Memeli MSS Optik Sinir transeksiyonu sonra Deneysel İşlemler Yöntemleri

Retinal ganglion hücreleri veya RG hücreleri, görsel bilgiyi retina üzerinden optik sinir aracılığıyla beyne ileten merkezi sinir sistemi nöronlarıdır. Eşlik eden videoda, yetişkin merkezi sinir sistemindeki apoptotik nöral hücre ölümünün bir modeli olarak, tüm RGC popülasyonunun aksonlarının eksodomize edilmesi veya kesilmesi için bir yöntem gösterilmiştir. Burada bu yöntem; nörotrofik faktörleri, kısa müdahale RNA'larını, plazmidleri veya anti ATO proteinlerini kodlayan viral vektörleri doğrudan hasarlı retinal ganglion hücrelerini veya retinayı küresel olarak hedeflemek amacıyla retinaya yönlendiren prosedürlerle birleştirilmiştir.

Retinal ganglion hücrelerini spesifik olarak hedeflemek amacıyla, gözün vitreus odasına maddeler enjekte etmek için bir intraoküler enjeksiyon düzeneği kurulur ve kullanılır. Optik sinire madde enjekte etmek için ya Gelfoam yerleştirilir ya da Hamilton şırıngaları kullanılır. Stump görüntüleme sonuçları, anti-apoptotik faktörlerin iletilmesiyle retinal ganglion hücresi sağkalımının artırılabileceğini göstermektedir.

Bu teknikler kullanılarak, merkezi sinir sistemindeki yetişkin nöron apoptozunda rol oynayan proteinler tanımlanabilir. Optik sinir transeksiyonu, yetişkin MSS'de nöronal apoptoz için tekrarlanabilir bir model olduğundan, bu tekniğin etkileri merkezi sinir sistemi hastalıklarının tedavisine veya teşhisine kadar uzanmaktadır. Genellikle, bu tekniğe yeni başlayanlar, cam pipeti gözün vitreus boşluğuna yerleştirirken lense zarar verdikleri için zorluk yaşarlar. İntraoküler enjeksiyonlar için şırınga sistemini hazırlamak amacıyla, herhangi bir iğneyi veya RN somununu çıkararak başlayın.

10 µL'lık bir RN gast sıkı 1701 Hamilton şırıngası hazırlayın. PFA ferrulini, sıkıştırma bağlantısının uç kap ferrulinine yerleştirin. Ardından, bağlantı düzeneğinin tamamını şırınganın ucuna takın ve RN somununu üstten gevşekçe vidalayın.

Bir adet 16'lık inçlik peak tüpünün bir ucunu, RN somunundaki açıklıktan geçerek sıkıştırma bağlantı parçasına yerleştirin. Peak tüpünün tam olarak oturduğundan emin olun. Peak tüpünü sızdırmaz hale getirmek için ferülü sıkıştıracak şekilde RN somununu sıkın.

Bu işlemi çift RN cam bağlayıcının her iki ucunda tekrarlayın. Peak borusunun boş ucunu, RN somun tutucuyu sıkarak çift RN cam bağlayıcının bir ucuna takın. Cam mikro pipet, enjeksiyon sistemi için iğneyi ve gövdeyi oluşturacaktır.

Cam pipeti, çiftli RN cam ara parçanın boş ucuna yerleştirin. Pipeti sabitlemek için RN somununu sıkın. Bir diseksiyon mikroskobu altında, çekilmiş bir mikro pipeti belirli bir açıyla tutarak ve ucu bir lamın buzlu cam yüzeyine sürterek kırılma oluşturup uygun çapta bir uç hazırlayın.

İdeal olarak, uç kısım hafifçe eğimli (pahlanmış) olmalıdır. Ardından, Hamilton Syringe Company'den temin edilen bir hazırlama kiti kullanılarak; şırınga, uç boru bağlayıcı, çiftli RN cam kuplör ve cam mikro pipet, kullanım için mineral yağ ile doldurulur. Hidrolik enjeksiyon sisteminde, iğne Hamilton 9 0 0 3 0 iğne ile değiştirilir.

Ardından, mineral yağı enjekte ederken sızdırmazlık sağlamak için Hamilton 9 0 0 3 0 iğnesinin üzerine kauçuk bir septum yerleştirin. Hazırlama şırıngasının Hamilton 9 0 0 3 0 iğnesini, enjeksiyon sistemindeki 10 µL Hamilton şırıngasının gövdesinin arka kısmına yerleştirin. Sızdırmazlık oluşturmak için septumu şırınganın ucuna sıkıca bastırın.

