Aerobik Mantarlar Kontrollü Bitki Doku Ayrışma Agar-Blok Microcosms

Bu prosedürün genel amacı, odun neminin ve ekzojen substratların sıkı bir şekilde kontrol edildiği bir Petri kabı mikrokozmosuna aerobik odun parçalayan bir mantar inoküle etmektir. Bu işlem, öncelikle bilinen besiyerlerinin kesin hacimleriyle mikrokozmoslar hazırlanarak gerçekleştirilir. Ardından, parçalanacak odun ve tüm ekzojen katı substratlar, substratlar arasında temas oluşmasına izin vermeden, agar yüzeyindeki plastik bir ızgaranın üzerine yerleştirilir.

Ardından mikrokozmos, test mantarı ile inoküle edilir ve inkübe edilir. İnkübasyonun ardından, kütle kaybını belirlemek ve analizler için dokuları hazırlamak amacıyla ahşap bloklar hasat edilir. Sonuç olarak, kütle kaybı ölçümleri, miselyal morfoloji gözlemleri velele ilele eşleşmiş plazma spektroskopisi gibi hedefli element analizleri aracılığıyla ahşap biyobozunma derecesini ve ekzojen element kaynaklarının rolünü gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Merhaba, ben Minnesota Üniversitesi Biyoproduktler ve Biyosistemler Mühendisliği Bölümü'nden Dr. Jonathan Schilling'in laboratuvarından Brooke Jacobson. Bugün size aerobik funguslar tarafından gerçekleştirilen bitki dokusu ayrışması için Petri kaplarının mikroortamlar olarak kullanılmasına yönelik bir prosedür göstereceğiz. Laboratuvarımızda fungal lignoselüloz ayrışma mekanizmalarını incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz.

Lignoselüloz; lignin, selüloz ve hemiselülozdan oluşan bitki dokusudur. En sık incelediğimiz doku olan odunla ilgili çalışmalarda, burgu bloğu tasarımının teknik olmayan yönlerindeki hatalar, en yaygın başarısızlık nedenleri ve çalışmalar arasındaki temel değişkenlik kaynaklarıdır; bu nedenle burgu bloğu kurulumumuzun video yayını faydalıdır. Deneyimlerimizden, bu prosedürün yüksek kaliteli ve düşük değişkenlikli sonuçlar verdiğini biliyoruz.

Hadi başlayalım. Bu deneyler için, mikrokosmos içerisindeki ahşap blok üzerindeki baş boşluğunu artırmak amacıyla, tipik Petri kaplarından bir santimetre daha derin olan Petri kapları kullanın.

Kalsiyum ve demir içermeyen ortam için her Petri kabına 20 mililitre düşecek şekilde yeterli miktarda besiyeri hazırlayarak mikrokozmos hazırlığına başlayın. Takviyelerle zenginleştirilmiş yaklaşık 400 mililitre deiyonize su içeren 500 mililitrelik bir balon jojeye 15 gram agar ekleyin. Karışıma mikrobesinleri eklemek için önceden hazırlanmış stok çözeltileri kullanın.

Besinler eklendikten sonra, balon jojeyi 500 mililitre çizgisine kadar doldurun. Ardından, besiyerini 1000 mililitrelik bir erlene aktarın. 121 °C ve 16 PSI'da 20 dakika boyunca otoklavlayın.

Test plakaları uygulanmadan önce agarın katılaşmasını önlemek için her flaskta 500 mililitre hacmin aşılmamasına dikkat edin. Otoklavlama işleminin ardından, yoğuşmayı en aza indirmek için besiyerinin dokunulduğunda soğumasını bekleyin. Nem içeriği veya mc nedeniyle, bu deneylerde nemin en aza indirilmesi kritik önem taşımaktadır.

%80'in üzerindeki oran dokularda anoksiye neden olacaktır. Aerobik mantarlar tarafından gerçekleştirilen ayrışmayı sınırlayın ve değişkenliği bir kez artırın. Soğutun. Aseptik olarak işlem yapmak için taşınabilir bir pipet yardımcısı ve 10 milliliter steril polistiren pipetler kullanın.

Agarı bir biyogüvenlik kabininde yüksek bir plaka yığınına aktarın. Ardından, plastik ağ ızgaraları plaka tabanlarına sığacak şekilde cömertçe kesin. Izgaraları kestikten ve sabunlu suyla iyice yıkadıktan sonra, bu gösterim için ağ ızgaraları kurutma ve otoklavlama aşamasına hazırlayın.

Önemli bir kereste kaynağını temsil ettiği için Güney sarı çamı (SYP) kullanılmıştır. ABD'deki konut yapılarında kullanılan işlem görmemiş kerestelerden, damar boyunca tek bir boyuna kesim yapılarak 19 x 19 milimetrelik budaksız bloklar kesin. Bu uzunluktaki parçaları 19 mm³ boyutunda küp bloklar halinde kesin.

