Çoklu Ölçeklerde Sayısallaştırılmış Nöronal Morfoloji Otomatik Sholl Analizi

Bu video, lokal değişimleri gözlemlemek amacıyla yarı otomatik bir program kullanarak, topluca nöritler olarak bilinen dendrit ve aksonların morfolojisini analiz etme prosedürünü göstermektedir. İlk olarak, nörit segmentlerinin konumunu belirlemek için nöronların sekiz bitlik TIFF görüntülerini izlemek üzere neuron J yazılımı kullanılır. Ardından, nöritler arasındaki bağlantıya ilişkin yapısal bilgileri tanımlamak için Neuron studio yazılımı kullanılır.

Son olarak, hücrelerden sürü analizi ile nörit dallanma noktaları ve nörit uçlarının sayısı dahil olmak üzere morfolojik verileri çıkarmak için bonfire MATLAB programı çalıştırılır. Sonuçlar, nörotik ağacın alt bölgeleri üzerinde yapılan sürü analizine dayanarak nörit morfolojisindeki yerel değişiklikleri göstermektedir. Bu tekniğin, elle yapılan sürü analizi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, programın yarı otomatik olmasıdır; bu durum analiz verimliliğini büyük ölçüde artırır ve analizin doğruluğunun doğrulanabilmesi için verilerin denetlenmesine olanak tanır.

Prosedürü, yaz boyunca Firestein laboratuvarında çalışan AWA lisans öğrencisi Hirsch uygulamalı olarak gösterecektir. Neurite sekiz bitlik tiff dosyalarının morfolojik özelliklerini analiz etmek için bonfire programını kullanabilmek adına, öncelikle bonfire programı indirilmeli ve ardından tekil nöron görüntüleri elde edilmelidir. Program ayarları, analiz etmek istediğiniz görüntülerin çözünürlüğüne göre düzenlenmelidir; bonfire programının bonfire parametreleri bölümünde, picks conversion değişkeni için mevcut olan değeri, görüntülerinizin çözünürlük değeri ile değiştiriniz.

bonfire'ın verileri analiz edebilmesi için dosyaların; bir ana klasör, bonfire MATLAB M dosyalarını içeren bir bonfire klasörü, farklı koşulların her birini içeren alt klasörler ve farklı koşul klasörlerinin içindeki hücre görüntü dosyalarını kapsayan belirli bir yapıda düzenlenmiş olması gerekir. İzleme için görüntüyü hazırlayarak başlayın. Bu deneyde, dendritik morfolojideki değişiklikleri analiz etmek amacıyla yalnızca dendritler izlenecektir. İzleme için görüntüyü hazırlayarak başlayın.

Neuron J araç çubuğundaki aç buttonuna tıklayarak görüntüyü açın ve iz sürmek istediğiniz görüntüyü seçin. Şimdi, tüm nöritleri görselleştirebilmek için görüntünün parlaklığını ve kontrastını ayarlamak amacıyla maximize butonuna tıklayarak görüntüyü yeniden boyutlandırın; ardından neuron J araç çubuğunda image seçeneğini belirleyip adjust brightness contrast seçeneğini seçin. İz sürme işlemine başlamak için neuron J araç çubuğundaki add traces butonuna tıklayın. Hücre gövdesinin çevresi boyunca iz sürün.

Ardından, neuron J araç çubuğundaki label tracings düğmesini seçin ve tracing ID açılır menüsünden N birini seçin, neuron J nitelikler penceresinde type zero six seçeneğini belirleyin ve Tamam'a tıklayın. Neurite izlerini çıkarmaya başlamak için, neuron J araç çubuğundaki add traces düğmesini seçin ve ilgilenilen her bir neurite dalı boyunca bir iz ekleyin. Çizdiğiniz segmentlerin her bir dal noktasında durması ve her bir yan dalın bu noktadan itibaren yeni bir iz olarak başlatılması en uygun yöntemdir.

