Keten içinde değişiklikler Kalıtsal Çevre İndüklenmiş
26 Ocak 2011
Genom ve fenotipik varyasyon bir alt kümesi içinde genomik değişimi besin stres altında bazı keten çeşitleri Büyüyen. Belirli bir yerinde karmaşık bir ekleme çeşitli besin rejimler altında büyüme ile bu sitede çevresinde gen ekspresyonu değişiklikleri ile ilişkilidir.
Bu prosedürün genel amacı, kalıtsal genomik varyasyonla sonuçlanan koşullar altında indüklenebilir bir keten çeşidinin yetiştirilmesi için bir yöntem göstermektir. Ayrıca, genomik değişiklikler izlenmekte ve indüklenen bitkilerin sonraki nesillerdeki büyümesi çeşitli ortamlar altında gözlemlenmektedir. Bunu başarmak için keten, bir dizi indükleme koşulu altında yetiştirilir.
Ardından, çeşitli ortamlar altında bitkilerin büyüme süreçleri boyunca farklı zamanlarda yaprak ve Maris gövde dokusu toplanır. Sonrasında, doku örneklerinden DNA ve RNA izole edilir. Prosedürün son adımı, farklı çevresel koşullar altında büyümenin sonucunda meydana gelen genomik değişiklikleri ve gen ekspresyonu değişikliklerini belirlemek amacıyla DNA örnekleri kullanılarak PCR ve izole edilen RNA kullanılarak Q-R-T-P-C-R gerçekleştirilmesidir.
Nihayetinde, işlem görmüş bitki dokularından izole edilen nükleik asitlerle gerçekleştirilen PCR ve R-T-P-C-R ile görselleştirildiği üzere, genomun belirli bir noktasında LIS bir insersiyon elementinin ortaya çıkmasıyla büyüme koşullarına verilen genomik yanıt ve bu elementin varlığıyla ilişkili ekspresyon farklarını gösteren sonuçlar elde edilebilir. Merhaba, ben Case Western Reserve Üniversitesi Biyoloji Bölümü'nden Chris Cull. Ben de Cull Laboratuvarı'ndan Cory Johnson.
Ben de Cull laboratuvarından Tiffany Moss. Ben de Cull laboratuvarındaki lisansüstü araştırma yaz programında olan bir lisans öğrencisi Marshall Lucas.
Laboratuvarımızda, büyüme ortamındaki varyasyonlardan kaynaklanan genom ve gen ekspresyonundaki değişiklikleri incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Ketenle indükleyici koşullar altında yetiştirmek için önce beş inçlik saksıları toprakla doldurup sıkıştırarak başlayın.
Sıradaki bitki için saksı başına üç keten tohumu, çeyrek inç derinliğe ekilir. Ardından, indüklemeyen kontrol koşulları için tohumların üzerindeki toprağın durumu ayarlanır. Bitkiler, 100 mililitre 1/10 konsantrasyonundaki Miracle-Gro çözeltisi ile sulanır.
Yüksek besin koşullarındaki bitkileri 100 mililitre tam konsantrasyonlu Miracle grow ile işleme tabi tutun. Son olarak uygulayın.
Düşük besinli bitkilere sadece musluk suyu verin. Bitkiler büyürken, yaz boyunca doğal ışık altında yetiştirin. Tüm bitkileri otomatik bir püskürtme sistemiyle günde iki kez beşer dakika boyunca sulayın.
Büyüme koşullarını bitkilere haftada bir kez uygulayın. Yaprakları ve gövde kısımlarını haftalık aralıklarla toplayın. DNA ekstraksiyonu için altı yaprak ve RNA ekstraksiyonu için üç gövde kısmı toplanır; toplama işleminin ardından bitki materyallerini bir kriyoviyale yerleştirin, sıvı nitrojen ile hızlıca dondurun ve örnekleri ekstraksiyon yapılana kadar -80 °C'de saklayın.