19 mm³ boyutundaki blokları, testere yerine iskarpela ve çekiç kullanarak damar yönünde ikiye bölün. Bu işlem, agri blok mikrokozmindeki plastik ağın üzerine gelecek bir pürüzlü blok kenarı ve etiketleme için düz bir üst kenar oluşturur. Blokların düz kenarlarını kurşun kalemle etiketleyin; hem işlem gruplarını hem de kontaminasyon monitörleri ve fırında kurutulmuş materyaller için paralel olarak koşullandırılmış temel veri örnekleri olarak hizmet edecek inoküle edilmemiş kontrolleri karşılayacak kadar blok kesin, örnekleri alüminyum peynir altı suyu tepsilerine yerleştirin ve 100 °C'deki konveksiyonlu fırında 48 saat boyunca bekletin.

Numuneleri, soğumaları için fırından bir desikatöre aktarın. Başlangıç fırın kuru ağırlığını belirlemek için numuneleri önceden tartın. Son olarak, plastik ızgaralar ve ahşap dahil numuneleri, ıslanmayı en aza indirmek için folyo ile sıkıca sararak otoklav için hazırlayın.

Bu işlem, her bir örneğin ayrı ayrı paketlenmesini gerektirmez ancak buhar maruziyetinin düşük ve tutarlı olması gerekir. Etiketlenmiş örnekleri 121 °C ve 16 PSI'da bir saat boyunca otoklavlayın. Steril bir biyogüvenlik kabini içerisinde boş AE'leri, inokülum ağsı bitki substratı ekzojen materyalleri için bir kaynak plakayı, bir işaretleme kalemi, paraform şeritlerini, penseti ve transfer araçlarını hazırlayın.

İnokülasyonun bir sonraki adımı, kontaminasyon riskini en aza indirmek için materyalleri steril Petri kaplarına eklemektir. Transfer aletlerini ve forsepsleri kullandıkça %95 etanol ile sterilize edin. İlk olarak, plastik ağı Petri kabına yerleştirin.

Ardından ahşap substratı buraya ekleyin. Verilerin erken ve geç hasatlardan eşleştirilebilmesi için ağ boyunca iki adet ahşap blok eklenir. Bu bloklar, damarları fungal inokulum kaynağının olduğu noktaya bakacak şekilde yan yana eklenir.

Ardından, ekzojen materyalleri ekleyin. Burada, alçının ipliksi bir mantar tarafından gerçekleştirilen çürütme üzerindeki rolü test edilmektedir. Bu nedenle, mantarın ahşaba ulaşmadan önce bu alçı disklere rastlaması gerekir.

Ağın üzerine, her blok ve inokülasyon noktası arasına bir alçı disk yerleştirilir. Disklerin odun içinde birbirine temas etmemesine dikkat edilirken, birbirine yakın tutulmaları sağlanır. Mantar inokülumu için, 20 mililitre agarda büyütülmüş iki haftalık kültürlerden tıkaçlar hazırlamak amacıyla yedi milimetre çapında dört numara bir mantar pançı kullanılır.

Bu, inokülüm hacminin kontrol edilmesine yardımcı olur. İnoküle edilmemiş kontroller için, steril bir plakadan alınan bir tıkaç eklemek en iyisidir. İnokülüm ile eksojen substratlar veya odun arasında temas oluşmasına izin vermeyin, ancak bunları birbirine yakın yerleştirin.

Blok başına bir inokülasyon tıpası kullanın. Kapları, jiletle kesilmiş parafilm ile mühürleyin; plakaları yatay tutun ve parafilmi pürüzsüz ve sürekli bir hareketle sarın. Son olarak, alkole dayanıklı bir markör kullanarak, blok numaralarını ilgili substratların doğrudan üzerine yazarak kap kapaklarını etiketleyin.

Alçı disklerin üzerine daireler çizin. İçeriklerin sarsılmasını önlemek ve sıcaklık dalgalanmaları nedeniyle oluşabilecek yoğunlaşmayı en aza indirmek için plakaları dikkatlice biyolojik inkübatöre aktarın. Burada kullanılan koşullar 20 °C ve karanlıktır; son hasat hariç, zaman serisi hasatlarını aseptik olarak gerçekleştirin.

Beşinci hafta hasat noktasında, tüm işlem grubunu çıkarın. Her birinin alt ve üst yüzeyini %70 ethanol ile spreyleyin ve biyogüvenlik kabini içerisinde malzemeleri çıkarmak için yakılmış pens kullanın. Tarım plakalarını imha etmeden önce, özellikle morph F veya kavuna odaklanarak fotoğraflarını çekin.

