Deneysel Otoimmün hipofizitis İndüksiyon Fare Hipofiz İmmunogen hazırlanması

Otoimmün hipofizit, hipofiz bezinin büyümesi ve bir veya daha fazla hipofiz hormonunda eksiklik ile karakterizedir. Neden olan otoantijenler bilinmemektedir. Burada, bu hastalığın incelenmesinde kullanılmak üzere fare hipofiz bezi proteinlerinin hazırlanmasına yönelik bir protokol gösterilmektedir.

Öncelikle, ötanize edilen farelerden hipofiz bezleri izole edilir. Ardından, hücreleri mekanik olarak parçalamak vele sitozolik proteinleri serbest bırakmak için hipofiz bezleri homojenize edilir. Homojenat, düşük hızlı santrifüjleme ile saflaştırılır; miktarı kolorimetrik BCA testiyle, kalitesi ise poliakrilamid jel elektroforezi ile değerlendirilir.

Son olarak, sulu protein homojenatı yağlı bir adjuvan ile karıştırılır. Bu karışım, ardından otoimmün hipofizitis'i andıran bir fare modeli oluşturmak için farelere enjekte edilir. Eşlik eden videoda gösterildiği üzere, deneysel hayvanlarda hipofizitis indüklemek için dört teknik tanımlanmıştır.

Bu makalede sunulan, hipofiz proteinleri karışımı influenza adjuvanının enjekte edilmesi tekniği, 1960'lara kadar uzanan en eski yöntemdir. Diğer yaklaşımlar arasında 1992'de rubella virüsünden çözünür glikoproteinlerin enjekte edilmesi, 2002'de bir adenovirüsün doğrudan hipofiz bezine stereotaktik enjeksiyonu ve 2010'da bir sıçan soyundan alınan hipofiz bezinin başka bir sıçan soyunun böbrek kapsülü altına transplantasyonu yer almaktadır. Florence adjuvan yaklaşımının temel avantajı, günümüzde daha az invaziv olması, daha tutarlı olması ve her şeyden önce, insan muadilini yakından taklit eden bir hastalığı indüklemede daha doğru olmasıdır.

1960'lardan beri bildirilmesine rağmen, yabancı adjuvan tekniği hipofizit indüksiyonunda yetersiz kalmıştır. Doktora çalışmalarıma başladığımda, yayınlanmış yabancı adjuvan protokolünü kullanarak yalnızca sınırlı düzeyde hipofizit vakası ve şiddeti elde edebilmiştim. EM emülsiyonunda bulunan pitu protein miktarını on kat artırma fikriyle durum önemli ölçüde iyileşti.

Bu yöntemler otoimmün hipofizitin patogenezine dair bilgiler sağlayabilse de, otoantijenleri henüz belirlenmemiş diğer otoimmün hastalıkların incelenmesinde de kullanılabilir. Genellikle, bu yöntemleri ilk kez uygulayan kişiler, manuel beceri, zaman ve özen gerektirdiği için temel olarak son adım olan marjin hazırlama aşamasında zorluk yaşayacaklardır. Bu nedenle, uygun bir emülsiyonun nasıl hazırlanması gerektiğini anlamak için görsel gösterim kritik öneme sahiptir.

Bu tekniğin etkileri otoimmünite alanının ötesine uzanmaktadır. İmmünizasyon için antijenin nasıl hazırlanacağını bilmek, aynı zamanda monoklonal antikor üretimi veya yeni aşıların test edilmesi için de kullanılabilir. Bu teknik, laboratuvarımdan S Zoo heroic Ura ve Mayland al gato tarafından gösterilecektir.

Fare hipofizi, kafatasının tabanında, sfenoid kemiğin sella turcica adı verilen çöküntüsünde yer alan silindirik şeklinde bir bezdir. Bez, lateralde trigeminal sinirler ve anteriörde optik sinir kiyazması ile sınırlandırılmıştır. Daha büyük olan anteriör lob ile daha küçük olan intermediyer ve posteriör loblardan oluşur.

