Işıksal Çözülmüş İki foton Mikroskop kullanarak G Protein Coupled Reseptör Etkileşmeleri in vivo Niceleme

Aşağıdaki deneyin genel amacı, protein hakkında stokiyometrik ve yapısal bilgiler belirlemektir. Canlı biyolojik hücreler olan maya hücrelerini eksprese eden tüm ligand kompleksleri, ilgi duyulan proteinleri bir donör veya akseptör floresan proba bağlı olarak eksprese edecek şekilde genetik olarak mühendislenmiştir. Donör problar bir lazer tarafından doğrudan uyarılabilir.

Akseptörler yalnızca yakınlardaki uyarılmış bir donörden enerji transferi yoluyla uyarılabilirken, hücreler darbeli bir yakın kızılötesi lazerden gelen ışığa maruz bırakılır. Problardan gelen floresan ışınım, bir transmisyon ızgarası ile spektral bileşenlerine ayrılarak elektron çoğaltıcı bir CCD dizisi yüzeyine yansıtılır. Böylece, numunedeki her konum için tekil tüm bağların eksiksiz floresan spektrumları elde edilir.

Saptanan floresansın spektral profili, ilgilenilen proteinlerin spesifik etkileşimine bağlıdır. Veriler, bir tarama hücresinin her bir görüntü pikseli için donör ve akseptör problardan gelen ayrı emisyonları belirlemek üzere analiz edilir. Enerji transfer verimliliği her bir görüntü pikselinde belirlenir ve ardından pikseller, FRET verimliliklerine ve histograma göre renklendirilir.

Histogram yorumlaması, proteinin, kompleks boyutunun ve konfigürasyonunun in vivo olarak belirlenmesine olanak tanır. Merhaba, ben University of Wisconsin Milwaukee'deki Riku Araştırma Grubu'ndan Michael Stoneman. Benim adım Singh.

Wisconsin, Milwaukee'deki Rikus Laboratuvarı'ndanım. Bu tekniğin temel avantajı, bir hücre içindeki tüm ligament komplekslerinin yüzlercesinden gelen tam emisyon profillerinin, hücrenin tek bir tam taramasıyla elde edilmesidir. Genellikle çoğu floresan mikroskopi yöntemi, hücre içindeki çeşitli ilgi bölgelerinde FRET verimliliğini belirlemek için yeterli spektral bilgiyi toplamak amacıyla, incelenen hücrenin defalarca taranmasını gerektirir.

Bununla birlikte, difüzyon biyokimyasal reaksiyonları, bu ilgi bölgelerinin moleküler yapısını değiştirebilir ve böylece görüntünün taranmasıyla elde edilen bilgileri kısıtlayabilir. Bu yöntem; oligomerlerin zararlı boyutu nedir? Oligomerler protein yaşam döngüsünün hangi aşamasında oluşur ve bu proteinin oligomerinin hücresel işlevdeki rolü nedir? gibi, canlı hücrelerdeki protein ve protein etkileşimlerinin incelenmesindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Spektral olarak çözünürlüklü iki foton mikroskobu, eksitasyon ışınının odağını ilgilenilen numunenin üzerinde bir dizi konumda tarayarak, görüntü hücresindeki olima kompleksleri hakkında spektral bilgiler toplar. Lazer ışınının odağını numune üzerinde iki farklı yönde kaydırmak için bir çift dik tarama aynası kullanılır. Tarama aynalarının hareketi bilgisayar kontrollüdür ve CCD kameradan floresans yoğunluk verilerinin alınmasıyla senkronize edilmiştir; böylece çizgi taramalardan, ışığın belirli bir dalga boyuna karşılık gelen floresans yoğunluğu uzamsal haritaları yeniden oluşturulabilir.

X-ışını floresan yoğunluğu mekansal haritalarını doğru şekilde yeniden oluşturmak ve bu haritaların her birine karşılık gelen gerçek dalga boyunu hesaplamak için, çizgi tarama protokolü floresein çözeltisi kullanılarak kalibre edilmelidir. Kalibrasyon prosedürüne başlamak için, donör etiket GFP 22'nin maksimum eksitasyon dalga boyunun iki katı olan 800 nanometre dalga boyunda eksitasyon spektrumunu gönderin. Eksitasyon spektrumunu göndermek için, kameranın bağlı olduğu bilgisayar programını kullanarak lazer boşluğu içindeki prizmayı kaydırarak grup hız dağılımını değiştirin. CCD çipinin sıcaklığını ulaşabileceği en düşük seviyeye indirmek için CCD çipine bir komut gönderin.

