İfade ve HEK-293T Hücreler Rekombinant Gerilim Gated İyon Kanalları Elektrofizyolojik Kayıt için optimize edilmiş Transfeksiyon Strateji

Elektrofizyoloji, kültüre edilmiş insan embriyonik böbrek hücrelerindeki rekombinant voltaj kapılı iyon kanallarının aktivitesini incelemek için yaygın olarak kullanılır. Başarılı bir kayıt için, hücrelerin kanalları tespit edilebilecek yeterli seviyelerde hücre membranında eksprese etmesi ve bireysel hücrelerin izole edilebilmesi için hücrelerin yeterince düşük bir hücre yoğunluğunda ekilmesi gerekir. Hücre kayıtlarının gerçekleştirilmesi, genellikle hücre adezyonunun ve membran stabilitesinin kaybolduğu, bu tür bir ekspresyon için gereken 28 °C'deki uzun inkübasyon süreleri nedeniyle sıklıkla engellenmektedir.

Burada, bu sorunları ortadan kaldıran hücre kültürü ve transfeksiyon için optimize edilmiş bir yöntem gösterilmektedir. Hücreler orta düzeyde bir konfluensle transfekte edilir, ardından yeterli iyon kanalı ekspresyonu sağlanana kadar 28 °C'de inkübe edilir. Transfekte edilen hücreler daha sonra düşük yoğunlukta cam lameller üzerine ekilir ve hücre yapışmasını ve membran stabilizasyonunu sağlamak için birkaç saat boyunca 37 °C'de inkübe edilir.

Uygun şekilde ekilen hücreler, ardından birlikte eksprese edilen EGFP ve tüm hücre yama kenetleme (whole cell patch clamp) yöntemi ile tanımlanır. Kayıt gerçekleştirilebilir veya hücreler tekrar 28 °C'de inkübe edilebilir. Kanal yüzey ekspresyonunu daha da artırmak için L CAV one, L CAV two veya L cav three gibi voltaja bağımlı kalsiyum kanalları ile transfekte edilmiş hücrelerde yapılan kayıt deneylerinden elde edilen sonuçlar, kanalların hücreler tarafından başarıyla transfekte edildiğini ve eksprese edildiğini göstermektedir.

Laboratuvarımızda sadece L CAV üç için temsili sonuçlar gösterilmiş olsa da, insan hücre hatlarında patch clamp kaydı için düşük ekspresyon gösteren iyon kanalı genlerinin ekspresyonunu artırmak amacıyla bir yöntem geliştirmiş bulunmaktayız. Mevcut geleneksel yaklaşımda, önce hücreler lameller üzerine yayılır ve iyon kanalı genlerini içeren plazmid cDNA'lar ile transfekte edilir; ardından elektrofizyolojik kayıt öncesinde yüksek verimli iyon kanalı ekspresyonu elde etmek için 28 °C'de birçok gün inkübe edilir. Yeni yaklaşımımız, kayıt öncesinde 28 °C'de gereken inkübasyon süresini önemli ölçüde azaltmaktadır.

Şimdi, 28 °C'lik inkübasyon süresini azaltarak, hücre membranlarının çok daha stabil olduğunu ve transfekte edilen hücrelerin lamellere çok daha iyi tutunduğunu görmekteyiz. Bu durum, kaydedilebilir hücre sayısını artırarak deney sürecini önemli ölçüde daha verimli hale getirir. Transfeksiyondan önce, tam konfluente ulaşmış bir HEK 2 9 3 T hücresi flaskını bir e dört oranında yeni bir 25 cm²'lik flaska bölün ve hücreleri 37 °C, %5 CO2 içeren bir inkübatöre yerleştirin.

Hücrelerin üç ila dört saat boyunca tutunmasını sağlayın; dört saat sonra, tutunmayı doğrulamak için hücreleri diferansiyel girişim kontrastı ile inceleyin. Hücrelerin artık yuvarlak görünmediğini ve yassılaştığını gözlemleyin. Uzantılar veya psödopodlar görünür durumdadır.

