Hücre Kültürü sırasında Hücre Sayısını Belirleme Scepter Hücre Sayıcı

Scepter hücre sayıcı, hücreleri saymak, hücre çapını ve hacmini izlemek ve hücresel popülasyonların sağlığını ve kalitesini kontrol etmek için kullanılan el tipi otomatik bir cihazdır. Geliştirilmiş doğruluk, kullanım kolaylığı ve düşük hücre sayım maliyeti dahil olmak üzere diğer sayım yöntemlerine göre önemli avantajlar sunar. Scepter'ı kullanarak, hücreleri tek kullanımlık sensöre aspire etmek için grafik ekranındaki talimatları izleyin.

Ardından hücreler sayılır ve cihaz, bir bilgisayara yüklenip analiz edilebilen hücre konsantrasyonlarını ve istatistiklerini raporlar. Merhaba, ben Sonya. Millport'ta araştırma bilimcisiyim ve bugün size Scepter'ın nasıl kullanılacağını göstereceğim.

Hücre sayacı Hücre sayımı, in vitro hücre kültürü için gerekli ancak zahmetli bir adımdır. Tutarlı hücre konsantrasyonları, deneysel tekrarlanabilirliği ve doğruluğu sağlar. Hücre sayımları; hücre sağlığının ve proliferasyon hızının izlenmesi, ölümsüzleştirilmiş veya transforme edilmiş hücrelerin sonraki deneyler, transfeksiyon veya enfeksiyon için ekim miktarının belirlenmesi ve hız ile doğruluk gereksinimine rağmen hücre tabanlı assay'lerin hazırlanması açısından önemlidir.

Hücre sayımında, ankete katılan 400 araştırmacının %71'i hücreleri bir hemositometre kullanarak saymaktadır. Hemositometri düşük maliyetli olsa da zahmetlidir; kullanıcı yanlılığına ve hatalı kullanıma açıktır, bu da yanlış sayımlarla sonuçlanır. Hemositometrideki hata kaynakları arasında örnekteki düzensiz hücre dağılımı ile örnekteki hücre sayısının çok fazla veya çok az olması yer alır.

Belirli bir hücrenin tanımlanmış sayım alanı içinde kalıp kalmadığına dair sübjektif kararlar. Manuel sayımla ilişkili sıkıcılığı azaltmak için hemositometrenin kontaminasyonu, kullanıcılar arası varyasyon ve hemositometre dolum hızındaki varyasyon. Araştırmacıların %29'u hücreleri otomatik hücre sayım cihazları kullanarak saymaktadır.

Ancak çoğu araştırmacı için, bu büyük masaüstü cihazlarla ilişkili maliyetler, bunların kullanımının önünde bir engel teşkil etmektedir. Scepter hücre sayıcı, Coulter sayımının otomasyonunu ve doğruluğunu, kullanımı kolay el tipi bir formatta ve nispeten düşük bir maliyetle sunan otomatik, el tipi bir cihazdır. Sistem; algılama sinyal işleme, veri depolama ve grafik ekran için analog ve dijital donanım kombinasyonunu kullanan minyatür bir formatta, empedans tabanlı partikül tespitine dayalı Coulter prensibini uygulamaktadır.

Tek kullanımlık sensör, hassas sıvı taşıma kanalları ve elektroniklerle desteklenmiş, hücre boyutu ve hücre hacmine göre alt mikron ve alt pikolitre çözünürlükte ayrım yapılmasına olanak tanıyan mikro fabrikasyonlu bir hücre algılama bölgesiyle tasarlanmıştır. Scepter hücre sayıcı, hücre popülasyon istatistiklerini kullanım için bir histogram şeklinde grafiksel olarak görüntüler. Scepter hücre sayıcı işlemi, hücrelerin fosfat tamponlu salin içinde tek hücre süspansiyonunun seyreltilmesiyle başlar.

