Embriyoid Kuruluşlar Cryosections kullanarak Pluripotent Kök Hücre Analizi
8 Aralık 2010
Pluripotent kök hücreleri süspansiyon büyüyen embriyoid organları (EBS) farklılaşırlar. Agrega olarak organizasyon korurken, embriyogenez hücresel ve moleküler yönlerini çalışmak için yararlıdır, yüksek kaliteli EB cryosections elde etmek için nasıl göstermek.
Birinci Bölüm, Giriş. Merhaba, adım Rafael. Brezilya'daki Rio de Janeiro Federal Üniversitesi'nde Profesör Stevens Hans Laboratuvarı'nda doktora sonrası araştırmacıyım.
Merhaba, benim adım İsmail. Araştırma görevlisiyim ve aynı zamanda profesörüm. Bu videoda, android gövdelerinin şeffaf kesitlerinin nasıl hazırlanacağını göstereceğiz.
Öyleyse başlayalım. İkinci bölüm, materyaller ve ekipmanlar. Bu prosedür için, dondurulmuş numuneler için bir gömme ortamına ihtiyacımız olacak.
Hücrelerin fiksasyonu için %4'lük paraformaldehit çözeltisi, kriyokoruma için sükroz çözeltileri. Hafifçe bükülmüş uçlu bir iğne, EBS'nin daha iyi görüntülenmesi için bir stereo mikroskop ve bir çalkalayıcı. Üçüncü bölüm.
Burada insan embriyo gövdeleri, yapışmayan kültür plaklarında kültüre edilmektedir. Embriyo gövdelerini 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak amacıyla, bir pipet kullanarak hepsini birbirine mümkün olduğunca yakın gruplandırıyoruz. EBS'ler dikkatlice toplanır ve tüpe aktarılır.
Çok fazla materyal bulunmadığı için tüm ebs'lerin toplanması önemlidir. EBS'ler dekante edildikten sonra, kültür medyası dikkatlice atılır. Tüpün altındaki peleti görebiliyor olmanız gerekir. Artık fiksasyon prosedürüne geçebiliriz.
EBS, PBS veya fosfat tamponlu salin içindeki %4'lük paraformaldehit çözeltisinde fikse edilecektir. Peleti PFA çözeltisi ile tekrar süspanse etmek önemlidir. Ardından EBS, fiksasyon çözeltisinde 30 dakika boyunca fikse edilir.
Fiksasyonun ardından, PFA çözeltisi dikkatlice uzaklaştırılır. EBS'lerin kriyokorumasını başlatmak için EBS'lerin süspanse edilmemesine dikkat edilerek, PFA çözeltisi PBS içinde %10 sakkaroz çözeltisi ile değiştirilir ve materyal bu çözeltide 30 dakika bekletilir. Ardından, %10 sakkaroz çözeltisi dikkatlice uzaklaştırılır ve EBS'ler %20 sakkaroz çözeltisi içinde yeniden süspanse edilir.
EBS'ler bu çözeltide tekrar 30 dakika boyunca bekletilir. Son olarak, %20 sükroz çözeltisi uzaklaştırılır ve yerine EBS'lerin 30 dakika daha bekletileceği PBS içerisindeki %30 sükroz çözeltisi eklenir. Artık EBS'lerin yönlendirme ve bloklama aşamalarına geçebiliriz.
Laboratuvarımızda, kalıp olarak boş kapsül kabukları kullanıyoruz. Embriyonik kök hücrelerin (ebs) bloklanması için, ebs'leri toplamadan önce ucun iç duvarlarının sükroz çözeltisi ile kaplanması önemlidir. Artık EBS'leri dikkatlice toplayabilir ve dibe çökmelerini bekleyebiliriz.
Ardından, EBS'ler bloğun merkezine yerleştirilir. Burası, EBS'nin blok içindeki nihai konumu olmalıdır. Bir stereo mikroskop ve ince uçlu bir pipet yardımıyla, mümkün olduğunca fazla sakroz çözeltisi toplanır ve boşaltılır.
Eb'lerin toplanmamasına her zaman dikkat edilir. Ucu hafifçe bükülmüş bir iğne kullanılarak, tüm EBS'ler bloğun merkezine konumlandırılır. Son olarak, kalan sakroz çözeltisi filtre kağıdı parçalarıyla toplanır.