Neuron J araç çubuğunda save tracings düğmesini seçin ve az önce oluşturduğunuz izlemeyi orijinal görüntü dosyasıyla aynı klasöre kaydedin. Ardından, izleme dosyalarını ve izleme tanımlayıcı dosyalarını Neuron J'den dışa aktarın. Neuron J araç çubuğundaki export trace düğmesini seçin. Şimdi Neuron J dışa aktarma iletişim kutusunda tab delimited text files separate file for each tracings seçeneğini belirleyin ve tamam'a tıklayarak dosya isimlerinin ve kayıt konumunun Neuron J tarafından seçilmesine izin verin.

Neuron J araç çubuğundaki measure tracings düğmesini seçin, ardından Neuron J ölçüm penceresindeki display tracings measurements seçeneğini seçin ve run komutunu çalıştırın. Neuron J izleme penceresinden Select file seçeneğini seçin, ardından save as seçeneğine tıklayarak dosyayı kaydedin. Dosya adı, orijinal görüntü dosyasının adıyla tam olarak eşleşmeli, ardından alt çizgi ve info ifadesi gelmeli ve üç harfli bir dosya uzantısı içermemelidir. Bilgisayarınızın otomatik olarak bir XLS dosya uzantısı eklemediğini kontrol edin.

Eğer öyleyse, dosya uzantısı manuel olarak silinmelidir. Öncelikle, MATLAB'ı açıp komut penceresinin sağ üst köşesindeki üç nokta düğmesine tıklayarak bonfire load ile klasörleri yeniden düzenleyin. Klasör gözatma penceresinde ana klasörünüzdeki bonfire klasörünü seçin, komut penceresine bonfire load yazın ve enter tuşuna basın.

Klasör gözatma penceresinden analiz etmek istediğiniz koşul klasörünü seçin ve Tamam'a tıklayın. Bu işlem, her bir hücreye ait tüm verileri içeren hücre alt klasörleri oluşturarak klasör yapısını yeniden düzenleyecektir. Şimdi, dosya adı_premium swc dosyalarını oluşturmak için komut penceresine bonfire_NDF2sWC yazın ve enter tuşuna basın.

Klasör gözatma penceresinde, bonfire yüklemesi ile az önce yeniden düzenlenen aynı koşul klasörünü seçin ve Tamam'a tıklayın. Bu işlem, seçilen koşul için her hücre klasöründe bir WC dosyası oluşturacaktır. Her hücre klasörü beş dosya içerecektir.

Orijinal TIF görüntüsü, NDF dosyası, alt çizgi bilgi dosyası, iz tanımlayıcı dosyası, bir TXT dosyası ve bir swc dosyası. Neuron Studio'yu kullanmaya başlamadan önce, programın özelliklerini ve kısayollarını öğrenmenizi öneririz. Programın mükemmel bir çevrimiçi kullanıcı kılavuzu bulunmaktadır ve klavye kısayollarını bilmek size büyük ölçüde zaman kazandıracaktır.

Başlamak için Neuron Studio programını açın ve Neuron Studio araç çubuğundaki "file open" (dosya aç) seçeneğine tıklayarak düzenlemek istediğiniz nörona ait TIF görüntüsünü bulup açın. "Run settings" (çalıştırma ayarları) kısmını seçin ve üç kutucuğun her birine birer değer girin.

Voksel boyutu penceresinde, dosya içe aktarma s wc seçeneğini belirleyin. Çalışmak istediğiniz dosyayla eşleşen uygun s WC dosyasını seçin. Görüntü dosyası, izleme görüntüsü ile üst üste gelecektir.

Hücre soması, nöritleri birbirine bağlamak için kırmızı bir daire ile örtülmelidir. Sarı düğümlerle temsil edilen her dallanma noktasının yalnızca iki dal oluşturabilmesi için düğümleri birleştirmek üzere nörit aracını kullanın. Tüm izler soma ile sürekli olmalıdır.

Neuron Studio'dan verileri dışa aktarmak için dosya (file) menüsünden nöritleri kaydet (save neurites) seçeneğini belirleyin ve swc dosyalarındaki hataları kontrol etmek için varsayılan isimle kaydedin; ardından bonfire trace komutunu yazın. Komut penceresine girip enter tuşuna basın. Klasör gözatma (browse for folder) penceresinde, az önce işlenen verileri içeren koşul klasörünü seçin ve klasördeki görüntülerden herhangi birinde hata varsa tamam (okay) düğmesine basın.