Üç genotip, koşullara bağlı olarak farklı bağıl hızlarda büyür. Kontrol koşulları altında, safketir çeşidi storm veya PL hattı en iyi büyümeyi sergiler. Bu ebeveynden türetilen birkaç hat arasından, büyük veya L çeşidi, küçük veya S çeşidine göre daha güçlüdür.
Bununla birlikte, düşük besin ortamında S, L veya pl'den daha iyi büyür. Yüksek besin koşullarında ise L, pl'den daha iyi büyürken; pl ise S'den sadece biraz daha iyi büyür. Üç farklı işlem altında yetiştirilen her bir hattın karşılaştırılması, PL'nin kontrol koşullarında en iyi şekilde büyüdüğünü göstermektedir. L yüksek besin koşullarında en iyi şekilde büyürken, S hem yüksek besin hem de kontrol koşullarında benzer şekilde büyür.
Bu veriler, üç hattın üç farklı ortamdaki büyümelerine göre ayırt edilebileceğini göstermektedir. PL ve L spesifik ortamlarda daha iyi büyürken, S her üç koşulda da yaklaşık olarak aynı düzeyde büyümektedir. S, iyileştirilmiş besin koşullarından yararlanamamakta ancak çok düşük besin koşullarında daha iyi büyüyebilmektedir.
DNA ekstraksiyonu için Qiagen DNEZ plant DNA prep kitinden gelen AP one tamponunu, steril kum ile birlikte bir mikrosantrifüj tüpündeki altı yaprağa ekleyin; dokuyu, topaklanma görünmeyene kadar mikro havan ile ezin. Kit talimatlarını izleyerek ekstraksiyona devam edin. RNA ekstraksiyonuna başlamak için, bir saklama kriyoviyali içindeki üç maris gövdesini ve çevresindeki bazı yaprakları bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tüpe steril kum ekleyin ve dokuyu, ince bir toz haline gelene kadar mikro havan kullanarak ezin.
Lizisi kolaylaştırmak için örneği 15 saniye boyunca vorteksleyin, ardından kumu ve tüm kalıntıları toplamak için 13,000 RPM'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. SNAT'ı spin kolona ekleyin ve üretici talimatlarına göre RNA hazırlama işlemine devam edin. RNA dokudan ekstrakte edildikten sonra, RNA örnek hacminin onda biri kadar 10 XDNA tamponunu reaksiyona aktarın.
Ve 30 unit DNase ekleyerek, reaksiyonu önce 37 °C'de 30 dakika, ardından 70 °C'de beş dakika inkübe edin. Uygulanan biosystems RNA'dan cDNA kitini kullanarak ters transkripsiyonu gerçekleştirin. Üretici talimatlarına göre, reaksiyonu 37 °C'de bir saat ve ardından 95 °C'de beş dakika inkübe edin.
Son olarak, verimi belirlemek için 5 µL cDNA'yı %1,5 agaroz jelde yürütün. Keten cDNA'sı hazırlandıktan sonra qPCR için kullanılır. qPCR işlemini bir ABI StepOne sistemi kullanarak gerçekleştirin.
Tüm analizleri her çalışma için üç tekrarlı olarak gerçekleştirin ve QPCR reaksiyonlarını hazırlamak için kopya sayısı kontrolü olarak housekeeping geni Acton'u kullanın. Her tüpe uygun primer çiftinden bir mikrolitre ekleyin. CD NA'yı uygun konsantrasyona seyreltin ve her tüpe dokuz mikrolitre ekleyin.
Son olarak, her tüpe 10 µL 2x cyberg green PCR master mix ekleyin. Ardından, amplifikasyon programını kurulumunu gerçekleştirin. Göreceli ekspresyon düzeylerini, step one yazılımındaki varsayılan parametreler tarafından belirlenen ve amplifikasyon eğrilerinin incelenmesiyle onaylanan eşik döngü sayısı üzerinden hesaplayın.
