkte olacaktır. Modüllerin yüzeyinde, immünofloresan ile görülebilen sıkı bağlantıların (tight junctions) oluşumu gerçekleşir. VE cadherin kütle transfer analizi boyaması, modüllerin, daha büyük dokularda sıklıkla sorun teşkil eden yetersiz oksijen transportuna bağlı nekrotik çekirdek gelişimi olmadan yüksek hücre yoğunluklarını destekleyebildiğini göstermiştir.

Bu örnekte, tipik küçük modüllerin massen Tri chro boyaması, modüllerin üretimden yedi gün sonra canlı hücrelerin homojen ve yüksek bir dağılımını koruduğunu göstermektedir. Buna karşılık, büyük modüllerin çekirdek kısmında çok sayıda ölü hücre oluşmuş ve geriye yalnızca ince bir canlı hücre halkası kalmıştır. Modüller ayrıca kolajen ve ince polimer karışımıyla veya ilaç salınımlı mikroküreler içerecek şekilde de üretilmiştir.

Burada, h hm EC hücreleri palin kolajen modüller üzerine yerleştirildiğinde, modüller silindirik şekillerini korumakta ve sadece kolajenden oluşan modüllere kıyasla hücre tutunma özellikleri sınırlı kalmaktadır. PLGA tabanlı biyobozunur mikroküreler içeren bir kolajen modülün ışık mikroskobu görüntüsü burada gösterilmektedir. Çeşitli in vitro analizlerin modüllerle uyumlu olduğu gösterilmiştir.

Örneğin, bir anjiyogenez deneyinde, endotel hücreleri ile yerleştirilmiş bir modül üzerindeki kılcal damar benzeri oluşumlar, adipoz kaynaklı kök hücrelerle beş günlük inkübasyonun ardından kolayca tespit edilebilir ve nicelendirilebilir. Başka bir örnekte, modüller üzerindeki canlı-ölü analizin konfokal mikroskopi görüntüleri, yeşile boyanmış canlı hücreleri ve kırmızıya boyanmış ölü hücreleri göstermektedir. Son olarak modüller, farklı hücre tipleri arasındaki etkileşimi ve mikro dokuların konak yanıtı tarafından nasıl yeniden şekillendirildiğini incelemek amacıyla mikroakışkan odacıklarda kullanılmış ve fareler ile sıçanlara implante edilmiştir.

Prosedürün ardından modüller, bir Petri kabında veya biyoreaktör ya da mikroakışkan cihaz gibi diğer kaplarda kültüre edilebilir. Bu yöntem, farklı hücre tipi kombinasyonları kullanılarak veya farklı çaplarda tüpler kullanılarak farklı dokular oluşturmak için de uyarlanabilir. İzlediğiniz için teşekkürler.