Hipofiz bezini izole etmek için, ötanazi uygulanmış farenin başını makasla kesin, ardından kafatasının arkasından önüne doğru paralel kesikler atın. Beyni kaldırın ve hipofiz bezini açığa çıkarmak için geriye doğru çevirin; bez, bir ikizkenar üçgen bağlamında silindirik bir görünüm sergiler. Burada hipofiz bezi tabanı, trigeminal sinirler kenarları ve optik kiazma ise tepe noktasını oluşturur.

Çevredeki meningayı yırtmak için kapalı pens uçlarıyla bezin etrafını daire şeklinde çevreleyin. Ardından ince uçlu pens kullanarak, pitüiter bezi sella turcica'dan kavrayın ve kuru buz üzerindeki plastik bir tüpe yerleştirin. Tek bir preparasyon için 300 fare pitüiter bezi toplayın.

Bu toplama işlemi yaklaşık dokuz adam-saat gerektirir. Toplama tamamlandıktan sonra, hipofiz bezlerini ihtiyaç duyulana kadar -80 °C'de saklayın. 15 ml'lik bir Falcon tüpünü buz banyosuna yerleştirin.

Tüpe 250 µL homogenizasyon tamponu ekleyin. Homojenizasyondan hemen önce toplanan her 100 hipofiz için, fare hipofiz bezlerini tampona ekleyin. Ardından, polytron homogenizörün beş milimetre çaplı jeneratör ucunu, fare hipofizleri ve tampon içeren Falcon tüpünün altına yerleştirin ve maksimum hızda 30 saniye boyunca homogenize edin.

Tüpü buz üzerinde tutarken nazikçe yukarı aşağı hareket ettirin. Ardından homojenatı bir dakika boyunca buz üzerinde bekletin. Homojenizasyon ve soğutma adımlarını iki kez daha tekrarlayın.

Bu hafif homojenizasyon işlemi, çekirdekleri parçalamadan hücreleri parçalamalı ve proteinleri serbest bırakmalıdır. Çekirdekleri, parçalanmamış dokuları ve bağ dokusu ile denatüre protein kompleksleri gibi çözünmeyen maddeleri çöktürmek için homojenatı 4 °C'de, yaklaşık 1000 G düşük hızda 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Bu sırada peletin bozulmamasına dikkat edin.

Şu an post nükleer süpernatant veya PNS olarak adlandırılan SNA'yı yeni bir Falcon tüpüne aktarın ve saklayın. Buz üzerindeki PNS'deki peleti, daha önce kullanılanla aynı hacimdeki homojenizasyon tamponu ile geri çözün; daha önce olduğu gibi homojenize edin ve santrifüjleyin. İki PNS örneğini birleştirdikten sonra, çözeltiyi çok sayıda mikro santrifüj tüpüne paylaştırın.

Mikrosantrifüj tüplerini ihtiyaç duyulana kadar -80 °C'de saklayın. Bu protein preparatı -80 °C'de stabildir, ancak etkinliğini kademeli olarak kaybeder. Bu nedenle, preparatın hazırlandığı tarihten itibaren altı ay içinde kullanılması önerilir.

Protein verimini ve konsantrasyonunu biyik asit analizi ile belirlemek için PNS'den küçük bir alikot ayırın. Ardından, ortalama toplam ağırlıkları yaklaşık 570 miligram olan 300 fare hipofiz bezinden elde edilen protein kalitesini jel elektroforezi ile belirleyin. 60 miligram hipofiz proteini verimi veya her 10 miligram doku için bir miligram protein elde edilmesi beklenir.

Protein konsantrasyonu tipik olarak mililitre başına 40 miligram civarındadır. Burada verilen örnek 10 fareyi immunize etmek içindir. Her bir fareye bir miligram hipofiz proteini içeren 100 mikrolitre emülsiyon enjekte edilmesi planlandığından ve hazırlama sırasındaki materyal kayıpları için iki ek fare payı bırakıldığından, burada 12 miligram protein emülsiyonu hazırlanmaktadır.