Konfluens seviyesi daha düşük olan hücreler benzer görünecek ancak birbirlerinden daha uzak konumlanacaklardır. Hücreler yapıştıktan sonra, standart bir kalsiyum fosfat transfeksiyonu gerçekleştirmek için gerekli reaktifleri birleştirin. Her flask için transfeksiyon solüsyonunun 600 microliters hacminde toplam 12 micrograms DNA hazırlayın.

Burada, çeşitli iyon kanallarından elde edilen cDNA'lar P-I-R-E-S iki EGFP plazmidine klonlanmıştır. Bu ekspresyon vektörünün bir memeli hücre hattına transfeksiyonu, iyon kanalı kodlama dizisinin hemen aşağısında ve EGFP kodlama dizisinin yukarısında yer alan bir iç ribozom giriş bölgesinden başlayan translasyon aracılığıyla, klonlanan ekleme ile aynı mRNA'dan geliştirilmiş yeşil floresan protein üretimi ile sonuçlanır. Bu durum, EGFP proteininin ilgi duyulan proteine doğrudan füzyon edilmesinin neden olabileceği protein fonksiyonu üzerindeki olası girişimler olmadan, pozitif olarak transfekte edilmiş hücrelerin tanımlanmasına olanak tanır.

Transfeksiyon solüsyonunu hücrelerin üzerine damla damla pipetleyin, ardından flaskı nazikçe çalkalayın ve ertesi güne kadar gece boyunca 37 degrees Celsius inkübatöre yerleştirin. Hücreleri floresan mikroskobu altında inceleyerek transfeksiyon verimliliğini kontrol edin. Pozitif transfekte olmuş hücreler, hücrenin tamamında yeşil görünmelidir.

Transfeksiyon doğrulandıktan sonra, ters çevrilmiş flaskın içine dikkatlice dört ila beş mililitre ılık besiyeri pipetleyin. Flaskı yavaşça, hücre yüzeyi aşağıya gelecek şekilde ters çevirip sallayarak yıkama solüsyonunun hücrelerin üzerinde nazikçe hareket etmesini sağlayın ve böylece hücreleri yıkayın. Besiyerini uzaklaştırın ve bu yıkama işlemini tekrarlayın.

İki kez daha adımyla. Ardından balona altı mililitre besiyeri ekleyin ve 37 °C'de iki saat boyunca inkübe edin. Omurgasız iyon kanallarının ekspresyonu bazı zorluklar teşkil etmektedir.

İlk olarak, genellikle büyük boyutlardadırlar ve bu nedenle endoplazmik retikulumda translasyonları uzun sürebilir. Ayrıca, bir memeli hücre hattında hücre membranına verimli bir şekilde yönlendirilemeyebilirler. Son olarak, farklı türler farklı kodon kullanım frekansları sergilediğinden, heterolog cDNA'lar, bu zorlukların bazılarını aşmak için HEK 2 9 3 T gibi memeli hücrelerinde yaygın olmayan kodonların yüksek frekanslarını barındırabilir.

Yıkama ve transfeksiyondan sonra 37 °C'de yapılan iki saatlik inkübasyonun ardından, ekspresyon süresini uzatmak için flaskları iki ila altı gün boyunca 28 °C'lik bir inkübatöre aktarın. İnkübasyon süresi, eksprese edilen her iyon kanalı tipi için ampirik olarak belirlenmelidir. Çünkü 28 °C'de uzun süreli inkübasyon, hücrelerin ayrılmasına ve zayıf membran stabilitesine yol açar.

Elektrofizyolojik çalışmalar gerçekleştirilmeden önce ek hücre hazırlığı gereklidir. İlk olarak, transfekte edilmiş hücrelerdeki besiyerini aspirasyon pipeti ile uzaklaştırın ve ters çevrilmiş bir flask içine 37 °C sıcaklıkta bir mililitre tripsin çözeltisi ekleyin. Ardından, tripsinin hücrelerin üzerinden nazikçe geçmesini sağlamak için flaskı yavaşça hücre yüzeyi aşağıya gelecek şekilde geri getirin.

