Sinapslar miktarının: Synapse Numarası ölçmek için bir İmmünositokimya tabanlı Testi

Nörobilimdeki en önemli hedeflerden biri, sinaps oluşumunun erken aşamalarını yönlendiren moleküler ipuçlarını anlamaktır. Bu nedenle, sinaptik bağlantıdaki değişiklikleri nicel olarak belirlemek için objektif yaklaşımlar geliştirmek zorunlu hale gelmiştir. Çeşitli deneysel preparatlarda sinaps sayısını belirlemek amacıyla, nöronlar arasındaki sinaptik temas noktalarını işaretlemek için kültür nöronları veya kriyoseksiyon beyin dokusu preparatları, seçici pre ve postsinaptik markerlar ile boyanır.

Hücreler veya dokular daha sonra floresan mikroskobunda görüntülenir ve iki immünohistokimyasal belirtece karşılık gelen kanalların her biri için sekiz bitlik görüntüler alınır. Görüntüler, puncta analyzer eklentisi ile Image J 1.29 kullanılarak analiz edilir. Presinaptik ve postsinaptik belirteçler arasındaki kolokalizasyon düzeyini belirlemek için, kolokalizasyon noktaları preparatta bulunan sinaps sayısını belirlemek amacıyla kullanılabilir.

Burada açıklanan tekniğin elektron mikroskopisi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, sinaps analizinin çok daha yüksek verimlilikte bir analiz ve sinaps sayısı kantifikasyonuna olanak tanımasıdır. Bu tekniğin temel etkileri; anormalliklerin ve sinaptik bağlantısallığın altta yatan patolojinin temeli olduğu düşünülen Alzheimer hastalığı, epilepsi veya otizm gibi klinik bozuklukların teşhis ve tedavisine yöneliktir. Bu teknik, etkilenen nöronların birbirleriyle sinaps kurma yeteneğinde gördüğümüz eksiklikleri azaltabilecek veya iyileştirebilecek müdahale biçimlerini belirlemek için kullanılabilir.

Bu yöntem beyin gelişimini incelemek için faydalı olsa da, her bir temas bölgesinin karşıt yüzeylerini seçici olarak etiketleme imkanınızın olduğu, hücreden hücreye temas sayısını incelemek veya nicelendirmek istediğiniz diğer model organizmalara veya organ sistemlerine de uygulanabilir. P5-P7 hayvanlardan alınan ve sıçan retinasından saflaştırılmış sıçan retinal ganglion hücrelerini, polilizine kaplı lamlar üzerine ekerek nöronal kültürler hazırlayın. 24 kuyucuklu bir plaka içerisinde, hücrelerin transfeksiyondan önce 37 °C'de üç ila beş gün boyunca büyümesine izin verilir.

Transfeksiyonun ardından, ekili hücreler yeterince olgunlaştığında sinapsların gelişebilmesi için hücreleri yedi ila sekiz gün daha inkübe edin. Kültür ortamını kuyucuklardan uzaklaştırın ve her kuyucuğa 500 µL önceden ısıtılmış %4 paraformaldehit ekleyerek yedi dakika boyunca fiksasyon yapın. Fiksasyonun ardından, hücreleri oda sıcaklığında fosfat tamponlu salin ile üç kez yıkayın.

Hücrelerin kuyucuklar içerisinde asla kurumasına izin verilmemesi önemlidir. Bir kuyucuktan tampon çözelti uzaklaştırıldıktan sonra, derhal bir sonraki tampon çözelti ile değiştirilmelidir. %50 normal keçi serumu ve %0.2 Triton X 100 içeren bloklama tamponu hazırlayın.

Her bir kuyucuktaki PBS'yi uzaklaştırdıktan sonra, her kuyucuğa 200 µL bloklama tamponu ekleyin ve 30 dakika boyunca bloklayın. Oda sıcaklığında, bloklama tamponunu uzaklaştırın ve üç kez durulayın. Seçilen pre ve post sinaptik antikor çiftini içeren %90 antikor tamponu ve %10 NGS çözeltisi ile PBS kullanarak bir primer antikor dilüsyonu hazırlayın.

Burada, bir presinaptik marker olan tavşan anti-sinapsin ve bir postsinaptik marker olan fare anti-homer kullanılır. Çökmüş antikorları uzaklaştırmak için primer antikor dilüsyonunu masaüstü santrifüjle maksimum hızda beş dakika santrifüjleyin, ardından her bir kuyuya 200 µL primer antikor solüsyonu ekleyin. Primer solüsyonun kurumasını önlemek için plakayı nemlendirilmiş bir kaba yerleştirin.