Ardından işlem görecek blokları çıkarın. Fazla PHA'yı rulo ile uzaklaştırın, ancak çürümüş materyalin dökülmemesine dikkat edin. Blokları alüminyum tepsilerde kurutun ve aşırı sıvı çekimini izlemek için kontrollerin taze ve kuru ağırlıklarını kullanarak kütle kaybını belirleyin.

Kütle kaybı verileri, bozulma ilerlemesinin ölçülmesine yardımcı olur ve önemli verilerdir. Element konsantrasyonlarının gram ağırlık bazında hesaplanması gerekiyorsa, yüzde verileri normalize edilmelidir. İstatistikler için, belirgin şekilde suyla doygun olan koyu kahverengi blokları etiketleyin ve takip edin.

Son olarak kültürleri otoklavlanabilir poşetlerde imha edin; plastik destek ağını ve gelecekteki deneylerde kullanılmak üzere geri dönüştürülebilen diğer tüm bileşenleri saklayın. Agri blok mikrokozmos düzeneğinde, bloklar agri temasıyla aralarında mesafe bırakmak için plastik ağ üzerinde durur. Dairesel Crains, alçı yüzeylerle doğrudan temas halinde ve ahşap blokların içine doğru büyümüştür.

Bu miselyum, odun ile dışsal besin elementi kaynakları arasında önemli bir bağlantıyı temsil eder. Agar veya katı materyallerdeki bu dışsal materyal kaynaklarının kontrol edilebilmesi, tarımsal blok tasarımının toprak blok tasarımına göre temel bir avantajıdır. Burada, agro blok mikrokozmlarında çam ile beş ve 15 haftalık inkübasyon sonrası ser crain'lerin odun çürütme derecesinin bir ölçüsü olarak ortalama yüzde ağırlık kaybı gösterilmektedir.

Herhangi bir uygulama yapılmamıştır. %99'dan daha saf alçıya veya %1 demir katkılı alçıya eklenen beş milimolar kalsiyum klorür; her hasat için aynı harf altındaki çubuklar arasında anlamlı bir fark yoktur. Hata çubuklarının standart sapmayı temsil ettiği çalışmada, kontrol grubundaki kahverengi çürümeye uğramış çam bloklarında %60'tan fazla ağırlık kaybı gözlemlenmiş olup bu durum, Amerikan Test ve Malzeme Derneği standardının %50'den fazla çürüme hedefini karşılamaktadır.

16. haftada çürümedeki ortalama varyasyon katsayısı 0,055 idi. Düşük değişkenliğe ek olarak, bir tedavi etkisi gözlemlendi. Kalsiyum ilaveleri, ister agar ortamına kalsiyum klorür şeklinde ister saf alçı olarak eklensin, fungal çürümeyi inhibe etti.

İlginç bir şekilde, alçıya demir eklenmesiyle birlikte bozunma hızları yeniden artmaktadır. Bu durum, bozunmanın 15. haftasında beş tekrarlı örneklem gözlemlendiğinde, kalsiyumun değil demirin kritik olduğunu göstermektedir. Aynı kahverengi çürük test mantarında, dairesel laminlerin miselyum rengi mein'i ortaya çıkarmaktadır.

İşlemler arasındaki dış hif farkları, bloklar çıkarılıp kurutulduktan sonra ortaya çıkmıştır. Kalsiyumsuz işlemde hiflerin eksik olduğu görülmüştür. Saf kalsiyumlu işlemlerde sararma, demir eklenen işlemde ise pas görünümü gözlemlenmiştir.

Kontrol grubu, karşılaştırma için inoküle edilmemiş blokları temsil etmektedir. İlginç bir şekilde, yüksek demir içeren bir ortam kullanıldığında ana etkiler kaybolmaktadır. Toplu olarak değerlendirildiğinde bu durum, fungusun kalsiyumu değil, demiri kullandığını göstermektedir.

Bu materyallerde, aerobik filamentöz funguslar tarafından bitki dokularının biyodegradasyonunu başarıyla test etmek için bir burgu bloğu düzeneğinin nasıl kullanılacağını gösterdik. Bu prosedürü uygularken, substratların, özellikle de bitki dokusunun ve burgunun birbiriyle temas etmemesini sağlamak, burgu ve plaketlerden gelen nem içeriğini minimize etmek ve inkübasyon öncesinde her plakadaki içeriğin kaymadığından emin olmak için iki kez kontrol etmek önemlidir. Bu değişkenleri göz önünde bulundurarak, çürüme ortamını bir toprak bloğu düzeneği kullandığınız zamankinden çok daha iyi kontrol edebilirsiniz.

Araştırma sorularınızı yanıtlamak için gereken istatistiksel güce sahip veriler üretebilirsiniz. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.