Karanlık gürültüyü azaltmak için, fluorescein çözeltisinin 10 µL'sini bir mikroskop lamı üzerine pipetleyin ve bir lamel yerleştirerek numunenin ince bir tabakasının lamel ile mikroskop lamı arasındaki bölgeye homojen şekilde dağılmasını sağlayın; ardından lamel yüzeyine küçük bir damla imersiyon yağı damlatın. Şimdi mikroskop lamını XY, Z translasyon tablasına sabitleyin ve lam ile tablayı optik eksen yönünde hareket ettirin. Lineer aktüatörü manuel olarak ayarlayarak, mikroskop objektifi imersiyon yağı damlasıyla temas edene kadar lamı kaydırın; CCD dizisine çarpan ışığın bilgisayar ekranında gerçek zamanlı olarak görüntülenmesi için kamerayı video veri toplama moduna getirin.

CCD dizisinde tespit edilen arka plan gürültüsünü azaltmak için odadaki tüm ortam ışıklarını kapatın. Örneği lazer ışınının odak noktasına getirmek için optik eksen yönündeki taşıma tablasını kontrol eden mikrometriyi yavaşça ayarlayın. Fluorescein örneği odaklandığında, emisyon CCD dizisinde keskin bir çizgi şeklinde görünecektir.

CCD dizisinden elde edilen piksel yoğunluğu okumalarını bilgisayara indirin. İndirilen yoğunluk değerleri matrisini ImageJ'de açarak ve floresan bölgeden geçen bir çizgi çizerek, piksel yoğunluğunu CCD dizisindeki konumun bir fonksiyonu olarak ölçün. Image day komutunu kullanın.

Floresein örneğinin emisyon spektrumunu gösteren bir grafik oluşturmak için grafik profilini analiz edin. Lazerin hareketini kontrol eden aynanın artış parametresini ayarlayın. Y yönünde odaklama yaparak, örnek içindeki ardışık y konumlarının, floresan spektrumlarının zirvesinin CCD dizisindeki spektral boyut boyunca tam olarak bir piksel hareket etmesini sağlayın.

Bunu izlemek için, örnekteki iki farklı Y konumuna ait floresein spektra yoğunluğunu indirin. Ardından, yoğunluk görüntülerini ImageJ ile açın ve her bir floresan spektrumun için pik piksel konumunu bulun. CCD panjurunu açık bırakarak ImageJ imlecini kullanarak lazer odağını örneğin X yönünde tarayın.

Tarama hattı boyunca her bir vokselden yayılan ışık, her bir hat taramasının sonundaki CCD dizisinin üzerine düşmelidir; bu hat taraması için CCD dizisinden elde edilen verileri kaydedin ve ardından CCD dizisinin piksellerini temizleyin. Lazerin konumunu değiştirin. Daha önce belirlenen miktarda Y yönünde odaklama yapın.

Ardından, lazer ışınını numune boyunca X yönünde taratın. CCD panjurunu açık bırakarak verileri bir kez daha kaydedin. Tek bir biyolojik hücrenin boyutlarından yaklaşık %50 daha büyük bir fiziksel alan lazer ışığıyla aydınlatılana kadar bu hat tarama işlemini tekrarlayın.

Farklı dalga boylarında birden fazla eksitasyon floresan yoğunluk yüzey haritası elde etmek için, belirli bir hat tarama görüntüsünün satır numarası ile dalga boyu arasındaki ilişki, görüntüleri yeniden oluşturmak için kullanılmalıdır. Belirli bir dalga boyu için eksitasyon floresan emisyon görüntüsünü elde etmek için, ilk hat taramasından elde edilen görüntüde bu dalga boyuna karşılık gelen satır numarasını bulun. Ardından, sonraki hat tarama görüntüsünün bitişik satırı, floresan emisyon görüntüsünün bir sonraki satırına karşılık gelir.

Belirtilen dalga boyu için, bu dalga boyuna karşılık gelen tüm görüntü satırlarını üst üste ekleyerek numunenin o dalga boyundaki XY floresan yoğunluk uzay haritalarını elde edin. Numunelerinizle ilgili verileri toplamak için bu prosedürü elde edilebilen diğer tüm dalga boyları için tekrarlayın. İlk olarak, transforme edilmiş maya kolonilerinin bulunduğu plakaları inkübatörden çıkarın.

En az üç tip transform edilmiş hücre bulunmalıdır. Her iki tip floresan prob ile işaretlenmiş ilgilenilen proteinleri eksprese eden hücreler, sadece donör floresan problarla işaretlenmiş proteinleri eksprese eden hücreler ve sadece akseptör floresan problarla işaretlenmiş proteinleri eksprese eden hücreler.