Primer antikorla inkübasyonu takiben, dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. Her kuyucuğu üç kez durulayın. %10 NGS içeren hazırlanmış antikor tamponunda 1:1000 oranında seyreltilmiş uygun sekonder antikorların 200 mikrolitresini PBS ile ekleyin.

Daha önce olduğu gibi, ikincil antikorlarla inkübasyonun ardından tabağı nemlendirilmiş hazneye yerleştirin ve oda sıcaklığında, karanlıkta iki saat boyunca inkübe edin. Her kuyucuğu PBS ile üç ila dört kez durulayın. Bir lam üzerine DPI içeren vector shield montaj ortamından bir damla damlatın.

Ardından, hücrelerin bulunduğu lamineyi damlanın üzerine ters çevirerek yerleştirin. Son olarak, lamine kenarlarına şeffaf oje uygulayın. Uygulama sırasında lamineyi itmemeye veya hareket ettirmemeye dikkat edin.

Bu işlem hücreleri paylaşacağı için, lamların kuru ve karanlık bir yerde en az 30 dakika boyunca kurumasına izin verin. Burada görüntüleme, uygun filtre setleri ve 63 kat yağ daldırmalı objektif ile donatılmış bir zes axio imager floresan mikroskobu kullanılarak gerçekleştirilir. Transfekte edilmemiş hücreler içeren bir lamı mikroskop tablasına yerleştirin.

Hücre çekirdeklerini görüntülemek için DPI filtresini kullanarak, en yakın komşularından en az iki hücre çapı kadar uzakta olan hücreleri seçin. Bu adımda DPI kullanımı, yanlılığı önlemeye yardımcı olacak ve hücre seçiminin rastgeleliğini sağlayacaktır. Seçilen her bir hücre için, uygun filtre setlerini (bu durumda GFP ve Texas Red) kullanarak sekiz bitlik görüntüler elde edin.

Üst üste bindirilmiş yalancı renkli görüntü, sırasıyla presinaptik ve postsinaptik belirteçleri kırmızı ve yeşil renklerde göstermelidir. Ardından, transfekte edilmiş hücreler içeren bir lamı mikroskop tablasına yerleştirin. Burada hücreler, bir TD tomato ekspresyon vektörü ile transfekte edilmiştir.

Hücreleri seçmek için daha önce olduğu gibi bu işaretleyiciyi kullanın. Seçilen her hücre için, bu durumda GFP, Texas Red ve Sci five uygun filtre setlerini kullanarak sekiz adet pit görüntüsü elde edin. Üst üste bindirilmiş psödorenkli görüntüde, post-sinaptik markerlar kırmızı, yeşil ve mavi renklerde olmalıdır.

Burada, kolokalize sinaptik punktaların kantifikasyonu için puncta analizör programı kullanılmıştır. Puncta analizör eklentisi Barry Walk tarafından yazılmış olup Image J 1.26 versiyonunda talep üzerine temin edilebilir. Toplanan görüntülerden birini açın.

İlgilenilen SOR'un etrafında radyal olarak yaklaşık bir hücre çapı kadar bir bölgeyi seçmek için dairesel seçim aracını kullanın. İlgi bölgesi seçiliyken eklentiler menüsüne gidin ve ortaya çıkan analiz seçenekleri penceresinden puncture analyzer'ı seçin. Kırmızı Kanal Yeşil Kanal'ı seçin. İlk olarak arka planı çıkarın ve sonuçlar dosyasını ayarlayın.

Tamam'a tıklayın. Ardından sonuçların kaydedileceği bir konum belirleyin. Bu sonuçlar, açılan pencerede daha detaylı analizler için Excel'e aktarılabilir.

Ardından, 50'lik bir yuvarlanan top yarıçapının (rolling ball radius) seçili olduğundan emin olun ve beyaz arka plan seçeneğindeki işareti kaldırın. Bu değişiklik zorunlu değildir ancak uygulama kullanıcıları tarafından genellikle tercih edilir. Görselleştirme kolaylığı için tamam'a tıklayın.

Kırmızı kanal görüntüsüne karşılık gelen bir maske ile birlikte yeni bir pencere görünecektir. Eşiği, kırmızı maske mümkün olduğunca çok sayıda ayrı delik ile eşleşene kadar ayarlayın. Çok fazla gürültü oluşturmadan "done" (tamam) seçeneğine tıklayın.

Minimum noktalama işareti boyutunu dört piksel olarak ayarlayın. Başka hiçbir şeyi değiştirmeyin. Tamam'a tıklayın.