Mililitre başına 10.000 ila 500.000 hücrelik bir konsantrasyon optimaldir. Seyreltilmiş hücrelerden 100 µL'yi 1,5 mL'lik bir mikro tüpe aktarın. Cihazın arkasındaki düğmeye basılı tutarak Scepter hücre sayıcısını açın ve ekrandaki talimatların görünmesini bekleyin.

İstendiğinde, elektrot algılama paneli cihazın önüne bakacak şekilde bir sensörü scepter ünitesinin ucuna takın. Scepter sensörleri, elektronik bir algılama bölgesine ve entegre hücre algılama elektrotlarına sahip, hassas kalıplanmış bir örnekleme odasından oluşur. Sensörler, hücre boyutunun alt mikron çözünürlükte ve hücre hacminin alt pikolitre çözünürlükte ayırt edilmesini mümkün kılar.

Tutarlı sensör mühendisliği, eşit örnek hacimlerinin sayılmasını ve doğru boyut ölçümlerinin yapılmasını sağlar. Sensör takıldıktan sonra, sayım sürecinin her adımını ekrandaki talimatlara uygun olarak şu şekilde gerçekleştirin. Ekranda, pistonu basılı tutun yazısı göründüğünde pistonu bastırmaya başlayın; ardından ekranda sensörü daldırın yazısı belirecektir, bu aşamada sensörü hücre süspansiyon çözeltisine daldırın ve hücre süspansiyonunu sensör içine aspire etmek için pistonu serbest bırakın.

Piston bir elektrik sinyali görevi görür ve örneği ölü hacimle birlikte sensörün içine çeker. Pipetlemeden farklı olarak, pistonun indirilme hızı veya hassasiyeti önemli değildir. Hazır olduğunda bu işlem birkaç saniye sürecektir.

Cihaz bip sesi çıkaracak ve ekranda örnek yüklendi (sample loaded) yazısı görünecektir. Örnek sensöre yüklendiğinde, hücre boyutunu ve hücre hacmini değerlendirmek için algılama bölgesinden geçirilir. Ardından mikrokanallar aracılığıyla 50 µL örnek sayıldığında, sensör cihaza sayımı durdurması için sinyal gönderir.

Sayım tamamlandıktan sonra, cihaz ekranında count complete yazısı görünecektir. Lütfen sensörü çıkarın ve atın. Yönergeleri takip ederek sensörü çıkarın ve atın.

Cihaz daha sonra ekranında hücre boyutu veya çapının bir histogramını ve mililitre başına hücre konsantrasyonunu görüntüleyecektir. Sayım tamamlanıp histogram cihazda görüntülendikten sonra, geçiş düğmesine basarak kapıları (gates) uygulayın; histogram profiline göre kapıyı otomatik olarak ayarlamak için "auto gating"i veya önceki sayımın kapılarını kullanmak için "use last" seçeneğini belirleyin. Seçimden bağımsız olarak, kapılar hassas ayar yapmak için manuel olarak hareket ettirilebilir.

Verileri ayarlayın, sol kapıyı seçmek için geçiş düğmesine tekrar basın ve kapıyı istediğiniz şekilde hareket ettirmek için düğmeyi kaydırın. Ardından, sağ kapıyı etkinleştirmek için geçiş düğmesine tekrar basın ve sağ kapıyı yerleştirmek için düğmeyi kaydırın. Tekrar tıklayın.

Yeni bir hücre konsantrasyonu, ortalama hücre hacmi ve çapı görüntülenecektir. Tarih-saat, ortalama hücre boyutu ve ortalama hücre hacmi arasındaki görüntüleme geçişini yapmak için düğme her iki yöne de hareket ettirilebilir; cihazın kendisine kadar 72 histogram kaydedilebilir. Verileri bir kişisel bilgisayara yüklemek için cihazı USB kablo portu aracılığıyla bağlayın, bilgisayarın ekranında görüntüleyin.

Yazılımı başlatmak için scepter yazılım uygulamasına çift tıklayın. Ardından bağla (connect) seçeneğine tıklayın. Tüm sayımlar otomatik olarak yazılıma aktarılacaktır.