Pistonu yavaşça aşağı itin; mineral yağ, enjeksiyon sisteminin cam elemanlarından geçecektir. Böylece cam pipet dolacaktır. Hat boyunca oluşabilecek hava kabarcıklarını gidermek için yağın tamamını enjeksiyon sisteminden geçirin.

Dolum şırıngasındaki mineral yağı bitmek üzereyse, sürekli olarak yağ verirken iğneyi yavaşça geri çekin. Hava kabarcığı oluşumunu önlemek için hazırlama şırıngasını yeniden doldurun ve tekrar enjekte edin. Tüm sistem mineral yağı ile doldurulduğunda, 10 microliter şırıngasının orijinal pistonunu yerleştirin.

Sistemden fazla mineral yağı uzaklaştırmak için Hamilton şırıngasının pistonunu tamamen aşağı itin. Cam mikro pipeti ve şırınganın ucunu temizleyin. %70 etanol ile pistonu gövde üzerindeki 2 µL işaretine kadar geri çekin.

Cam mikro pipetin ucu hava ile dolacak ve böylece mineral yağ ile enjekte edilecek sıvı arasında bir tampon bölge oluşacaktır. Mikro pipetin ucunu istenen solüsyona yerleştirip Hamilton şırıngasının pistonunu geri çekerek pipet gövdesini doldurun. İntraoküler enjeksiyonu gerçekleştirmek için yetişkin bir sıçan gözüne 4-5 µL'den fazla solüsyon enjekte edilmemelidir.

Gaz akışını stereotaksik çerçeve için gaz maskesi aparatına yönlendirerek başlayın. Ardından, izofluran ile anestezi uygulanmış bir sıçanı stereotaksik cihaza yerleştirin. İzofluran konsantrasyonunu %2 seviyesine düşürün ve anesteziyi takip edin.

Hayvanı cerrahi bir battaniye ile örtün. Ameliyat boyunca vücut sıcaklığını korumak için göz kapaklarını açın ve bir damla lokal anestezik solüsyon damlatın. Kornea yüzeyine enjeksiyon işlemi, bir kişinin cam pipeti vitreus boşluğuna yerleştirip pipet pozisyonunu koruması gerektiğinden iki kişi tarafından gerçekleştirilmelidir.

Ve istenen çözeltiyi ileten şırınganın pistonuna basmak için bir tane daha. Cerrahi mikroskop altında, cam mikro pipeti ve çift RN cam kuplörü tutun, göz kapaklarını enjeksiyon bölgesinin karşısında V şekli oluşturacak şekilde açın. Parmaklarla göz, orbitadan dışarı kaldırılacaktır. Cam mikro pipetin ucunu, kan damarlarının olmadığı bir bölgeden ve sklera boyunca aşağı doğru bir açıyla nazikçe yerleştirin.

Pipet skleraya nüfuz ettiğinde, hafif bir patlama hissi duyulacaktır. Şırıngayı tutan kişi, pistonu şırıngadaki iki mikrolitre işaretine kadar bastırarak dört mikrolitre çözelti enjekte etmelidir. Enjeksiyon işlemi yaklaşık bir ila iki saniye sürmelidir.

Başarıyla enjekte edilen solüsyon vitreus odacığını yıkayacaktır; mikro pipeti yaklaşık beş saniye boyunca sabit tutun ve ardından iğnenin yerleştirildiği yönde geri çekin. Konjunktiva, küçük açıklığın üzerine tekrar kapanarak skleral punksiyona mühürleme yapılmasına yardımcı olacaktır. Cerrahi işlem tamamlandığında, izofloranı kapatın ve hayvanın birkaç dakika boyunca oksijen solumasını sağlayın. İyileşme sırasında korneanın kurumasını önlemek için kornea yüzeyini oftalmik göz pomadı ile kaplayın, ardından hayvanı stereotaksik cihazdan çıkarıp iyileşme kafesine geri yerleştirin.

Ekstomi sonrası retrograd taşıma yoluyla retinal ganglion hücrelerini manipüle etmek için öncelikle, eşlik eden optik sinir transection protokolü videosundaki talimatlara göre bir optik sinir transection işlemi gerçekleştiriniz, 2, 2 4, 1 izleyici ilaçlar. Optik sinir güdüğüne plazmitler, siRNA'lar veya viral vektörler uygulanabilir.