Önceki adımı bu kez yeşil kanal için tekrarlayın. Bu işlemi yeşil kanal ile tekrarladıktan sonra, eklenti her bir kanaldaki punctalar için ayrı ayrı nicelleştirme ve iki kanal arasındaki kolokalize punctaları sağlayacaktır. Burada gösterilen sinaps analizi, beyinden alınan kriyoseksiyonlara ve omurilik veya retina gibi diğer tüm sinir sistemi dokularına uygulanabilir.

Uygun bir pre ve post-sinaptik marker çiftinin mevcut olması koşuluyla; kan kaybı yoluyla ötanize edilmiş ve PBS ile perfüzyonu yapılmış bir fareden beyin dokusu hasat ederek başlayın. Tüm beyni, ertesi güne kadar dört derece santigrat sıcaklıkta, PBS içinde %4 paraldehit çözeltisine yerleştirin.

Beyni PBS ile üç kez yıkayın. Beyni PBS içindeki %30 sukroz çözeltisine yerleştirerek kriyoprotektif işlem uygulayın.

Doku, başlangıçta dört derece santigrat sıcaklıkta tutulacak ve doku dibe çökene kadar bekletilecektir. Bu aşamada kriyoproteksiyon tamamlanmış olur. Ardından, %20 sükroz ile OCT ve PBS'den oluşan ikiye bir oranındaki solüsyonda, beyni kesit alma için istenen oryantasyonda gömün.

Örneğin, sagital veya koronal. Ardından, kuru buz dolu bir kovanın üzerine düz metal bir yüzey yerleştirin. Gömülü beyni dondurmak için bunun üzerine koyun; donduktan sonra beyni bir dondurucu torbasına aktarın ve kesit alma işleminden önce bir yıla kadar -80 °C'de saklayın.

Bir kriyostat kullanarak dokuyu 12 ila 16 mikronluk kesitler halinde kesin ve cam lamlar üzerine monte edin. Ardından, lamları 37 degrees Celsius derecelik bir fırına yerleştirerek kurutun. Daha sonra, kalıntı OCT'yi uzaklaştırmak için lamları üç kez PBS ile durulayın.

Slayt etrafında hidrofobik bir bariyer oluşturmak için parafin kalem kullanılır ve bloklama tamponu, parafin kenar sayesinde slayttan dışarı akması engellenerek eklenir. Bir sonraki aşamada bloklama yapmak için slaytları oda sıcaklığında bir saat boyunca PBS içindeki %20 normal keçi serumunda bekletin. Ardından kesitleri %0,3 triton ve %10 normal keçi serumu içeren PBS ile seyreltilmiş primer antikorların içine yerleştirin.

Burada, glutamaterjik post-sinaptik kompartmanları işaretlemek için tavşan anti-PSD 95 ve glutamaterjik pre-sinaptik terminalleri işaretlemek için guinea domuzu anti-vGluT2 kullanılmıştır. Lamları 4 °C'ye yerleştirin ve 36 ila 60 saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, lamları üç kez 15'er dakika boyunca PBS içine daldırarak primer antikoru yıkayın.

Bu adımdan sonra, lamları doğrudan ışıktan koruduğunuzdan emin olun. %0,3 triton ve %10 normal keçi serumu içeren PBS içerisinde 1:200 oranında seyreltilmiş sekonder antikorları uygulayın. Burada, keçi anti Guinea pig kullanılmaktadır.

Alexa 488 ve keçi anti-tavşan Alexa 594 kullanılır. Oda sıcaklığında, karanlıkta iki saat boyunca inkübe edin.

Lamları, monte etmek için her biri 15 dakika sürecek şekilde dört kez PBS içine daldırarak yıkayın. Dappy ile küçük damlalar halinde vector shield montaj ortamı ekleyin ve lamları kapatma lamları ile kapatın. Kapatma lamlarının hareketini engellemek için oje uygulayın.

Doku kesitlerinin görüntülemesi, uygun lazerlere sahip konfokal mikroskop kullanılarak, her kesit görüntüsü için 63 kat yağ daldırma objektifi ile, toplam beş mikron derinlik boyunca 0,33 mikron aralıklarla toplam 15 optik kesit şeklinde gerçekleştirilmelidir. Her hayvandan en az üç kesitin görüntülenmesi ve belirli bir deneysel koşuldan en az üç hayvanın dahil edilmesi gerekir. Ardışık üç kesitten oluşan gruplardan, her biri bir mikron derinliği temsil eden beş projeksiyon oluşturacak şekilde maksimum yoğunluk projeksiyonları üretilmelidir.