Kaliteli kesitler elde etmek için EBS'nin blok içindeki spesifik konumu çok önemlidir. Burada, kabuk içindeki hatalı EB konumlandırmasına bir örnek verilmiştir. EBS'nin konumlandırılması ve sükroz solüsyonunun uzaklaştırılmasının ardından, Resus'un EBS'yi askıya almamasına her zaman dikkat ederek, kabuk kenarlardan başlanarak OCT ile doldurulur.
Kalan kabarcıklar bir pipet yardımıyla uzaklaştırılır ve kabuklar 15 dakika boyunca çalkalanır. Çalkalama işleminin ardından OCT bloğu kuru buzda dondurulur.
Bu noktada, bloğu daha sonraki analizler için alüminyum folyoya sarılı şekilde -80 °C'de saklayabilir veya kriyostat Bölüm dört, Kesim aşamasına geçebilirsiniz. Kriyoseksiyonları hazırlamak için tek kullanımlık veya kalıcı bir bıçağa, OCT'ye ve poli-L-lizin ile ön işlem görmüş cam lamlara ihtiyacınız olacaktır. OCT bloğu dondurucudan çıkarılır ve -20 °C'ye ulaşana kadar kriyostat içerisinde tutulur.
Ardından blok standa yerleştirilir ve Bıçağın kenarına paralel olarak hizalanır. EB örnekleri diğer çoğu doku örneğinden çok daha küçüktür, bu nedenle materyal kaybını minimize etmek için bloğun tüm yüzeyinin aynı anda bıçağa değdiğinden emin olmak çok önemlidir. Yerleştirme işlemi tamamlandıktan sonra blok 10 mikrometre kalınlığında dilimler halinde kesilir ve bu dilimler doğrudan cam lamlar üzerine toplanır.
Slaytlar, tercihen eksi 70 santigrat derecede saklanabilir veya aynı gün içerisinde kullanılabilir. Materyal, immünohistokimya veya immünofloresan için boyanabilir. Sonuç. Burada açıklanan yöntem, hem insan H nine veya fare US P one kök hücre hatlarından geliştirilen embriyo gövdelerinin ince kriyostat kesitlerini elde etmek için makul ölçüde ucuz ve takip etmesi kolay bir protokol sunmaktadır.
Elde edilen kriyoseksiyonlar, protein ekspresyonunu veya EB morfolojisini analiz etmek amacıyla çok çeşitli prosedürlerde kullanılabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, süspansiyonda büyütülen pluripotent kök hücrelerden türetilen embriyoid gövdelerin (EB'ler) yüksek kaliteli kriyokesitlerinin elde edilme sürecini göstermektedir. Bu kriyokesitler, EB'lerin organizasyonunu korurken embriyogenezin hücresel ve moleküler yönlerinin incelenmesi için gereklidir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kök Hücre Biyolojisi
- Embriyogenez
- Hücresel Diferansiyasyon
Arka Plan
- Pluripotent kök hücreler çeşitli hücre tiplerine farklılaşabilir.
- Embriyoid cisimler, erken embriyonik gelişimi taklit eden agregatlardır.
- EB'lerin incelenmesi, embriyogenez mekanizmalarının anlaşılmasına yardımcı olur.
- Yüksek kaliteli kriyokesitler, ayrıntılı analiz için kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Amacı
- EB'lerin kriyokesitlerinin hazırlanması için bir yöntem sağlamak.
- Diferansiyasyon sırasındaki hücresel ve moleküler süreçlerin incelenmesini kolaylaştırmak.
- Analiz sırasında EB'lerin yapısal organizasyonunu korumak.
Kullanılan Yöntemler
- Süspansiyon kültüründe pluripotent kök hücrelerin hazırlanması.
- Embriyoid cisimlere farklılaşmanın indüklenmesi.
- Yüksek kaliteli örnekler elde etmek için kriyoseksiyon teknikleri.
- EB'lerin hücresel ve moleküler özelliklerinin analizi.
Ana Sonuçlar
- EB'lerden başarılı kriyokesit hazırlama.
- Kriyokesitlerde EB organizasyonunun korunması.
- Embriyogenezin hücresel düzeyde incelenmesine yönelik gelişmiş yetkinlik.