Balonu tekrar ters çevirin ve tripsini uzaklaştırın. Ardından, hücrelerin üzerine doğrudan 250 µL sıcak tripsin ekleyin ve hücreler ayrılana kadar 37 °C'de üç ila beş dakika inkübe edin. Bu sırada, üç ila sekiz adet poli-L-lizin kaplı lameli 60 mm'lik bir kültür kabına yerleştirin ve beş mL sıcak kültür ortamı ekleyin.

Hücreler ayrıldıktan sonra, yaklaşık altı kez pipetleme yaparak onları dört mililitre ılık besiyerinde süspande edin; ardından, mikropipet ucuyla lamellerin kabın tabanında olduğundan emin olmak için üzerlerine hafifçe bastırın. Daha sonra, resüspande edilmiş hücrelerden 250 ila 500 µL ekleyin. Hücrelerin lamellere yapışmasını sağlamak için 37 °C'de üç saat boyunca inkübe edin.

Hücrelerin 37 derecede çok uzun süre bırakılması, hücre bölünmesine ve transfekte edilen plazmitlerin seyrelmesine neden olacaktır. Transfekte edilen hücreler, burada gösterildiği gibi birbirlerinden izole olacak kadar düşük bir yoğunlukta ekilmelidir. Bu durum, elektrofizyolojik kayıt işlemini kolaylaştıracaktır.

Yardımcı alt birimler gerektiren hücreler için, elektrofizyolojik kayıt öncesinde hücrelerin genellikle 28 °C'ye transfer edilmesi ve ek olarak üç ila dört gün boyunca inkübe edilmesi gerekir. Yardımcı alt birim gerektirmeyen hücreler için ise kayıt, bu inkübasyonun hemen ardından gerçekleştirilebilir.

Burada kullanılan elektrofizyoloji düzeneği; bir amplifikatör, motorlu çift pipet manipülatörleri, epi-floresan mikroskop ve perfüzyon sistemlerini içermektedir. Ekipman, bir titreşim izolasyon masası üzerine monte edilmiştir ve dış elektriksel gürültü, 40 inç yüksekliğinde tip iki Faraday kafesi ile sınırlandırılmıştır. Elektronik kontrol sistemleri, Digidata 1440 ve P clamp 10.1 yazılımı ile birlikte çalışan bir analog-dijital dönüştürücü arayüzüne sahip bir PC'yi kapsamaktadır.

Bilgisayar monitörü amplifikatörü, motorlu manipülatör ve bir valf bağlantılı perfüzyon kontrol sistemi Faraday kafesinin dışına monte edilmiştir. Serbest duran 19 inçlik metal elektrik rafı üzerinde, tüm elektrikli ekipmanlar bakır bir dağıtıcıya topraklanmış ve hat yalıtımı, tutarlı bir toprak hattı ve dalgalanma bastırma sağlayan tıbbi sınıf bir izolasyon trafosuna bağlanmıştır. Kafa aşamasındaki mikro pipet tutucuya, iki ila beş mega ohm dirence sahip, ateşle cilalanmış mikro pipetleri monte ederek deneylere hazırlık yapın.

Patch pipetler iç solüsyonla doldurulur, hava kabarcıklarını gidermek için hafifçe vurulur ve son olarak kafa ünitesine monte edilir. Ardından, pens kullanarak üzerinde hücrelerin bulunduğu bir lamelliği, oda sıcaklığında 3 mL dış kayıt solüsyonu içeren 35 mm'lik plastik bir Petri kabına aktarın. Mikropipet ile kaba bilinen miktarlarda ilaç eklendiği ilaç deneyleri gerçekleştirilirken, kayıt solüsyonunun hacmi doğru şekilde ölçülmelidir; ardından kabı mikroskop tablasına yerleştirin.