Bunlar, astrositlerin yokluğunda oluşan sinaps sayısını belirlemek için modifiye edilmiş bir ROI kullanılarak, RG Cs için açıklandığı şekilde Image J ile nicelleştirilmiştir. İmmünokimya, bazal büyüme ortamı ile işlem görmüş disosiye rgc'ler üzerinde, beklendiği üzere kırmızı ile gösterilen bassoon ve yeşil ile gösterilen homer karşıtı antikorlar kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Astrositler tarafından salgılanan moleküllerin sinaps sayısı üzerindeki etkisini belirlemek için çok az sayıda sinaptik kolokalizasyon noktası gözlemlenmiştir; in vitro disosiye RG Cs, boyamayı takiben toplam 12 gün boyunca her üç günde bir fare astrosit kondisyonlu ortamı ile işlem görmüştür.

Bu nöronda çok sayıda sinaps belirgindi, ancak soon kırmızı ile gösterilmiştir. Homer yeşil ile gösterilmiştir; sitoplazmik Lee ile transfekte edilip TD tomato eksprese eden ayrıştırılmış RDC'ler sadece bazal büyüme ortamı ile uygulanmıştır. Sinapslar görülmemektedir.

TD domates mavi, sinaps ise kırmızı renkte görülmektedir. Yeşil renkte gösterilen post-sinaptik marker homer için çok az sinyal görülmektedir. Aynı hücreler kronik olarak sıçan astrosit kondisyonlu ortamı ile tedavi edildiğinde, birçok sinaps görülmektedir.

Burada TD tomato mavi, synapsin kırmızı ve homer yeşil renktedir. Astrosit kondisyonlu ortam ile işlem görmüş, presinaptik kırmızı ve post-sinaptik yeşil homer belirteçleri ile boyanmış saflaştırılmış bir RGC gösterilmektedir; puncture analyzer kullanılarak oluşturulan eşik maskeleri mevcut iki kanala karşılık gelmektedir. Kolokalizasyon noktaları belirlendiğinde, Puncta analyzer bu noktaların grafiksel bir temsilini sunar.

Puncta analizörü, her iki kanalda tanımlanan ayrı puncta sayısını ve kolokalizasyon noktalarını belirten sayısal bir çıktı sağlar. Bu nöronun analizinden elde edilen veriler, astrositler tarafından salgılanan moleküllerin sinaps oluşumunu teşvik etme yeteneğini göstermektedir; burada, önemli bir astrosit salgılayıcı sinaptojenik molekül olan thrombospondin için nöronal reseptörün aşırı ekspresyonunun, astrosit kaynaklı sinaps oluşumunu nasıl potansiyelize ettiğini göstermek amacıyla, pre- ve post-sinaptik immünohistokimyasal markalamaların kolokalizasyonunun quantifiye edildiği bir sinaps analizi sunulmuştur. Bu şekilde, kronik olarak bazal büyüme ortamı (GM) veya astrosit kondisyonlu ortam ile işlem görmüş nöron başına düşen ortalama sinaps sayısı gösterilmektedir.

A-C-M-A-C-M, trombospondin reseptörünü aşırı eksprese eden retinal ganglion hücrelerinde, boş vektörü aşırı eksprese eden hücrelere kıyasla sinaps oluşumunu daha güçlü bir şekilde teşvik eder. Fare süperior kollikulusundaki sinaptik yoğunluğu nicelleştirmek için, kompartmana özgü immünohistokimyasal belirteçler kullanılarak pre- ve post-sinaptik kompartmanlar ayrı ayrı işaretlenmiştir. Burada gösterildiği gibi, postnatal yedinci günden P 14'e kadar sinaps sayısında bir artış meydana gelmiştir.

Bu, söz konusu gelişimsel zaman aralığında superior colliculus'taki sinaps sayısındaki artışı göstermektedir. Uzmanlaşıldığında, bu protokol disosiye nöronal kültürler için yaklaşık iki günde, bu prosedürü takiben hayvandan alınan beyin kesitleri için ise yaklaşık beş günde tamamlanabilir. Sinaptik sayıdaki değişimlerin sırasıyla hem fonksiyonel sinapslardaki hem de ultrastrüktürel olarak normal sinapslardaki değişimleri yansıttığını doğrulamak için elektrofizyoloji ve elektron mikroskobu gibi diğer yöntemler kullanılır.

Bu videoyu izledikten sonra, sinaps sayısını belirlemek için deney hazırlığınıza immünohistokimyanın nasıl uygulanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu protokol, pre- ve post-sinaptik bölmeleri seçici olarak işaretlemek için bölmeye özgü antikorların nasıl kullanılacağını detaylandırmaktadır. Bu bağlamda sinapsları, bu belirteçlerin her birinden elde edilen sinyallerin kolokalizasyon noktaları olarak tanımlıyoruz.