- Gösterilen yöntemin çeşitli araştırma bağlamlarına uygulanabilirliği.
Sonuçlar
- Bu yöntem, EB'lerin ayrıntılı analizine olanak tanır.
- Yüksek kaliteli kriyokesitler, embriyonik çalışmalar için değerlidir.
- Bu yaklaşım, kök hücre farklılaşmasının anlaşılmasına katkı sağlayabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Pluripotent kök hücrelerden türetilen embriyoid cisimlerin (EB'ler) yüksek kaliteli kriyoseksiyonları, diferansiyasyon belirteçlerinin ve doku organizasyonunun hassas mekansal analizine olanak tanıyarak rejeneratif tıp ve gelişimsel biyolojide erken keşif ve hedef doğrulamasını destekler. Bu yetkinlik, kök hücre tabanlı modellerdeki öngörü güvenini artırır ve keşif sürecindeki temel dönüm noktalarında riskle uyumlu kararlar alınmasına yardımcı olur. Güvenilir EB kriyoseksiyonları, portföy ilerlemesi için fonksiyonlar arası veri entegrasyonunu kolaylaştırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Üç boyutlu EB yapıları içerisinde plüripotens ve soy hattına özgü marker ekspresyonunun sorgulanmasına olanak tanır.
- Diferansiyasyon yolaklarını ve hücresel heterojenliği netleştirerek biyolojik risklerin azaltılmasını destekler.
- Kök hücre türevli sistemlerde fonksiyonel hedef validasyonu için uzamsal bağlam sağlar.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Tekrarlanabilir immünofloresan ve in situ hibridizasyon analizleri için standartlaştırılmış EB kriyokesitlerin hazırlanmasını kolaylaştırır.
- EB kesitlerinde protein ve RNA dağılımının kantitatif değerlendirmesine olanak tanır.
- Kök hücre modellerinde bileşik taraması için analiz ölçeklenebilirliğini ve platformun yeniden kullanımını destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla ilgili modelleme için in vitro farklılaşmayı, in vivo gelişimsel süreçlerle uyumlu hale getirir.
- EB mimarisini ve belirteç lokalizasyonunu koruyarak, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar süreklilik sağlar.
- Translasyonel biyobelirteç stratejilerine temel oluşturan mekanistik içgörüler sunar.
İş Akışı ve Boru Hattı Entegrasyonu
Bu kriyoseksiyon yöntemi, erken kök hücre farklılaşma çalışmalarından analiz geliştirme ve preklinik model doğrulamasına kadar uzanan keşif sürekliliğine entegre edilmektedir.
- Keşif Biyolojisi: EB'ler içindeki pluripotens ve soy belirlenmesine ilişkin hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Markör ekspresyonu ve doku organizasyonu için tekrarlanabilir, kantitatif okumalar sağlar.
- Analitik: Diferansiyasyon koşullarının karşılaştırmalı analizi için mekânsal olarak çözümlenmiş ölçümlere olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: Markör ekspresyon paternleri ile desteklendiğinde, in vitro bulguları in vivo gelişimsel uygunluk ile ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla kök hücre hattı ve diferansiyasyon protokolü boyunca uygulanabilir, EB analizi için standartlaştırılmış bir iş akışı oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Kök hücre farklılaşması ve hedef doğrulamadaki öngörü güvenilirliğini artırır.
- Operasyonel Değer: Tekrarlanabilir alt analizler için EB kesit alımını standartlaştırır.
- Stratejik Değer: Güçlü uzamsal ve moleküler veriler sağlayarak devam/dur kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Kök hücre tabanlı keşif programlarının risk ayarlı önceliklendirmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Kriyoseksiyon ve hassas üç boyutlu hücre agregatlarının işlenmesi konusunda uzmanlık gerektirir.
- Kriyostatlara, gömme ortamlarına ve sonraki analizler için görüntüleme altyapısına erişim gereklidir.
- EB hazırlama ve kesit alma protokollerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- EB boyutuna ve morfolojisine dikkat edilerek, çeşitli pluripotent kök hücre hatlarına ve diferansiyasyon modellerine uyarlanabilir.
- Yüksek kaliteli ve yorumlanabilir kesitlerin elde edilmesi için dikkatli bir yönlendirme ve gömme işlemine bağlıdır.