Bir mikro santrifüj tüpüne 100 µL 100 mM potasyum klorür ekleyin. Ardından, bir mikropipet ucu kullanarak, hem donör hem de akseptör floresan problarla işaretlenmiş proteinler eksprese eden hücre plakalarından üç ila beş maya kolonisini sıyırın ve 100 mM potasyum klorür içerisine inoküle edin. Bu hücrelerle, hücre süspansiyonundan 10 µL alın ve taze bir mikroskop lamı üzerine damlatın.

Damlanın üzerine bir lamellesle kapatın ve lamellenin yüzeyine bir damla yağ damlatın. Ardından, lazer ışığının mikroskop objektifine ulaşmasını engellemek için lazer ışını yolundaki perdeyi manuel olarak kapatın. Mikroskop lamını XY, Z translasyon tablasına sabitleyin ve mikroskop objektifi imersiyon yağı damlasıyla temas edene kadar lam tablasını optik eksen yönünde kaydırın.

Şimdi geniş alan ışık aydınlatmasını açın ve kamera ayarlarına gidin. Veri toplama için video modunu seçin. Emisyon yolunda transmisyon ızgarasının bulunması nedeniyle, numunenin geniş alan görüntüsü oldukça bulanık olacaktır.

Bu nedenle, iletim ızgarasından önceki optik yola, dar tam genişlikte yarı maksimum değerine sahip bir bant geçiren filtre yerleştirin. Hücrelerin görüntüsü kamera ekranında izlenirken, hücreler odaklanana kadar taşıma tablasını optik eksen yönünde yavaşça hareket ettirin. Tek bir hücreyi lazer ışını odağına getirmek için tablayı X veya Y yönünde hareket ettirin.

Geniş alan aydınlatma kaynağını kapatın ve emisyon yolundaki bant geçiren filtreyi çıkarın. CCD dizisinde alınan sinyali aynı anda izlerken lazer ışınını kısa bir süreliğine açın. Lazer ışını hücreye çarptığı sırada CCD dizisinde bir floresan sinyali tespit edilirse, bu hücrenin tam floresan veri toplama taramasını gerçekleştirin.

Daha önce gösterilen kalibrasyon prosedüründe belirlenen tarama parametrelerinin, özellikle hat sayısının ve y ekseni artışının aynı şekilde kullanılması hayati önem taşır. Hem donör etiketlere hem de akseptör etiketlere bağlı proteinler eksprese eden çok sayıda hücre için hücre konumlandırma ve floresan veri toplama işlemini tekrarlayın. Her iki reseptörle etiketlenmiş proteinleri eksprese eden hücrelere ait yeterli floresan görüntü toplandıktan sonra, tüm süreci hem yalnızca donör floresan problarla etiketlenmiş proteinleri eksprese eden hücreler hem de yalnızca akseptör floresan problarla etiketlenmiş proteinleri eksprese eden hücreler için tekrarlayın.

Son olarak, daha önce açıklanan prosedürü kullanarak spektral olarak çözümlenmiş XY floresan yoğunluk uzaysal haritalarını elde etmek için tüm taramaları yeniden oluşturun. Bu üç şekilde gösterilenler, steril to alpha faktör reseptörü eksprese eden bir maya hücresi üzerinde gerçekleştirilen spektral olarak çözümlenmiş iki foton mikroskopi ölçümlerinden hesaplanan sonuç uzaysal haritalardır. Donör ve akseptör sinyallerinin iki boyutlu haritaları, hücrenin her bir konumundan elde edilen spektral emisyon profillerinin analiz edilmesiyle elde edilmiştir.

Floresans yoğunluklarına değerlerine göre yalancı renkler atanmış olup ölçek bir ek olarak gösterilmiştir. Ardından, KDA ve KAD görüntüleri kullanılarak görünür FRET verimliliklerinin iki boyutlu bir haritası hesaplanmıştır; az önce gösterilen hücrenin görünür FRET verimlilikleri haritasından çıkarılan değerler kullanılarak bir histogram grafiği hazırlanmıştır. Hücrenin ölçülen EAPP değerleri dairelerle temsil edilmektedir.

Kırmızı düz çizgi, düz yeşil çizgilerle temsil edilen bireysel kalsiyum fonksiyonlarının toplamu kullanılarak ölçülen verilere yapılan en iyi uyumu temsil etmektedir. Protokol metninde açıklanan histogram analizi, steril iki alfa faktör reseptörü tüm ligament kompleksinin in vivo ortamda RBA şeklinde bir tetramer formunu aldığını doğrulamaktadır. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde yürütüldüğü takdirde 12 saatte tamamlanabilir.

Bu deney yapılırken, uyarma kaynağının gücünün düşük tutulması önemlidir. Donörün tek bir darbe ile birden fazla kez uyarılmasından kaçınmak önemlidir.