Dondurulmuş protein alikotlarını ellerinizde ısıtarak hızlıca çözerek başlayın. Protein konsantrasyonunu PBS ile 20 mg/mL seviyesine ayarlayın. Ardından, 12 mg'a karşılık gelen 600 µL hipofiz protein ekstraktını 2,5 mL'lik bir Gas Tite Hamilton şırıngasına çekin ve 5 mg/mL ısı ile öldürülmüş mycobacterium tuberculosis içeren tam FRONS adjuvanı veya CFA ile manuel olarak çalkalayarak yeniden süspande edin.

Ardından, CFA'dan 600 µL'yi başka bir 2,5 mL'lik Hamilton şırıngasına çekin. CFA ile doldurulmuş şırıngaya 22 gauge'lik bir mikro emülsiyon iğnesi takın ve sabitleyin. İğnenin CFA ile dolması için pistonu yavaşça itin.

Ardından, iğnenin diğer ucunu hipofiz protein özütü ile doldurulmuş diğer şırıngaya takın ve sabitleyin. Şırıngaların içinde hava kabarcığı kalmamasına dikkat edin. Yağ bileşeninin sulu hipofiz özütü ile sadece küçük bir miktar karışmasını sağlayacak şekilde, CFA şırıngasının pistonunu yavaşça ilerletin.

Ardından, hipofiz ekstraktı şırıngasının pistonunu CFA şırıngasının içine doğru itin. Tüm içerik karışana kadar, karıştırılan materyal miktarını kademeli olarak artırarak bu işlemi tekrarlayın. Bu beyazımsı ve homojen dağılmış materyal, su ve yağ emülsiyonunu temsil eder.

Emülsiyon oluştuktan sonra, ileri-geri döngüsünü en az 500 kez tekrarlayın; son döngüden sonra şırıngalar, hipofiz protein konsantrasyonunun 10 mg/mL olduğu bire bir su ve yağ emülsiyonu içerecektir. Emülsiyon kullanıma hazırdır; emülsiyon kalitesini test etmek için bir damlasını bir beher suyunun içine damlatın. Emülsiyon doğru şekilde hazırlanmışsa, damla yüzeyde kompakt ve sıkı kalacaktır.

Emülsiyonun kalitesi düşükse, yayılacak ve daha küçük damlacıklara ayrılacaktır. Deneysel otoimmün hipofizit indüklemek amacıyla, emülsiyon hazırlandığı gün SJL farelerine enjekte edilir. Bu protokol, beraberindeki jo of vertical'da detaylandırılmıştır.

Pitüiter bez toplandıktan ve tekniklerde uzmanlaşıldıktan sonra, hızlı çalışmaya ve buz üzerinde işlem yapmaya dikkat ederek protein izolasyonu bir saat içinde gerçekleştirilebilir. Bu adım sırasında, yaklaşık bir saat süren daldırma hazırlığı yapılır. Gelişimin ardından, başlangıçtaki karıştırma aşamasında yavaş ve sabırla çalışmayı unutmayın.

Bu teknik, otoimmünite alanındaki araştırmacıların, otoreaktif lenfositlerin hedef organı tanıma ve oraya sızma mekanizmalarını keşfetmelerinin yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, fare hipofiz bezinden protein ekstraktının nasıl hazırlanacağı ve immunojen olarak kullanılmaya hazır bir emülsiyon hazırlamak için bunun Crohn's adjuvanı ile nasıl karıştırılacağı konusunda kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız. Şırıngalarla ve inaktive edilmiş kuru mikrobakteriyel tüberküloz içeren komplett adjuvanlarla çalışırken, yanlışlıkla kendinizi batırmanızın tehlikeli olabileceğini unutmayın.

Bu nedenle, bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman eldiven kullanın ve iğneleri uygun şekilde imha edin.