Gövde boyunca çeşitli konumlardaki yapraklardan izole edilen DNA'dan yapılan PCR amplifikasyonu, bitkiler indükleyici koşullar altında yetiştirildiğinde, hat ekleme dizisi veya LIS bir olarak adlandırılan tek kopya 5.7 kilobazlık bir DNA fragmanının ortaya çıktığını göstermektedir. LIS bir, PL düşük besinli indükleyici koşullar altında yetiştirildiğinde ortaya çıkar ve sonunda homozigot hale gelir. Burada, bir ila altı arasındaki yaprak örnekleri haftalık aralıklarla izole edilmiş olup, birinci örnek ekimden sonraki en erken örnektir; ardından örneklerden DNA ekstraksiyonu gerçekleştirilmiştir.
PCR amplifikasyonu, ilk örnek hariç tüm örneklerde LAS one'ın her iki terminusunun da mevcut olduğunu ortaya koymaktadır. Bu durum, insersiye edilmemiş bölgenin ortadan kalkmasıyla ve beşinci yaprak QPCR'ında buna dair herhangi bir kanıt bulunmamasıyla örtüşmektedir. Sonuçlar, LAS one'ın varlığının veya indüksiyonla ilişkili diğer genomik değişikliklerin, LAS one'ın hemen yakınındaki genlerin ekspresyonunu etkilediğini göstermektedir.
Burada gösterilen altı genin tamamı PL ve S'de farklı şekilde eksprese edilmiştir; genlerin dördü, LIS'e sahip olmayan PL'de daha yüksek ekspresyona sahiptir. Aksine, ikisi LIS'e sahip olan S'de daha yüksek ekspresyona sahiptir. Size indüklenebilir keten hatlarının nasıl yetiştirileceğini göstermiş olduk. Böylece genom, büyüme ortamına ve sonraki nesillerin büyüme özelliklerine yanıt olarak değişiklik gösterir.
Bu prosedürü uygularken, değişimlerin tekrarlanabilir bir şekilde indüklenmesi için büyüme koşullarının yeniden oluşturulması gerektiğini hatırlamak önemlidir. İşte hepsi bu. Birçoğunuzun bu fenomen konusunda şüpheleri olduğunu biliyorum, ancak artık gözlemleri kendiniz tekrarlayabilirsiniz.
İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.
Genel Bakış
Bu çalışma, genomik varyasyonu tetiklemek amacıyla keten çeşitlerinin besin stresi altında yetiştirilmesine yönelik bir yöntemi ortaya koymaktadır. Araştırma, keten bitkilerindeki spesifik genomik değişiklikler ile fenotipik yanıtlar arasındaki ilişkiyi vurgulamaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Bitki Genetiği
- Genomik Varyasyon
- Fenotipik Analiz
Arka Plan
- Keten çeşitleri, farklı besin koşulları altında farklı büyüme tepkileri sergiler.
- Genomik varyasyonlar, bitkilerde fenotipik değişikliklere yol açabilir.
- Bu varyasyonların anlaşılması, tarımsal uygulamalara ışık tutabilir.
- Çalışma, LIS one insersiyon elementinin büyüme adaptasyonundaki rolüne odaklanmaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Besin stresinin keten genomik varyasyonu üzerindeki etkilerini araştırmak.
- Nesiller boyunca genomik ve gen ekspresyon değişikliklerini izlemek.
- Farklı koşullar altında büyüme ile ilişkili spesifik genomik elementleri tanımlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Kontrollü besin koşulları altında keten yetiştirme.
- Analiz için yaprak ve gövde doku örnekleri toplama.
- Bitki dokularından DNA ve RNA izolasyonu.
- Genomik ve ekspresyon değişikliklerini değerlendirmek için PCR ve Q-R-T-P-C-R gerçekleştirme.
Ana Sonuçlar
- Farklı besin koşulları altındaki keten çeşitlerinde genomik varyasyon gözlemlendi.
- LIS one insersiyon elementi, büyüme adaptasyonunda temel bir faktör olarak tanımlandı.
- Farklı keten hatları, besinye erişilebilirliğine bağlı olarak değişken büyüme hızları sergiledi.
- Fenotipik tepkiler, spesifik genomik değişikliklerle ilişkilendirildi.
Sonuçlar
- Besin stresi, keten bitkisinde önemli genomik varyasyonlara neden olabilir.