Scepter uygulama yazılımı, kültürün popülasyon dağılımını hacim veya çap cinsinden detaylandıran histogramı görüntüler. İndirilen dosyalar daha sonra Microsoft Excel'e aktarılabilir; burada ham veriler, belirlenen hücre çapı veya hücre hacmi aralıklarında (bin) görüntülenir. Sayım için 19 farklı hücre hattı hazırlanmış ve teorik başlangıç konsantrasyonları bir hücre sayacı kullanılarak belirlenmiştir.

Bu hücre süspansiyonları daha sonra teorik hücre konsantrasyonlarını elde etmek için daha fazla seyreltilmiştir. Hücre konsantrasyonlarını belirlemek için scepter hücre sayacı kullanılmıştır. Bu şekil, beş temsili hücre hattı için ölçülen beş seyreltmeyi ve bunlarla birlikte teorik hücre konsantrasyonunu göstermektedir.

R-kare değerlerinin gösterdiği yüksek doğrusallık derecesi, scepter sayımının test edilen hücre hatları için geniş bir doğrusal çalışma aralığında güvenilir bir yöntem olduğunu kanıtlamaktadır. Scepter sayımının genel bağıl doğruluğu, scepter sayımından elde edilen verilerin coter sayımından elde edilen sayılarla karşılaştırıldığı bu bölümde gösterilmiştir. Scepter hücre sayımlarının logaritması, coter sayımlarının logaritmasına karşı grafiğe dökülmüş olup, test edilen tüm hücre hatlarında scepter sayımlarının coter sayımlarıyla eşleştiğini göstermektedir.

19 hücre hattının sayımı bir Z two coulter sayıcı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Scepter hücre sayıcı, V cell veya count test sistemi gibi otomatik görüntü tabanlı bir sayıcı ve hemo TER sayımları, aynı başlangıç hücre süspansiyonu ve özdeş dilüsyonlar kullanılarak üretici talimatlarına göre yapılmıştır. Bu şekilde gösterilen sonuçlar, scepter sayımı ile ölçülen hücre konsantrasyonlarının yüksek lineerite ile teorik hücre konsantrasyonlarıyla yakından eşleştiğini kanıtlamaktadır.

Her bir hücre hattının her bir dilüsyonu için yüzde varyasyon katsayısı veya CV hesaplanmıştır. Burada gösterilen her bir sayım sistemi için, çalışma aralığındaki hücre konsantrasyonu ve sayım yöntemine göre 19 hücre hattı üzerinden ortalama yüzde CV değerleri verilmiştir. Scepter hücre sayıcısı, daha küçük standart sapmalar ve daha küçük ortalama varyasyon katsayıları sergileyerek hemo sitometre sayımından daha hassas sonuçlar vermektedir.

Scepter ile sayım, hemo sitometriden 10 kat daha hızlıdır ve diğer otomatik sayıcılardan da daha hızlıdır. Burada SF nine, MCF seven ve HC 2 93 hücreleri, bu videoda açıklanan yöntemler kullanılarak sayılmıştır. Hücre konsantrasyonunu ölçmek için gereken ortalama süre kaydedilmiştir.

Hemositometrinin her örnek için yalnızca bir kez gerçekleştirildiğine dikkat edin. Scepter, ölçümleri hücre boyutuna göre yapar. Bu nedenle, hücresel morfolojideki tüm değişiklikler histogramda yakalanabilir.

Sağlıklı kültürler güzel bir çan şekilli Gaussian dağılımı sergilerken, sağlıksız hücreler ise histogramın sola kaymasına neden olur. Benzer şekilde, %50 ölü hücre popülasyonu %50 canlı hücre ile karıştırıldığında da histogram kaymaları gözlemlenmiştir. Araştırmacıların hücre sayım yönteminde devrim yaratan Millipore'un yeni Scepter hücre sayıcısının nasıl kullanılacağını size göstermiş oldum.