Bu prosedürü gerçekleştirmek için jel sünger kullanımı veya optik sinire doğrudan enjeksiyon olmak üzere iki ana yöntem bulunmaktadır. Jel sünger yöntemi kullanılıyorsa, taksonomiden bir hafta önce superior colliculus'a retrograd izleyiciler enjekte edilerek retinal ganglion hücrelerinin önceden işaretlendiğinden emin olun. Optik sinir kesildikten hemen sonra, deneysel solüsyona batırılmış küçük bir jel sünger parçası kesilen optik sinir güdüğünün üzerine yerleştirilir ve ardından orbital içerikler eski konumuna geri getirilir.

Göz nötr pozisyona getirildiğinde, jel köpük parçasının optik sinirin ucunun üzerinde kaldığından emin olarak, bir pens yardımıyla parçayı orbit içine itin. Enjeksiyon tekniği, plazmik akış yoluyla retrograd olarak taşınmak için aksonun sitoplazmasına erişmesi gereken maddelerin iletiminde daha etkilidir. Kesilmiş optik sinire istenen çözeltiyi enjekte etmek için sızdırmaz 10 µL Hamilton şırıngası kullanılır. Kısa eğimli bir iğne tercih edilir.

Enjekte edilecek solüsyondan 10 µL miktarını şırıngaya çekin. Genellikle enjekte edilen irna plazmidleri veya viral vektörler için, optik sinirin kenarını ince uçlu Dumont pensiyle kavrayın. İğnenin ucunu, sinire paralel olacak şekilde optik sinirin içine yerleştirin.

Bevel görünmez hale gelene kadar, yerleştirilen iğne her yönden sinir tarafından çevrelenecektir. İğne yerleştirildikten sonra, ince uçlu pensle sinirin yanlarını hafifçe sıkın ve şırıngayı döndürerek çözeltinin dörtte birini enjekte edin. Saat yönünde veya saat yönünün tersine dörtte bir tur döndürün.

İğnenin tam bir dönüşü tamamlanana ve şırınganın tüm içeriği enjekte edilene kadar bu adımları tekrarlamaya devam edin. Şırınganın ucunu sinirden çıkarın. Sinirden geri sızan herhangi bir enjekte sıvıyı orbit içerisinde bırakın; çünkü bu sıvı, akson uçları tarafından emilim için ek bir havuz oluşturacaktır.

Orbital içeriği orijinal konumuna geri getirin, yarayı kapatın ve hayvanın iyileşmesine izin verin. Hayvanlar cerrahi işlem sonrası ayrı ayrı barındırılmalıdır. Ameliyat sonrası analjezikler, hayvan bakım kılavuzlarınıza uygun olarak uygulanmalıdır.

Ameliyat sonrası yetkililer ve hayvanlar dikkatle izlenmelidir. Bu videoda gösterildiği gibi, kesilen optik sinir güdüğüne peptitler, ilaçlar, vektörler, plazmitler veya siRNA'lar iletilerek RGC'ler doğrudan hedeflenebilir. Bu temsili örnekte, fluoro gold retrograd etiketleme yapılmış ve SI three etiketli peptitler optik sinire hemen enjekte edilmiştir.

Fiksasyon sırasında peptitlerin dokudan sızmasını önlemek amacıyla retinada canlı görüntüleme gerçekleştirilmiştir; burada görülebileceği üzere, optik sinire enjekte edilen SI three işaretli peptitler, retinadaki RGC somalarıyla retrograd olarak büyük ölçüde taşınmıştır. Bu örnekte, optik sinir güdüğüne SI three işaretli siRNA'lar enjekte edilmiştir. Taksonomi ve retinada canlı görüntülemenin hemen ardından, optik sinire enjekte edilen SI three işaretli siRNA'ların, kolokalizasyonlarının gösterdiği üzere RGC'ler tarafından retrograd olarak taşındığı görülmüştür.

Fluorgold retrograd etiketleme ile, bu teknik bir kez kavrandıktan sonra düzgün uygulandığında saniyeler içinde gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü uygularken, lensin zarar görmesini önlemek için dikkatli olmak önemlidir. Viral partiküllerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceği unutulmamalı ve bu prosedür gerçekleştirilirken biyotehlikelerle çalışma konusundaki kurumsal kılavuzlara her zaman uyulmalıdır.