Program, dot S WC dosyalarından morfolojik verileri çıkarmak için hatanın nerede olduğunu gösteren görüntüler oluşturacaktır. Komut penceresine bonfire yazın ve enter tuşuna basın. Klasör gözatma penceresinde analiz etmek istediğiniz koşul klasörünü seçin ve ilgilenilen nöronların her biri için tamam'ı seçin.

Bonfire analizi, analizde kullanılan omuz halkalarıyla birlikte nöronal morfolojinin bir grafiğini oluşturacaktır. Ek olarak, bonfire komutu, analizden elde edilen tüm morfolojik bilgileri içeren MAT dosyasını oluşturacaktır. Veri tipinin ön grafiklerini görüntülemek için MATLAB komut penceresine bonfire sonuçlarını girin, klasör gözatma penceresinden görüntülemek istediğiniz durum için durum klasörünü seçin ve Tamam'a tıklayın.

Klasör gözat penceresi geçici olarak kapanacak ve ek koşulların seçilmesine izin verecek şekilde yeniden açılacaktır. Koşullar seçildikten sonra, seçim işleminden çıkmak için iptal'i seçin. Bonfire sonucu, morfolojik verileri Excel'e aktarmak için seçtiğiniz koşul klasörlerinden gelen verileri içeren özet grafikler döndürecektir; bunun için MATLAB komut penceresine bonfire Export yazın.

Klasör seçme penceresinde dışa aktarmak istediğiniz verileri içeren koşul klasörünü seçin ve Tamam'a tıklayın; bonfire dışa aktarma işlemi morfolojik verilerin Excel dosyalarını oluşturacak ve bunları seçilen koşul klasörüne yerleştirecektir. Şimdi size, bonfire programı tarafından iki koşul içeren bir veri seti üzerinden oluşturulan verilere dair bir örnek göstereceğiz.

Bunlar her iki koşulun örnek ters çevrilmiş görüntüleridir. Bu görüntülerden, birinci koşulun ikinci koşula göre daha fazla dendrit içerdiği görülebilir. Bu fenomen, bonfire programı tarafından oluşturulan çeşitli grafiklerde de gözlemlenebilir.

Bonfire programı analizlerini dendritlerin alt bölgeleri üzerinde gerçekleştirdiği için, birinci durumdaki artmış dendritler kolayca tespit edilebilmektedir; toplam dendritik ağacın Sholl eğrisinin çizilmesi, birinci durum nöronları için hücre gövdesinden daha distalde daha fazla dendrit olduğunu göstermektedir; hücre başına ortalama dallanma noktası ve uç nokta sayısının çizilmesi, birinci durumun ikinci duruma göre hem daha fazla dallanma noktasına hem de daha fazla uç noktaya sahip olduğunu göstermektedir. Birincil, ikincil, üçüncül veya daha yüksek dereceli dendritler için hücre başına ortalama uzantı sayısı gösterilmiştir. Birinci durum için daha fazla üçüncül ve daha yüksek dereceli dendrit bulunmaktadır; kök, ara ve uç dendritler için hücre başına ortalama uzantı sayısının çizilmesi, birinci durumun ikinci duruma göre daha fazla ara veya uç uzantıya sahip olduğunu göstermektedir.

Burada, segmentlerin birincil, ikincil veya üçüncül ya da daha üst grup olarak sınıflandırıldığı segment kimliğine özgü shoal analiz eğrileri gösterilmiştir. Birinci durum nöronları için üçüncül dendritlerdeki artış, hücre gövdesinin distal kısmında gerçekleşmektedir. Segmentlerin kök segmentler, ara segmentler veya terminal segmentler olarak gruplandırıldığı segment kimliğine özgü shoal analiz eğrileri gösterilmiştir.

Birinci durumdaki ara ve uç dendritlerdeki artış, hücre gövdesinin distalinde meydana gelir. Bu videoyu izledikten sonra, nöromorfolojideki yerel değişiklikleri gözlemlemek amacıyla bonfire programını kullanarak shoal analizinin nasıl yapılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.