Ardından, bir mikro elektrot tutucu yarım hücreyi üç molar sezyum klorür ile doldurun. Daha sonra referans elektrodu yarım hücreye yerleştirin ve mikro manipülatörü kullanarak toprak elektrodu banyoya yerleştirin, patch pipeti banyo çözeltisine indirin. Hücreleri floresan modunda görüntüleyin ve pozitif olarak transfekte edilmiş, aderent, izole bir yeşil hücreyi görüş alanının merkezine getirin.

Banyo modundayken, patch pipeti hücreye iyice yaklaştırın. Bilgisayar ekranında gözlemlenen kare dalga izini sıfırlayın. Patch pipetinin konumunu, hücreye tam olarak değecek ve ekrandaki kare akım izi dalgalanmaya başlayacak şekilde ayarlayın.

Giga ohm sızdırmazlık sağlanana kadar bağlı bir şırınga ile hafif vakum uygulayın. Giga ohm sızdırmazlık elde edildiğinde, programı patch moduna geçirin. Hücre membranını delmek için şırınga ile hızlı bir vakum darbesi uygulayın.

Ardından hücre moduna geçin ve amplifikatörde tüm hücre parametrelerini kullanın. Kapasitif geçici durumu kompanse etmek için, hücre içi kayıt çözeltisinin yamanmış hücreye diyaliz olması amacıyla yamanın dengelenmesi gerekir. Bu deney için yazılan voltaj klembi protokollerini buraya girin.

Deney yapımcısı, hücre membranı boyunca voltaj modüle edildiğinde ortaya çıkan voltaj kapılı iyon kanallarındaki iyon akımlarını ölçmek için bir protokol tasarlamıştır. Bu durumda, yazılımın hücreyi -110 millivolt değerinde tutmasını ve ardından 250 milisaniye boyunca -70 millivolt değerine adım (step) yapmasını belirten bir IV protokolü incelenmektedir. Daha sonra her seferinde adım 10 millivolt artacak şekilde tekrar -110 millivolt tutma potansiyeline geri dönülür; böylece adımlar -70 millivolt, -60 millivolt şeklinde devam eder ve son adım +20 millivolt değerine kadar ulaşır.

Kayıt altına alınan akımları, amplifikatör üzerindeki bir Alçak Geçiren Bessel filtresi kullanarak 10 kilohertz değerinde filtreleyin ve clamp X 10.1 yazılımını kullanarak iki kilohertz örnekleme frekansında dijitalleştirin; yalnızca %10'dan daha az olan minimum sızıntıya sahip kayıtları kullanın. Analiz için, HEK 2 93 T hücreleri kültüre edildi ve burada gösterildiği gibi L Cav. Üç kalsiyum kanalları ile transfekte edildi. Heterolog iyon kanalı CDNAlarının başarılı transfeksiyonu, P-I-R-E-S iki eeg FP vektöründen üretilen floresan ile belirlendi.

Burada, bir omurgasız cav3 voltaj bağımlı kalsiyum kanalının başarılı ekspresyonunu gösteriyoruz. Hücreler transfekte edilmediğinde kalsiyum akımları oluşturulamazken; transfekte edilen hücrelere tüm hücre voltaj klemp protokolleri uygulandığında büyük akımlar meydana gelmektedir.

Deneyciler, gereksinimlerine bağlı olarak çeşitli elektrofizyolojik koşullar ve veri analiz rejimleri kullanabilirler. Bu prosedürü uygularken, deneylerin zamanlaması konusunda kendi muhakemenizi kullanmanızı hatırlatmak önemlidir. Farklı kanallar hücre membranında farklı verimliliklerle eksprese olduğundan, hücrelerin canlılığını artırmak ve ilgilendiğiniz kanalların yüzey ekspresyonunu maksimize etmek için kullanılacak optimal stratejiyi belirlemek size kalmıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, bir insan hücre hattının nasıl kültüre edileceği ve sürdürüleceğinin yanı sıra, elektrofizyolojik kayıtlar için heterolog iyon kanalı cDNA'larının ve alt birim cDNA'larının bu hücrelere nasıl transfekte edileceği konusunda iyi bir anlayış kazandığınızı umuyoruz.