- Bu varyasyonların anlaşılması, ürün dayanıklılığını artırabilir.
- Bulgular, bitki adaptasyon mekanizmaları hakkındaki genel bilgi birikimine katkıda bulunmaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Ketenleme bitkisinde çevresel etkilerle ortaya çıkan kalıtsal genomik değişiklikler, stres koşullarının stabil, kalıtılabilir fenotipik ve moleküler varyasyonları nasıl tetikleyebileceğini anlamak için bir model sunmaktadır. Bu sistem, strese yanıt veren genomik elementlerin ve bunların aktarımının sorgulanmasına olanak tanıyarak, özelliklerin nesiller boyunca stabilitesine yönelik öngörüsel güvenilirliğe katkı sağlar. Bu tür bulgular, adaptif mekanizmalara ve epigenetik kalıtıma odaklanan erken keşif ve translasyonel araştırma süreçleri için stratejik öneme sahiptir.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Fonksiyonel hedef doğrulama için strese bağlı genomik elementlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Çevresel tetikleyicileri kalıtsal genomik değişikliklerle ilişkilendirerek mekanistik risk azaltmayı destekler.
- Kalıtımların aktarımı ve nesiller arası stabilitesine yönelik öngörülebilir güveni kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Belirli koşullar altında genomik ve ekspresyon değişikliklerini izlemek için valide edilmiş bir sistem sağlar.
- İnsersiyon olaylarının ve ilişkili gen ekspresyonunun PCR ve QRT-PCR aracılığıyla tekrarlanabilir şekilde tespit edilmesini sağlar.
- Çevresel strese verilen kalıtsal moleküler yanıtların miktar tayini için analiz standardizasyonunu destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Stresle tetiklenen genomik değişikliklerin keşiften preklinik doğrulamaya kadar olan sürekliliğini incelemek için bir model sunar.
- Moleküler olayları fenotipik sonuçlarla ilişkilendirerek translasyonel biyobelirteç stratejileriyle uyum sağlar.
- Kalıtsal özellik öngörülebilirliğine dayalı olarak riskten arındırılmış geliştirme kararlarına bilgi sağlar.
İş Akışı ve Süreç Entegrasyonu
Bu yöntem, keşiften preklinik aşamaya kadar olan sürece konumlanarak çevresel indüksiyon, mekanik risk azaltma ve özellik aktarımı üzerine hipotezlerin test edilmesine olanak tanır.
- Keşif Biyolojisi: Stres altında genomik değişikliklerin indüklenmesi ve kalıtımı üzerine hipotez testlerini destekler.
- Tarama: İnsersiyon tespiti ve gen ekspresyon profillemesi için tekrarlanabilir, kantitatif PCR tabanlı çıktılar sunar.
- Analitikler: Genotipleri ve çevresel yanıtları karşılaştırmak için ölçülebilir okumalar sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Keşif bulgularını, kalıtsal adaptasyonun preklinik modellerine bağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Diğer sistemlerde çevresel olarak indüklenen kalıtsal değişiklikleri incelemek için yeniden kullanılabilir bir platform kurar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Stresle indüklenen genomik değişikliklerin stabilitesi ve kalıtımı konusundaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Genomik olayların tekrarlanabilir indüksiyonu ve tespiti için protokolleri standartlaştırır.
- Stratejik Değer: Kalıtsal özellik öngörülebilirliğine dayalı, bilinçli devam/durdurma kararlarını mümkün kılar.
- Portföy Etkisi: Adaptif özellik programlarının riskle uyumlu önceliklendirilmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Bitki moleküler biyolojisi ve nükleik asit analizi konusunda uzmanlık gerektirir.
- PCR, QRT-PCR ve örnek saklama altyapısına erişim gereklidir.
- Tekrarlanabilirlik için büyüme koşullarının titizlikle yeniden oluşturulması gerekir.
- Diğer bitki veya model sistemlerinde kullanım için adaptasyon gerektirebilir.
- Hem genomik hem de ekspresyon değişikliklerinin paralel olarak izlenebilme yeteneğine bağlıdır.
